核黃素在電化學(xué)還原石墨烯/Nafion修飾電極上的電化學(xué)行為及分析檢測(cè)

馬 琦，李 坤，張素芳，宋金萍,，郭 永，董 川

(1.山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，應(yīng)用化學(xué)研究所，山西大同 037009;2.山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究所，山西太原 030006)

核黃素又稱(chēng)維生素B2，它是異咯嗪的一種衍生物，在生物體內(nèi)通過(guò)與三磷酸腺苷(ATP)反應(yīng)生成腺嘌呤二核苷酸(FAD)，從而參與生物體內(nèi)的重要代謝活動(dòng)[1]。當(dāng)體內(nèi)核黃素缺乏時(shí)，將造成機(jī)體代謝障礙，產(chǎn)生口角炎、唇炎、舌炎、結(jié)膜炎及陰囊炎等炎癥，因而高效靈敏的檢測(cè)體內(nèi)的核黃素對(duì)于疾病的預(yù)防和監(jiān)測(cè)具有重要的意義。目前，常用于檢測(cè)核黃素的手段主要包括：紫外-可見(jiàn)分光光度法[2]、熒光法[3]、高效液相色譜法[4]及電化學(xué)法[5]。其中，電化學(xué)方法因高靈敏性、操作方便、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)已受到研究人員的廣泛關(guān)注。例如，唐平等[6]研究了核黃素在裸金電極及分子自組裝膜電極上的電化學(xué)行為，檢出限可達(dá)10-7mol數(shù)量級(jí)。同時(shí)一些研究結(jié)果已經(jīng)顯示：納米材料的引入會(huì)極好地提高核黃素檢測(cè)的靈敏度。例如Fe2O3/MWCNTs/AuNPs復(fù)合材料可以檢測(cè)nmol數(shù)量級(jí)的核黃素[7]。

作為繼富勒烯和碳納米管之后的另一個(gè)新型碳材料，石墨烯因其優(yōu)良的電子傳輸性能、超大比表面積、高機(jī)械強(qiáng)度等特性已吸引了廣大研究者的關(guān)注，并在電催化領(lǐng)域中顯示了其獨(dú)特的魅力。孫紅力等[8]采用水合肼還原氧化石墨烯的方法制得石墨烯材料，隨后用石墨烯/Nafion膜修飾電極測(cè)定了核黃素，但檢出限只能達(dá)到1.0×10-6mol·L-1。倪永年等[9]利用聚脫氧腺苷酸將石墨烯固定在金電極表面，其對(duì)核黃素檢測(cè)的檢出限可達(dá)1.5×10-8mol·L-1。本文主要研究電化學(xué)還原石墨烯和Nafion復(fù)合材料修飾的玻碳電極上核黃素的電化學(xué)性質(zhì)。與水合肼還原石墨烯相比[8]，電化學(xué)還原石墨烯能夠極大增強(qiáng)核黃素的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)，使分析檢出能力提高。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

電化學(xué)測(cè)量在CHI660 E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)上進(jìn)行，以玻碳電極(直徑為3 mm)為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑柱電極為對(duì)電極組成三電極系統(tǒng)。

石墨粉購(gòu)自Alfa Aesar，采用Hummers方法[10]制備氧化石墨烯(GO)，用水分散成1 mg/mL懸浮液備用。5%Nafion乙醇溶液購(gòu)自Fluka。核黃素、維生素B1、維生素B6、煙酸、煙酰胺、尿酸、維生素C、色氨酸、多巴胺等均購(gòu)自阿拉丁試劑公司，使用時(shí)配成1.0×10-3mol·L-1的儲(chǔ)備液并保存于暗處。其它試劑均購(gòu)自北京化工廠。所用試劑均為分析純，使用前未被純化。實(shí)驗(yàn)用水皆為二次蒸餾水。

1.2 修飾電極的制備

玻碳電極在使用前依次用粒徑為1.0、0.3、0.05 μm 的Al2O3水糊打磨成鏡面，經(jīng)超聲波清洗，再經(jīng)乙醇洗滌后，備用。準(zhǔn)確移取2 mL 500 μg/mL GO水溶液，加入200 μL 5%Nafion乙醇溶液，超聲分散5 min，得GO/Nafion修飾液。用微量進(jìn)樣器均勻滴加6 μL上述GO/Nafion修飾液于預(yù)處理過(guò)的玻碳電極表面，用紅外燈烤干得GO/Nafion修飾電極。把修飾好的電極放到pH=5.0的HAc-NaAc緩沖溶液中，在-1.0～1.0 V之間循環(huán)掃描5圈，即得電化學(xué)還原石墨烯(ECGO)/Nafion修飾電極，備用。

1.3 電化學(xué)測(cè)量

將核黃素用pH=5.0的HAc-NaAc 緩沖溶液稀釋至所需濃度，以裸玻碳電極或修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極及鉑柱對(duì)電極組成三電極系統(tǒng)，在-1.0～1.0 V電位范圍內(nèi)，50 mV·s-1掃描速度下記錄循環(huán)伏安曲線(xiàn)。差示脈沖伏安曲線(xiàn)掃描范圍為-1.0～0 V，靜置時(shí)間180 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 核黃素在不同電極上的循環(huán)伏安行為

圖1顯示了1.0×10-4mol·L-1核黃素在裸玻碳電極、GO/Nafion和ECGO/Nafion修飾電極上的循環(huán)伏安行為。結(jié)果表明，核黃素在裸玻碳電極上的電化學(xué)信號(hào)較弱，但在GO/Nafion修飾電極上電信號(hào)明顯改善，其中還原峰電流增大更加明顯。將GO/Nafion修飾電極在HAc-NaAc(pH=5.0) 緩沖溶液中掃描5圈后，GO被部分還原成ECGO，核黃素在ECGO/Nafion修飾電極上分別在Epa=-301 mV(Epc=-394 mV) 處出現(xiàn)一對(duì)氧化還原峰，且氧化還原峰電流明顯強(qiáng)于GO/Nafion修飾電極，這說(shuō)明GO經(jīng)電化學(xué)作用后，所得ECGO對(duì)核黃素的電催化能力更強(qiáng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1緩沖溶液的選擇圖2顯示了核黃素在Na2HPO4-NaH2PO4(pH=7.0) 緩沖溶液和HAc-NaAc(pH=5.0) 緩沖溶液中的循環(huán)伏安行為。結(jié)果顯示：核黃素在以上兩種底液中均顯示出相應(yīng)的氧化還原峰，其中在HAc-NaAc緩沖溶液中峰形較好，峰電流較強(qiáng)，而在Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液中，峰電流明顯較低，且峰形不對(duì)稱(chēng)，故隨后的實(shí)驗(yàn)均選擇HAc-NaAc緩沖溶液作為底液。

2.2.2修飾劑用量的選擇進(jìn)一步考察了GO/Nafion修飾液用量對(duì)電化學(xué)信號(hào)的影響。結(jié)果顯示，隨著GO/Nafion修飾液用量的不斷增加，陽(yáng)極峰電流明顯增大，當(dāng)修飾液體積為6 μL時(shí)，陽(yáng)極峰電流達(dá)最大，隨后隨著修飾液用量的不斷增加，陽(yáng)極峰電流有所降低。故隨后所有實(shí)驗(yàn)都選用6 μL修飾液進(jìn)行修飾。

2.2.3還原圈數(shù)的影響眾所周知，在較負(fù)的起始電位下，氧化石墨烯或石墨烯上未被還原的含氧官能團(tuán)易被活化甚至還原，且隨著掃描圈數(shù)的增加，還原程度越徹底。為此我們考察了電化學(xué)還原圈數(shù)的影響，結(jié)果顯示：在HAc-NaAc緩沖溶液(pH=5.0)中，當(dāng)掃描圈數(shù)為5圈時(shí)，氧化還原峰電流均達(dá)到最大，繼續(xù)增加掃描圈數(shù)，峰電流反而有所減小。根據(jù)文獻(xiàn)，氧化石墨烯上的羰基很容易被還原，然而羥基及環(huán)氧基則相對(duì)較為穩(wěn)定，只有在更負(fù)的電位下(-1.5 V)才能被徹底還原[11]。因此在-1.0～1.0 V掃描范圍內(nèi)，氧化石墨烯的還原并不是很徹底，殘留的羥基及環(huán)氧基很容易與核黃素分子中的多個(gè)羥基形成氫鍵，使核黃素更容易到達(dá)電極表面，顯示增強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)。

2.2.4pH的影響圖3顯示了核黃素在不同pH值的HAc-NaAc緩沖溶液中，陽(yáng)極峰電流值與pH的關(guān)系曲線(xiàn)。由圖可知，隨著pH值的增大，陽(yáng)極峰電流逐漸增強(qiáng)，在pH=5.0時(shí)達(dá)最大，隨后pH值繼續(xù)增大，峰電流反而減小，故隨后的實(shí)驗(yàn)均以pH=5.0的0.2 mol·L-1HAc-NaAc緩沖溶液作為底液。

2.2.5初始電位的影響圖4顯示了在不同電位范圍內(nèi)掃描的循環(huán)伏安曲線(xiàn)。結(jié)果顯示：隨著初始電位的不斷降低，峰電流逐漸增加，同時(shí)氧化峰電位發(fā)生一定程度的正移，還原峰電位發(fā)生一定程度的負(fù)移，當(dāng)掃描范圍是-1.0～0.8 V時(shí)，峰電流達(dá)最大，隨后峰電流有所降低。因此，在隨后進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，都選-1.0～0.8 V。

2.2.6靜態(tài)時(shí)間的影響以HAc-NaAc緩沖溶液作為支持電解質(zhì)，用差分脈沖伏安法(DPV)對(duì)最佳靜態(tài)時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，當(dāng)靜態(tài)時(shí)間為180 s時(shí)，峰電流值達(dá)最大，隨后趨于穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)選擇靜態(tài)時(shí)間為180 s。

2.3 線(xiàn)性范圍及電極性能

圖5顯示了不同濃度的核黃素在最佳條件下的DPV曲線(xiàn)，可以看出核黃素的陽(yáng)極峰電流與其濃度在一定范圍成正比關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：線(xiàn)性范圍為：7.5×10-8～1.0×10-5mol·L-1，其線(xiàn)性方程為：ip=7.2126c+1.7037×10-5(r=0.9947)。檢出限(S/N=3)可達(dá)2.5×10-8mol·L-1。

平行制作5支修飾電極，對(duì)1.0×10-5mol·L-1的核黃素溶液進(jìn)行平行測(cè)定，峰電流相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=5)為4.7%。此外，ECGO/Nafion修飾電極在干燥環(huán)境中放置3 d，修飾電極的催化性能仍為原來(lái)的96.3%。這些結(jié)果表明：ECGO/Nafion修飾電極具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.4 干擾研究

實(shí)驗(yàn)考察了常見(jiàn)的幾種干擾物質(zhì)對(duì)核黃素測(cè)定的干擾，結(jié)果顯示：50倍的維生素B1、維生素B6、煙酸、煙酰胺、尿酸、維生素C、色氨酸、多巴胺對(duì)核黃素的檢測(cè)幾乎不干擾。而人體常見(jiàn)的金屬離子如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe3+對(duì)核黃素的檢測(cè)基本沒(méi)有影響。

2.5 實(shí)際樣品分析

取市售維生素B2片(海南制藥廠有限公司)進(jìn)行實(shí)際樣品含量測(cè)定。樣品預(yù)處理過(guò)程如下：取20片藥片，稱(chēng)重，研磨成粉末，備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取一片劑量的粉末，用二次蒸餾水超聲溶解，定容至50 mL，靜置1 d后備用。取400 μL黃色上層液，用11.6 mL HAc-NaAc(0.2 mol/L，pH=5.0) 緩沖溶液稀釋?zhuān)谧罴褜?shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算核黃素含量，同時(shí)與藥典所描述的紫外-可見(jiàn)方法進(jìn)行對(duì)比，具體結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，該測(cè)定方法所得結(jié)果與藥典法檢測(cè)結(jié)果很接近，表明該方法是精確可行的，可以用于實(shí)際樣品中核黃素含量的測(cè)定。

表1 實(shí)際藥片中核黃素含量的測(cè)定(n=3)

3 結(jié)論

本文利用電化學(xué)還原石墨烯/Nafion修飾電極研究了核黃素的電化學(xué)行為，發(fā)展了一種檢測(cè)核黃素的電化學(xué)傳感器。該傳感器具有較高的靈敏度，檢測(cè)限可達(dá)2.5×10-8mol·L-1，在實(shí)際樣品分析中，與藥典法所得檢測(cè)結(jié)果很接近，可用于實(shí)際樣品中核黃素含量的測(cè)定。