• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    16S rDNA-RFLP分析不同產(chǎn)地人參內(nèi)生菌的多態(tài)性*

    2015-02-18 07:08:56基金項(xiàng)目江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目2012A034
    關(guān)鍵詞:許氏西洋參內(nèi)生

    *基金項(xiàng)目:江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2012A034)。

    16S rDNA-RFLP分析不同產(chǎn)地人參內(nèi)生菌的多態(tài)性*

    *基金項(xiàng)目:江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2012A034)。

    ★萬(wàn)紅嬌謝燕飛謝斌朱金華馬廣強(qiáng)*(江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院南昌 330004)

    摘要:目的:采用16S rDNA—RFLP方法分析比較不同產(chǎn)地、品種人參內(nèi)生菌的差異,為探討人參內(nèi)生菌對(duì)其藥材的影響奠定基礎(chǔ)。方法:收集不同產(chǎn)地、不同品種人參,用細(xì)菌基因提取試劑盒提取人參內(nèi)生菌基因組,擴(kuò)增內(nèi)生菌16S rDNA片段后,用RFLP(限制性酶切片段分析)方法分析不同產(chǎn)地、不同品種人參內(nèi)生菌的多態(tài)性。結(jié)果:不同產(chǎn)地、不同品種人參均含有內(nèi)生細(xì)菌,且內(nèi)生細(xì)菌菌種組成有明顯差異。結(jié)論:不同產(chǎn)地的人參有不同的人參內(nèi)生菌,通過(guò)鑒定內(nèi)生菌可鑒定人參的產(chǎn)地。

    關(guān)鍵詞:人參;16S rDNA;RFLP;內(nèi)生菌

    植物內(nèi)生菌(endophyte) 是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部、不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物。植物內(nèi)生菌包括內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌(內(nèi)生細(xì)菌包括內(nèi)生放線菌) ,可從經(jīng)過(guò)嚴(yán)格表面消毒的植物組織或植物組織內(nèi)部分離得到[1]。內(nèi)生菌在植物體內(nèi)廣泛存在,大量研究表明,一方面,植物內(nèi)生菌的組成與植物生長(zhǎng)的產(chǎn)地環(huán)境具有密切相關(guān)性,在一定的生境下,植物根部的內(nèi)生菌較為穩(wěn)定;另一方面,內(nèi)生菌與寄主植物的生長(zhǎng)和生理往往具有密切的關(guān)系,無(wú)疑會(huì)對(duì)寄主植物的特性產(chǎn)生影響。因而植物內(nèi)生菌對(duì)藥用植物的生長(zhǎng)、藥材質(zhì)量的影響從20世紀(jì)90年代起逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)[2]。而,限制性酶切片段分析(RFLP)作為一種生物研究方法,已廣泛應(yīng)用于基因的多態(tài)性分析和不同環(huán)境中微生物菌的多態(tài)性分析[7-10]。人參(Panax ginseng)由于其生產(chǎn)資源有限、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高、價(jià)格昂貴,故市場(chǎng)上以次充好,以假亂真的現(xiàn)象很多[3-4],藥材經(jīng)營(yíng)商家、制藥企業(yè)及社會(huì)公眾對(duì)人參的真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別有著普遍的需求。作為中藥材傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法,需要豐富的鑒定經(jīng)驗(yàn)[4],現(xiàn)代的利用HPLC、GC等手段的化學(xué)成分鑒別方法[5-6],則對(duì)儀器設(shè)備有較高的要求,在應(yīng)用上有一定的局限性。作為以根入藥的人參,開(kāi)展其內(nèi)生菌的研究對(duì)于人參的鑒別和質(zhì)量控制無(wú)疑具有重要的意義。為此,本實(shí)驗(yàn)采用PCR擴(kuò)增16S rDNA,RFLP分子標(biāo)記方法對(duì)不同產(chǎn)地、品種人參內(nèi)生細(xì)菌的多態(tài)性、特定產(chǎn)區(qū)和品種人參特有的RFLP片段,對(duì)不同產(chǎn)地、品種的人參內(nèi)生細(xì)菌的多樣性進(jìn)行分析,初步研究植物內(nèi)生菌在道地藥材藥性形成過(guò)程中的影響。

    1材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)材料各種人參(美國(guó)野生西洋參,美國(guó)許氏種植西洋參,吉林種植西洋參,加拿大種植西洋參,西洋參)以及不同種類的參類(白參,南沙參,北沙參,黨參,丹參)(均購(gòu)自南昌市黃慶仁棧橋大藥房);胡蘿卜(購(gòu)于菜市場(chǎng))。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,普通DNA產(chǎn)物膠純化試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司);限制性內(nèi)切酶Hha I,Rsa I ,Hinf I(Promaga),2×Taq PCRMasterMix(天根生化科技有限公司),擴(kuò)增引物為通用引物UFPL (5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3') ,URPL (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'),擴(kuò)增長(zhǎng)度為1484 bp(上海生物工程有限公司合成)。

    1.2實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1人參的處理將人參3 g用無(wú)菌水洗凈后,置于99%乙醇 溶液中浸泡1 min,然后置于3.125%的次氯酸鈉溶液中浸泡6min,再置于99%乙醇溶液中浸泡30 s,最后用無(wú)菌水沖洗5次。樣品用無(wú)菌吸水紙吸干后備用。吸取50 μL最后一次洗滌水涂布在NA平板上,置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d,作為空白對(duì)照組。將處理過(guò)的樣品剪碎,取1 g置于含10 mL無(wú)菌水的試管中,28 ℃條件培養(yǎng)2~3d。

    1.2.2植物內(nèi)生菌總DNA的提取取細(xì)菌培養(yǎng)液,搖勻后取1.5 mL于無(wú)菌離心管中離心(10000 r/min,4 ℃)2 min 后,用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA。

    1.2.3植物內(nèi)生菌16S rDNA的擴(kuò)增及檢測(cè) 擴(kuò)增體系為20 μL,其中引物各1 μL,2×Taq PCRMasterMix 10 μL,DNA模板4 μL,雙蒸水4 μL。擴(kuò)增條件為95℃ 0.5 min,55 ℃ 0.5 min,72 ℃ 1.5 min,共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)后PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

    1.2.4限制性內(nèi)切酶酶切分別用限制性內(nèi)切酶Hha I,Rsa I , Hinf I對(duì)16S rDNA產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定。酶切體系為雙蒸水12.3 μL,C Buffer 2 μL,BSA 0.5 μL,內(nèi)切酶0.5 μL,DNA,5 μL,共20 μL體系。

    2結(jié)果

    2.116S rDNA -PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果如圖1所示:結(jié)果表明西洋參內(nèi)生菌中均能檢測(cè)到細(xì)菌的16S rDNA,證明人參中存在有內(nèi)生細(xì)菌。

    1.DL15000;2.美國(guó)野生西洋參;3.美國(guó)許氏種植西洋參;4.吉林種植西洋參;5.加拿大種植西洋參;6.長(zhǎng)春種植西洋參;7.不知產(chǎn)地西洋參;8.空白對(duì)照

    圖116S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

    2.2RFLP鑒定不同產(chǎn)地西洋參內(nèi)生細(xì)菌的差異2.2.1不同產(chǎn)地西洋參Hha I酶切鑒定不同西洋參內(nèi)生菌的總16S rDNA Hha I酶切結(jié)果(圖2)顯示,不同產(chǎn)地西洋參的16S rDNA-RFLP條帶有部分相同;但是美國(guó)野生西洋參/許氏種植西洋參/吉林種植西洋參/加拿大種植西洋參和長(zhǎng)春種植西洋參的酶切條帶明顯不同。

    1.DL2000;2.美國(guó)野生西洋參;3.美國(guó)許氏種植西洋參;4.吉林種植西洋參;5.加拿大種植西洋參;6.長(zhǎng)春種植西洋參;7.不知產(chǎn)地西洋參

    圖2不同西洋參內(nèi)生菌總16S rDNA Hha I酶切結(jié)果

    2.2.2不同產(chǎn)地西洋參RsaI酶切鑒定不同西洋參內(nèi)生菌的總16S rDNARsa I酶切結(jié)果(圖3),其中美國(guó)野生西洋參/許氏種植西洋參/吉林種植西洋參/加拿大種植西洋參和長(zhǎng)春種植西洋參的酶切條帶存在顯著差異,幾乎無(wú)共有條帶。

    1.DL2000;2.美國(guó)野生西洋參;3.美國(guó)許氏種植西洋參;4.吉林種植西洋參;5.加拿大種植西洋參;6.長(zhǎng)春種植西洋參;

    圖3不同西洋參內(nèi)生菌總16S rDNARsa I酶切結(jié)果

    2.2.3不同產(chǎn)地西洋參Hinf I酶切鑒定不同產(chǎn)地西洋參內(nèi)生菌的總16S rDNA Hinf I酶切結(jié)果(圖4)表明,其中美國(guó)野生西洋參/許氏種植西洋參/吉林種植西洋參/加拿大種植西洋參和長(zhǎng)春種植西洋參的酶切條帶明顯不同。Hinf I限制性內(nèi)切酶酶切16S rDNA帯型豐富。

    1.DL2000;2.美國(guó)野生西洋參;3.美國(guó)許氏種植西洋參;4.吉林種植西洋參;5.加拿大種植西洋參;6.長(zhǎng)春種植西洋參;7.不知產(chǎn)地西洋參

    圖4不同西洋參內(nèi)生菌總16S rDNA Hinf I酶切結(jié)果

    2.3酶切鑒定不同人參種類內(nèi)生細(xì)菌的差異

    2.3.1不同人參種類Hha I酶切鑒定不同人參內(nèi)生菌的總16S rDNA Hha I酶切結(jié)果(圖5)。其中西洋參/白參/沙參/黨參/胡蘿卜/丹參的酶切條帶明顯不同。沙參和胡蘿卜內(nèi)生菌16S rDNA被完全切成小片段。

    2.3.2不同人參種類Rsa I酶切鑒定不同人參內(nèi)生菌的總16S rDNARsa I酶切結(jié)果(圖6)。其中西洋參/白參/黨參/丹參的酶切條帶明顯不同。沙參和胡蘿卜內(nèi)生菌16S rDNA完全被降解。

    2.2.3不同人參種類Hinf I酶切鑒定不同人參內(nèi)生菌的總16S rDNA Hinf I酶切結(jié)果(圖7),其中西洋參/白參/黨參/丹參的酶切條帶明顯不同。沙參和胡蘿卜內(nèi)生菌16S rDNA被完全降解。

    1.DL2000;2.西洋參;3.白參;4.沙參;5.黨參;6.胡蘿卜;7.丹參

    圖5不同人參內(nèi)生菌總16S rDNA Hha I酶切結(jié)果

    1.DL2000;2.西洋參;3.白參;4.沙參;5.黨參;6.胡蘿卜;7.丹參

    圖6不同人參內(nèi)生菌總16S rDNA Rsa I酶切結(jié)果

    1.DL2000;2.西洋參;3.白參;4.沙參;5.黨參;6.胡蘿卜;7.丹參

    圖7不同人參內(nèi)生菌總16S rDNA Hinf I酶切結(jié)果

    3討論

    近年來(lái),研究者已從紅豆杉、桃兒七、雷公藤、長(zhǎng)春花、青蒿、薄荷、杜仲和美登木等多種藥用植物分離到了大量?jī)?nèi)生菌。藥用植物內(nèi)生菌與宿主植物之間存在復(fù)雜的微生態(tài)關(guān)系。兩者互相進(jìn)行物質(zhì)、能量及基因交流,在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了互惠共生關(guān)系[1-11]。對(duì)于生長(zhǎng)在不同生境中的中藥材,由于所處生態(tài)環(huán)境的差異以及藥材原植物自身所產(chǎn)生的遺傳變異(居群、品系或品種),其結(jié)果可能導(dǎo)致內(nèi)生菌種群結(jié)構(gòu)在道地藥材與非道地藥材之間存在較大差異。由于不同內(nèi)生菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物種類一般不同,因此這種種群結(jié)構(gòu)的差異會(huì)產(chǎn)生功能多樣性,不同的內(nèi)生菌種群以各自不同的方式影響著藥材性狀、生長(zhǎng)以及有效成分的積累等,最終導(dǎo)致道地藥材與非道地藥材品質(zhì)的差異[1-2,11-13]。

    本實(shí)驗(yàn)通過(guò)16S rDNA PCR方法擴(kuò)增人參植物內(nèi)生細(xì)菌基因,不同產(chǎn)區(qū)、不同品種的人參都擴(kuò)增出16S rDNA 片段,說(shuō)明植物內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于不同品種人參內(nèi)。通過(guò)對(duì)16S rDNA PCR產(chǎn)物RFLP分析發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地、不同品種的人參的植物內(nèi)生菌的種類有明顯差異,不同產(chǎn)地的同種植物的內(nèi)生菌也有很大的差異性。提示,人參內(nèi)生菌的特征條帶可能具有人參產(chǎn)地和品種的鑒別價(jià)值,可應(yīng)用于建立人參簡(jiǎn)便、快速的微生物學(xué)鑒定方法;同時(shí),進(jìn)一步結(jié)合對(duì)不同產(chǎn)地、品種人參的質(zhì)量評(píng)價(jià)分析,探討其質(zhì)量與內(nèi)生菌特征條帶的相關(guān)性,可為人參生產(chǎn)區(qū)劃、質(zhì)量控制提供新的科學(xué)依據(jù)。

    參考文獻(xiàn)

    [1]鄒文欣, 譚仁祥.植物內(nèi)生菌研究新進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào),2001, 43(9):881-892.

    [2]賈栗, 陳疏影, 翟永功,等.近年國(guó)內(nèi)外植物內(nèi)生菌產(chǎn)生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 中草藥,2007, 38(11):1 750-1 754.

    [3]曉洪.人參質(zhì)量鑒定與食用方法[J]. 農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備,2008,(1):57.

    [4]帥緋.刺人參的生藥鑒定研究[J]. 中草藥,2001, 32(6):554-555.

    [5]賴天兵, 陳波, 潘振球, 等. 高效液相色譜法用于保健食品中人參原料鑒定[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2004, 11(5):1 004-1 005.

    [6]馮傳平, 黃鵬, 王效山.人參的分子生物學(xué)鑒定概況[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2004, 18(4):62-64.

    [7]閆愛(ài)民, 陳文新. 三個(gè)根瘤菌新亞群的16S rDNA-RFLP分析[J]. 高技術(shù)通訊,1998, 8(9):50-54.

    [8]原亞萍, 陳孝, 肖世和, 等.應(yīng)用基因組原位雜交及RFLP標(biāo)記鑒定小麥中的大麥染色體[J]. 遺傳學(xué)報(bào), 2000, 27(12):1 080-1 083.

    [9]程海鷹, 肖生科, 馬光東, 等.營(yíng)養(yǎng)注入后油藏微生物群落16S rRNA基因的T-RFLP對(duì)比分析[J]. 石油勘探與開(kāi)發(fā),2006, 33(3):356-359, 373.

    [10]馬玉紅, 馬志杰. RFLP和PCR-RFLP標(biāo)記與牦牛遺傳育種研究[J]. 中國(guó)牛業(yè)科學(xué),2006, 32(5):48-51.

    [11]姜怡, 楊穎, 陳華紅, 等.植物內(nèi)生菌資源[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2005, 32(6):146-147.

    [12]江曙, 錢(qián)大瑋, 段金廒, 等.植物內(nèi)生菌與道地藥材的相關(guān)性研究[J]. 中草藥,2008, 39(8):1 268-1 272.

    [13]江曙, 陳代杰, 陶金華, 等.植物內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物的藥學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生化藥物雜志,2008, 29(6):424-426.

    Analysis the Differences of Endophyte Bacterias in Panxiginsengs by 16S rDNA -RFLP Method

    WAN Hong-jiao, XIE Yan-fei,XIE Bin ,ZHU Jin-hua ,MA Guang-qiang

    JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicnie,Nanchang330004,China;

    Abstract:Objective:In this study, method of 16S Rdna-RFLP were used to detect the differences of the endophyte in Panxginseng. Methods: PCR were used to amplify the 16S rDNA of endophyte bacterias in Panxginseng, then the products of PCR were digested by single enzyme. Results: there Were obvious differences in the endophyte bacterias in different kinds of Panxginsengs. Conclusion: It is possible to identify the producing region of Panxginsengs by detecting the special bacterias in its endophte.

    Key words:Panxginseng; 16S rDNA; RFLP;Endophyte

    收稿日期:(2014-10-13)編輯:曾文雪

    中圖分類號(hào):Q93

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    通信作者:*馬廣強(qiáng)(1977—),男,博士。研究方向:病原微生物學(xué)。Tel:1877005061,E-mail:maguangqiang@163.com.。

    猜你喜歡
    許氏西洋參內(nèi)生
    水溫變化對(duì)近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖中許氏平鲉攝食及生長(zhǎng)的影響
    “參”得人心的文登西洋參
    金橋(2020年7期)2020-08-13 03:07:02
    植物內(nèi)生菌在植物病害中的生物防治
    益氣養(yǎng)陰西洋參
    內(nèi)生微生物和其在作物管理中的潛在應(yīng)用
    “黨建+”激活鄉(xiāng)村發(fā)展內(nèi)生動(dòng)力
    授人以漁 激活脫貧內(nèi)生動(dòng)力
    西洋參的前世 今生
    名醫(yī)妙用單方治好胃下垂
    許氏平鲉早期異速生長(zhǎng)模式的研究
    丰满饥渴人妻一区二区三| 18禁观看日本| 免费在线观看完整版高清| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久影院123| 老司机影院成人| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| av在线老鸭窝| 欧美激情极品国产一区二区三区| 午夜精品久久久久久毛片777| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品久久久精品久久久| videos熟女内射| 国产精品九九99| 国产熟女午夜一区二区三区| 天堂8中文在线网| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产不卡av网站在线观看| 国产成人精品无人区| 两人在一起打扑克的视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久精品国产a三级三级三级| 91精品三级在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品免费大片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| videos熟女内射| 亚洲人成77777在线视频| 最黄视频免费看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 人妻 亚洲 视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 成人三级做爰电影| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产精品 欧美亚洲| 欧美激情久久久久久爽电影 | 免费观看人在逋| 国产麻豆69| 丁香六月欧美| 精品人妻1区二区| 视频区欧美日本亚洲| 在线观看免费午夜福利视频| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲 国产 在线| 国产一区二区激情短视频 | 国产在线观看jvid| 久久久久久久久久久久大奶| 久久国产精品人妻蜜桃| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲av美国av| 精品熟女少妇八av免费久了| 我的亚洲天堂| 成年av动漫网址| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 免费在线观看黄色视频的| 一区二区三区四区激情视频| 午夜免费成人在线视频| 国产免费现黄频在线看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲欧美清纯卡通| 精品亚洲成国产av| cao死你这个sao货| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一区二区三区激情视频| 亚洲精品一二三| 欧美日韩成人在线一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产高清视频在线播放一区 | 热99国产精品久久久久久7| 波多野结衣av一区二区av| 性色av乱码一区二区三区2| 精品久久蜜臀av无| 欧美日韩av久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 另类亚洲欧美激情| 久9热在线精品视频| 欧美大码av| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品免费大片| 欧美成人午夜精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 精品国产一区二区久久| 国产免费视频播放在线视频| 老熟女久久久| 天天添夜夜摸| 十分钟在线观看高清视频www| 又黄又粗又硬又大视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美另类一区| 亚洲全国av大片| 免费高清在线观看日韩| 爱豆传媒免费全集在线观看| 老司机亚洲免费影院| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 精品福利永久在线观看| 国产一区二区 视频在线| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 日韩视频一区二区在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲精品在线美女| 国产男女超爽视频在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产在视频线精品| 午夜福利一区二区在线看| 又大又爽又粗| 午夜日韩欧美国产| 少妇精品久久久久久久| 久久久久国内视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产av精品麻豆| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 曰老女人黄片| 蜜桃在线观看..| 久久九九热精品免费| 免费在线观看日本一区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 美女大奶头黄色视频| 欧美国产精品一级二级三级| 18禁观看日本| 亚洲国产欧美一区二区综合| 淫妇啪啪啪对白视频 | 亚洲人成电影观看| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲第一av免费看| 麻豆国产av国片精品| 在线观看免费高清a一片| 97在线人人人人妻| 亚洲人成电影观看| 一本久久精品| 久久九九热精品免费| 我的亚洲天堂| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲九九香蕉| 高清在线国产一区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 黄频高清免费视频| 色视频在线一区二区三区| 黄色 视频免费看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产在线观看jvid| 久久九九热精品免费| 99国产精品99久久久久| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 大片免费播放器 马上看| 国产精品久久久av美女十八| 国产熟女午夜一区二区三区| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 午夜久久久在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 视频区欧美日本亚洲| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 五月天丁香电影| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲免费av在线视频| 欧美精品亚洲一区二区| 黄色视频,在线免费观看| 多毛熟女@视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 在线看a的网站| 久久综合国产亚洲精品| 国产又爽黄色视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 午夜成年电影在线免费观看| 韩国精品一区二区三区| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| a级片在线免费高清观看视频| 国产国语露脸激情在线看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲成人国产一区在线观看| 中文字幕色久视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产免费福利视频在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 美女午夜性视频免费| 久久九九热精品免费| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久久视频综合| 亚洲全国av大片| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 精品少妇内射三级| 人妻一区二区av| 69精品国产乱码久久久| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产伦人伦偷精品视频| 91精品国产国语对白视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 桃红色精品国产亚洲av| 中文字幕精品免费在线观看视频| 捣出白浆h1v1| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 一区福利在线观看| 男人操女人黄网站| 午夜福利视频精品| 免费少妇av软件| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 高潮久久久久久久久久久不卡| 丁香六月天网| 日本一区二区免费在线视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲性夜色夜夜综合| 91大片在线观看| 在线观看人妻少妇| 亚洲人成电影观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 黄片播放在线免费| h视频一区二区三区| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲成人免费电影在线观看| av网站免费在线观看视频| av在线播放精品| 国产又爽黄色视频| 亚洲国产av影院在线观看| 精品福利观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 久久天堂一区二区三区四区| 成人国语在线视频| 好男人电影高清在线观看| 人成视频在线观看免费观看| xxxhd国产人妻xxx| 久久中文看片网| 亚洲国产av新网站| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 色94色欧美一区二区| av天堂久久9| 国产在线观看jvid| 操美女的视频在线观看| 蜜桃国产av成人99| 1024视频免费在线观看| 在线观看舔阴道视频| 欧美黑人精品巨大| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 成人av一区二区三区在线看 | 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 美国免费a级毛片| 国产欧美日韩一区二区三 | 久久久久久久国产电影| 久久九九热精品免费| 成年人午夜在线观看视频| videosex国产| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美黑人精品巨大| 老司机福利观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日韩中文字幕欧美一区二区| 中亚洲国语对白在线视频| 人妻人人澡人人爽人人| 午夜福利免费观看在线| 一级毛片精品| 欧美日本中文国产一区发布| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 成年女人毛片免费观看观看9 | 在线观看免费高清a一片| 亚洲精品一二三| 婷婷丁香在线五月| 欧美av亚洲av综合av国产av| 老司机午夜十八禁免费视频| 在线观看www视频免费| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲欧美一区二区三区久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久久精品94久久精品| 欧美黑人精品巨大| 一级片'在线观看视频| www.自偷自拍.com| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲中文字幕日韩| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美成狂野欧美在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 真人做人爱边吃奶动态| av有码第一页| 黄色毛片三级朝国网站| 黄色视频不卡| 国产av国产精品国产| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产日韩欧美在线精品| 成年女人毛片免费观看观看9 | 99久久99久久久精品蜜桃| 宅男免费午夜| av天堂久久9| 欧美黑人精品巨大| 多毛熟女@视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 悠悠久久av| 中国美女看黄片| 岛国在线观看网站| 大型av网站在线播放| 欧美乱码精品一区二区三区| 俄罗斯特黄特色一大片| av电影中文网址| 久久女婷五月综合色啪小说| 99久久综合免费| www.av在线官网国产| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲,欧美精品.| 高清在线国产一区| 欧美午夜高清在线| 久久影院123| 两个人免费观看高清视频| 777米奇影视久久| 97在线人人人人妻| 亚洲免费av在线视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产麻豆69| 亚洲专区中文字幕在线| 一进一出抽搐动态| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲全国av大片| 久久香蕉激情| 亚洲全国av大片| 美女主播在线视频| 亚洲专区中文字幕在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 成年av动漫网址| 亚洲人成电影免费在线| 三上悠亚av全集在线观看| 麻豆国产av国片精品| 999久久久精品免费观看国产| a在线观看视频网站| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 免费观看av网站的网址| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 91大片在线观看| 欧美午夜高清在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 色视频在线一区二区三区| kizo精华| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产日韩欧美在线精品| 国产激情久久老熟女| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美97在线视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久香蕉激情| 韩国精品一区二区三区| 国产97色在线日韩免费| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 老司机午夜福利在线观看视频 | 国产精品国产av在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 宅男免费午夜| 久久99热这里只频精品6学生| 在线精品无人区一区二区三| 脱女人内裤的视频| 90打野战视频偷拍视频| 在线观看舔阴道视频| 最近中文字幕2019免费版| 搡老熟女国产l中国老女人| 俄罗斯特黄特色一大片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 一级片免费观看大全| 国产精品1区2区在线观看. | 国产在线视频一区二区| 日日爽夜夜爽网站| 成在线人永久免费视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品九九99| 欧美大码av| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 久久女婷五月综合色啪小说| 我要看黄色一级片免费的| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产麻豆69| 亚洲少妇的诱惑av| 人妻久久中文字幕网| 午夜福利乱码中文字幕| 久久热在线av| 亚洲中文av在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 91成年电影在线观看| 中文字幕高清在线视频| 黄频高清免费视频| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲一区二区三区欧美精品| 蜜桃国产av成人99| 国产麻豆69| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲综合色网址| 两个人免费观看高清视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 1024香蕉在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 国产在线免费精品| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲精品第二区| 久久精品亚洲av国产电影网| 另类精品久久| 国产极品粉嫩免费观看在线| 一个人免费看片子| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲,欧美精品.| av在线播放精品| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 免费人妻精品一区二区三区视频| 12—13女人毛片做爰片一| 三级毛片av免费| 国产野战对白在线观看| 多毛熟女@视频| 午夜福利,免费看| 欧美久久黑人一区二区| 色94色欧美一区二区| 高清欧美精品videossex| 交换朋友夫妻互换小说| 另类精品久久| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美在线黄色| 久久久精品94久久精品| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产免费一区二区三区四区乱码| 69av精品久久久久久 | 深夜精品福利| 国精品久久久久久国模美| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产亚洲精品一区二区www | 男女免费视频国产| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一本大道久久a久久精品| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久久精品区二区三区| bbb黄色大片| 精品亚洲成国产av| 精品一区在线观看国产| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 午夜日韩欧美国产| 精品福利永久在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产成人精品无人区| 国产日韩欧美视频二区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 日韩视频在线欧美| 久久久久久久久免费视频了| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲av片天天在线观看| 国产成人精品无人区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 美女午夜性视频免费| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 色94色欧美一区二区| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 国产成人免费无遮挡视频| 免费观看av网站的网址| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产黄色免费在线视频| 动漫黄色视频在线观看| av片东京热男人的天堂| 亚洲欧美色中文字幕在线| 成人影院久久| 国产精品一区二区在线观看99| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久青草综合色| 99精国产麻豆久久婷婷| 又紧又爽又黄一区二区| 国产成人av教育| 天天影视国产精品| 中国国产av一级| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美激情久久久久久爽电影 | 一级毛片精品| 在线看a的网站| 丰满饥渴人妻一区二区三| 最黄视频免费看| 欧美成人午夜精品| 99久久精品国产亚洲精品| 两个人免费观看高清视频| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久久久久免费高清国产稀缺| 精品久久久久久电影网| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 老司机午夜十八禁免费视频| 久久久精品免费免费高清| 日日夜夜操网爽| 久久女婷五月综合色啪小说| 一二三四在线观看免费中文在| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产xxxxx性猛交| 色视频在线一区二区三区| 日韩欧美免费精品| 性色av一级| 99久久国产精品久久久| 国产av一区二区精品久久| 脱女人内裤的视频| 永久免费av网站大全| 12—13女人毛片做爰片一| av又黄又爽大尺度在线免费看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 丰满少妇做爰视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲伊人色综图| 伦理电影免费视频| 大陆偷拍与自拍| 国产日韩欧美视频二区| 最新在线观看一区二区三区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品久久久久成人av| 十八禁人妻一区二区| 涩涩av久久男人的天堂| 两个人看的免费小视频| 日韩欧美免费精品| 欧美日韩黄片免| 久久久久视频综合| 国产欧美日韩精品亚洲av| www日本在线高清视频| 国产av又大| 亚洲第一av免费看| av国产精品久久久久影院| 男女下面插进去视频免费观看| 婷婷色av中文字幕| 亚洲国产欧美在线一区| 国产欧美亚洲国产| 水蜜桃什么品种好| 黄色片一级片一级黄色片| 国产av一区二区精品久久| 亚洲国产欧美网| 麻豆av在线久日| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产黄色免费在线视频| 丁香六月天网| 久久久久久久精品精品| 欧美xxⅹ黑人| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 夫妻午夜视频| 大陆偷拍与自拍| 性色av一级| 欧美一级毛片孕妇| 五月开心婷婷网| 久久久久国产精品人妻一区二区| av片东京热男人的天堂| 男女床上黄色一级片免费看| 久久久久网色| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久欧美国产精品| av电影中文网址| 国产欧美日韩一区二区精品| av欧美777| 精品卡一卡二卡四卡免费| 一区二区三区精品91| 免费少妇av软件| 黄色毛片三级朝国网站| 国产黄色免费在线视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产免费福利视频在线观看| 成年av动漫网址| 91大片在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 自线自在国产av| 久久影院123| 满18在线观看网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久影院123| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲全国av大片| 青春草亚洲视频在线观看| 男女免费视频国产| 嫩草影视91久久| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 欧美97在线视频| 国产成人免费无遮挡视频| 最新的欧美精品一区二区| 一个人免费看片子| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产精品免费大片| 亚洲性夜色夜夜综合| 老司机靠b影院| 伦理电影免费视频| 国产免费福利视频在线观看| 嫩草影视91久久| 淫妇啪啪啪对白视频 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久香蕉激情| kizo精华| 色老头精品视频在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 国产一区二区三区综合在线观看|