液相色譜-線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜測(cè)定蜂膠中9種黃酮類物質(zhì)

趙曉亞，王華偉，王 鵬，付曉芳，李 晶，尚吟竹，葉 誠，鄭茜玥

(1.湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，湖北武漢 430050；2.武漢市洪山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，湖北武漢 430070)

蜂膠為“工蜂采集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠粘性物質(zhì)”[1]，它是一種有粘性的膠狀物質(zhì)，具有芳香，味苦，低溫下變硬、變脆。蜂膠具有復(fù)雜而獨(dú)特的化學(xué)組成，其中已被鑒定的有七十多種黃酮類化合物，五十多種芳香酸及芳香酸酯類化合物，二十多種酚類、醇類化合物，十多種醛與酮類化合物，十余種萜類化合物以及五十多種脂肪酸和脂肪酸脂，有鈣、硒、鋅、鐵等三十多種人體必需的微量元素和二十多種氨基酸；還有多種糖類、甾類、酶類、維生素、烯、烴和其它具有生物學(xué)活性的有機(jī)化合物[2 - 7]。

目前，蜂膠中黃酮類化合物的分析方法主要有分光光度法[8]、液相色譜法[9 - 12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]。線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱(LTQ Orbitrap)高分辨質(zhì)譜是把線性離子阱多級(jí)質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜相結(jié)合的雜交型質(zhì)譜儀，具有多種工作模式，可提供詳細(xì)、高質(zhì)量的質(zhì)譜信息，能夠?qū)Ρ粶y(cè)化合物的結(jié)構(gòu)做更全面的描述，提高了對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中被測(cè)化合物結(jié)構(gòu)的確證能力。本文采用液相色譜-LTQ Orbitrap高分辨質(zhì)譜，研究并建立了蜂膠樣品中楊梅酮、喬松素、芹菜素、苛因、山奈素、高良姜素、槲皮素、蘆丁、桑黃素9種黃酮類化合物的測(cè)定及確證方法。研究結(jié)果表明，該方法對(duì)除楊梅外的8種黃酮類化合物的線性范圍為0.5～50 μg/mL,楊梅酮的線性范圍為1.0～5.0 μg/mL，其相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99，在625、1 250和2 500 mg/kg 3添加水平的回收率為78.7%93.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.10～12.65%，該方法用于實(shí)際樣品分析，獲得滿意結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要儀器與試劑

帶自動(dòng)進(jìn)樣器的Finnigan Surveyor液相色譜系統(tǒng)以及Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL組合式高分辨質(zhì)譜儀(美國，Thermo Scientific)；Milli-Q超純水器(美國，Millipore)；KQ-600B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS2型漩渦振蕩器(德國，IKA)；AB204-S型電子天平(美國，METTLER TOLEDO)。

標(biāo)準(zhǔn)品：楊梅酮(Myricetin,CAS 529-44-2) 購自CNW公司,喬松素(Pinocembrin,CAS 480-39-7)和芹菜素(Apigenin,CAS 520-36-5) 購自上海安譜公司，苛因(Chrysin,CAS 480-40-0) 購自TRC公司,山奈素(Kaempferol,CAS 520-18-3)購自國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，高良姜素(Galangin,CAS 548-83-4)、槲皮素(Quercetin,CAS 117-39-5)、蘆丁(Rutin,CAS 153-18-4) 購自中國藥品生物制品檢定所，桑黃素(Morin,CAS 480-16-0)購自Chromadex公司。標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取楊梅酮、喬松素、芹菜素、苛因、山奈素、高良姜素、槲皮素、蘆丁、桑黃素標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，分別置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別移取適量的上述儲(chǔ)備液到一系列10 mL容量瓶中，用0.1%的乙酸-乙腈溶液(20∶80,V/V)定容，配制成一系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。甲醇、乙腈、無水乙醇均為色譜純(德國Merck)，乙酸為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

實(shí)驗(yàn)的蜂膠原料購自于湖北的蜂農(nóng)。

1.2 樣品制備及處理

蜂膠樣品于冰箱中-10 ℃左右冷凍過夜，取出后立即攪碎混勻。在室溫下，準(zhǔn)確稱取蜂膠樣品0.2 g于25 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入20 mL無水乙醇，溫度45 ℃ 超聲使樣品完全溶解后，用無水乙醇定容。過0.22 μm濾膜，供儀器測(cè)定。

1.3 儀器條件

1.3.1液相色譜條件Waters xselect HSS T3柱(100×3.0 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：(A)0.1%乙酸溶液，(B)乙腈；梯度洗脫程序?yàn)椋?～15 min，15%～99%B，15～16 min，99%～15%B，16～25 min，15%B；流速 0.2 mL/min；柱溫20 ℃；進(jìn)樣量 5 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件質(zhì)量分析器為FT Orbitrap；正離子模式掃描(ESI+)；質(zhì)量范圍:m/z100～1 000；分辨率:60 000；噴霧電壓:4.5 kV；管狀透鏡電壓:80 V，鞘氣(N2)壓力:241.15 kPa，輔助氣(N2)流量:1.98 L/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8 - 13]，蜂膠的提取基本上都采用甲醇、一定比例的乙醇或無水乙醇。在本研究中，試驗(yàn)了甲醇和乙醇作為提取溶劑的提取效率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇作為提取溶劑時(shí)，樣品溶解要比乙醇作為提取溶劑時(shí)難一些，而且無水乙醇毒性小，因此選用無水乙醇作為提取溶劑。

2.2 儀器分析條件的優(yōu)化

分別試驗(yàn)了10 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)溶液-甲醇)、0.1%乙酸溶液-乙腈和0.1%乙酸溶液-甲醇為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)表明，流動(dòng)相中含乙腈時(shí)比甲醇的分離效果好，而且在0.1%乙酸溶液-乙腈流動(dòng)相體系中9種被測(cè)物分離良好，峰形尖銳，沒有拖尾。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了0.1%乙酸溶液-乙腈流動(dòng)相體系的梯度洗脫條件。發(fā)現(xiàn)乙腈的比例對(duì)槲皮素和桑黃素的分離影響很大，在本文的流動(dòng)相梯度條件下，這兩種物質(zhì)能達(dá)到完全分離。

質(zhì)譜方面優(yōu)化了鞘氣電壓和輔助氣電壓，使被測(cè)物的響應(yīng)高。用ToxID篩選軟件建立化合物的分子式數(shù)據(jù)庫信息表，并指定離子加合物類型和數(shù)量，這里設(shè)定正離子模式下可能存在的H+、Na+兩種離子?；衔锖Y選的離子提取窗口寬度為3 ppm。結(jié)果顯示9種目標(biāo)化合物的加氫正離子形式被檢測(cè)到，通過二級(jí)碎片離子的設(shè)定，增加檢測(cè)的準(zhǔn)確性，方法分離度好，靈敏度高。由于蘆丁H+的二級(jí)碎片離子較少，Na+離子的二級(jí)碎片離子信息豐富，故蘆丁進(jìn)行二級(jí)碰撞時(shí)是對(duì)Na+進(jìn)行CID。表1給出了9種被測(cè)物的精確分子離子及其碰撞能量為40 eV時(shí)CID裂解模式下的特征二級(jí)碎片離子。圖1給出了標(biāo)準(zhǔn)溶液40 eV時(shí)CID裂解模式下的二級(jí)碰撞譜圖。

表1 母離子及碎片離子

2.3 線性關(guān)系

分別配制濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所建立的分析方法進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)組分的峰面積(y)對(duì)相應(yīng)的進(jìn)樣濃度(x,μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各化合物的線性回歸方程，9種黃酮類化合物的質(zhì)量濃度均與峰面積呈線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99，見表2。圖2給出了提取精確[M+H]+離子譜圖。對(duì)相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在同1 d內(nèi)的不同時(shí)間進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，目標(biāo)化合物峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～2.0%；對(duì)相同標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 d內(nèi)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，目標(biāo)化合物峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～2.5%，質(zhì)量偏差小于3 ppm，說明采用LTQ-Orbitrap組合式高分辨質(zhì)譜測(cè)定具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

表2 9種化合物L(fēng)TQ Orbitrap分析的線性回歸方程和線性范圍

2.4 回收率與精密度試驗(yàn)

稱取經(jīng)測(cè)定含量穩(wěn)定的蜂膠試樣0.200 g，平行18份，分別加入高、中、低三種濃度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，充分混勻，按照本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果中扣除試樣的含量，回收率與精密度結(jié)果見表3。

表3 樣品的回收率與精密度(n=6)

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用所建立的方法，對(duì)實(shí)際的蜂膠樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果在被檢測(cè)的蜂膠樣品中蘆丁和楊梅酮未檢測(cè)到。9種黃酮化合物在蜂膠中的具體含量見表4。

表4 9種黃酮化合物在實(shí)際樣品中的含量

3 結(jié)論

本文將線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道肼(LTQ-Orbitrap)高分辨質(zhì)譜技術(shù)引入蜂膠鑒別檢測(cè)，在進(jìn)行母離子準(zhǔn)確定性定量的同時(shí)，增加高分辨的二級(jí)質(zhì)譜，有利于排除干擾，增加定性準(zhǔn)確性。該方法具有準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，可用于日常蜂膠中楊梅酮、松屬素、芹菜素、苛因、山奈酚、高良姜素、槲皮素、蘆丁、桑黃素9種黃酮類物質(zhì)的定性及定量檢測(cè)。