• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    DNA條形碼技術(shù)鑒定中國(guó)地方雞品種的重新評(píng)估

    2016-10-14 14:25:53黃勛和陳潔波何丹林張細(xì)權(quán)鐘福生
    關(guān)鍵詞:三黃雞雞種條形碼

    黃勛和,陳潔波,何丹林,張細(xì)權(quán),鐘福生

    ?

    DNA條形碼技術(shù)鑒定中國(guó)地方雞品種的重新評(píng)估

    黃勛和1,陳潔波1,何丹林2,張細(xì)權(quán)2,鐘福生1

    (1嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,廣東梅州 514015;2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,廣州 510642)

    【目的】探討COI基因作為標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼技術(shù)鑒定外形差異較小的地方雞品種的可行性?!痉椒ā恳匀A南地區(qū)9種優(yōu)質(zhì)地方雞(懷鄉(xiāng)雞、清遠(yuǎn)麻雞、惠陽(yáng)胡須雞、中山沙欄雞、陽(yáng)山雞、杏花雞、五華三黃雞、文昌雞和廣西三黃雞)和國(guó)外引進(jìn)品種隱性白羽雞為試驗(yàn)材料,測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼技術(shù)的線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶亞基I (cytochromeoxidase subunit I,COI),同時(shí)下載已發(fā)表的31條家雞和原雞及綠頭鴨的COI基因序列,分析品種遺傳多樣性與遺傳距離,構(gòu)建單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖和系統(tǒng)發(fā)生鄰接樹,界定區(qū)分品種特異的單倍型。【結(jié)果】除去PCR引物序列,獲得了695 bp COI基因片段。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼序列,截取648 bp 線粒體COI基因序列進(jìn)行分析。10個(gè)雞品種203個(gè)個(gè)體共檢測(cè)到110個(gè)變異位點(diǎn),占分析位點(diǎn)的16.98%,其中90個(gè)單一位點(diǎn)突變,20個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。平均核苷酸多樣性為0.00394(0.00349—0.00560),平均單倍型多樣性為0.832(0.763—0.905),其中五華三黃雞最高,中山沙欄雞次之,文昌雞最低。定義了84種單倍型,單倍型1為9個(gè)地方雞種所共享,出現(xiàn)頻率為64次;單倍型9和5為家雞和隱性白羽雞共享,出現(xiàn)頻率分別為29次和19次;每個(gè)雞品種均有品種特異的單倍型。廣西三黃雞、五華三黃雞與中山沙欄雞的單倍型數(shù)最多,為13個(gè),隱性白羽雞與清遠(yuǎn)麻雞的最少,為8個(gè)。不同品種的單倍型分布差異較大,如杏花雞的單倍型主要分布在1,清遠(yuǎn)麻雞主要分布在1和9,惠陽(yáng)胡須雞主要分布在1、5和9,隱性白羽雞主要分布在9和79。10個(gè)雞種品種間遺傳距離范圍為0.003—0.006,凈遺傳距離為0—0.003;雞品種間的遺傳距離一般大于雞品種內(nèi)的遺傳距離;綠頭鴨與雞品種間的遺傳距離大于0.2。中介網(wǎng)絡(luò)圖將84個(gè)單倍型分為3條進(jìn)化枝,呈現(xiàn)出一定的品種特異性,如以單倍型9為起點(diǎn)的進(jìn)化枝沒有廣西三黃雞和文昌雞分布,但另外兩枝未表現(xiàn)出此特征;1為祖先單倍型,由此逐漸衍生出其他單倍型。鄰接樹顯示中國(guó)家雞與紅原雞聚為一簇,與黑尾原雞、灰原雞和綠原雞分開;中國(guó)地方雞聚為同一簇,且存在明顯的交叉現(xiàn)象,無(wú)顯著的品種特異性?!窘Y(jié)論】COI基因可作為研究雞品種遺傳多樣性的候選分子標(biāo)記。僅依靠標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼技術(shù)無(wú)法有效區(qū)分差異外形較小的地方雞種,需要聯(lián)合多種分子標(biāo)記如COI基因、細(xì)胞色素b、 AFLP指紋技術(shù)、微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258、基因組SNP和品種特異的外貌特征。

    線粒體COI基因;DNA條形碼;地方雞種;品種鑒定;遺傳多樣性

    0 引言

    【研究意義】作為分布最廣泛的家禽,家雞()在人類生產(chǎn)生活中扮演著重要角色。中國(guó)家雞資源豐富,僅列入《中國(guó)畜禽遺傳資源志·家禽志》的地方雞品種就有107個(gè)[1]。隨著外來(lái)引進(jìn)品種和大量商品雞的飼養(yǎng),地方雞的種質(zhì)特性受到極大的影響。尋求快速簡(jiǎn)便的區(qū)分外形多樣、遺傳復(fù)雜的地方雞品種的技術(shù)方法是科學(xué)家和育種專家急需解決的問(wèn)題。由于線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶亞基I(cytochromeoxidase I,COI)具有相對(duì)保守與穩(wěn)定的變異性的特性,已作為DNA條形碼(DNA barcoding)研究的標(biāo)準(zhǔn)基因廣泛應(yīng)用于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的系統(tǒng)分類、種類鑒別、群體遺傳多樣性和分子進(jìn)化學(xué)研究[2-7]?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】自加拿大生物學(xué)家Hebert等[8]首先倡導(dǎo)將648 bp COI基因作為DNA條形碼編碼技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)基因應(yīng)用于生物物種鑒定以來(lái),獲得了蓬勃的發(fā)展。目前BOLD系統(tǒng)(The Barcode of Life Data System)記錄的標(biāo)本量達(dá)5 259 477件,其中條形碼研究3 881 860,物種數(shù)為235 994[9]。Kerr等[10]通過(guò)研究643種北美鳥類COI基因,發(fā)現(xiàn)94%的種類擁有明顯的條形碼分支,剩余的6%大部分是有規(guī)律雜交的物種。Ward[11]總結(jié)了FISH-BOL(The Fish Barcode of Life Initiative)的研究成果表明,DNA條形碼技術(shù)可以有效區(qū)分98%的海洋魚類和93%的淡水魚類。WILSON等[12]建立了馬來(lái)西亞半島鱗翅目蝴蝶的DNA條形碼參考數(shù)據(jù)庫(kù)并定義了亞種的參考閾值。孟瑋等[13-16]分別驗(yàn)證了COI基因作為DNA條形碼在魚類物種鑒定、鳥類分類、銀鯧群體遺傳多樣性、動(dòng)物藥材鑒定等方面的可行性。動(dòng)物品種鑒定方面,高玉時(shí)等[2,17-18]采用DNA條形碼技術(shù)驗(yàn)證了差異較大的地方雞品種鑒定的可行性和有效性?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】之前的地方雞DNA條形碼鑒定研究主要針對(duì)于外觀差異較大、地緣分布較遠(yuǎn)的品種,而對(duì)于外觀相近,地緣集中的品種則尚未開展研究?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以華南9個(gè)優(yōu)質(zhì)地方雞和國(guó)外引進(jìn)品種隱性白羽雞作為試驗(yàn)材料,采用標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼技術(shù)對(duì)10個(gè)雞品種進(jìn)行分子鑒定,評(píng)估COI基因作為DNA條形碼鑒定外形差異較小的雞品種的可行性。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    以華南9種優(yōu)質(zhì)地方雞和國(guó)外引進(jìn)品種隱性白羽雞共203個(gè)個(gè)體為試驗(yàn)材料(表1)。除五華三黃雞之外,其他8種地方雞種均入選《中國(guó)畜禽遺傳資源志·家禽志》[1],而五華三黃雞入選《中國(guó)禽類遺傳資源》[19]。五華三黃雞、陽(yáng)山雞采自其原產(chǎn)地,文昌雞、清遠(yuǎn)麻雞采自商品群,其余6種采自保種場(chǎng),五華三黃雞的樣品類型為羽毛,其他品種均為血液;從基因庫(kù)下載已發(fā)表的雞品種如黃郎雞、桃源雞、仙居雞等和原雞如紅原雞、灰尾原雞和綠原雞等的COI基因全序列,同時(shí)下載綠頭鴨COI基因作為計(jì)算遺傳距離的參考外群(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)。使用試劑盒HiPure Blood/Tissue DNA Mini Kit(美基生物,廣州)提取樣品基因組DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    表1 樣品信息

    1.2 PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定

    為提高PCR擴(kuò)增的特異性和效率,參照鳥類DNA條形碼通用引物和已發(fā)表的黃郎雞線粒體全基因組序列(GU261701)微調(diào)COI基因的擴(kuò)增引物(BirdF1:5′-TTCTCCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′[20],COIR:5′- CGTGGGAAATTATTCCGAAACCTG -3′)。PCR反應(yīng)體系為30 μL,含10×PCR buffer 3μL,dNTP mixture(2.5 mmol·L-1)2.4 μL,引物各0.3 μL(20 μmol·L-1),rTaq DNA聚合酶(寶生物, 大連)1.5 U,DNA模板100 ng。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4 min,然后35個(gè)循環(huán)(94℃變性30 s,58℃退火1 min,72℃延伸50 s),最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海立菲生物技術(shù)有限公司(廣州)雙向測(cè)序。

    1.3 序列分析

    Bioedit 軟件讀取測(cè)序序列,對(duì)每個(gè)序列進(jìn)行人工逐個(gè)堿基檢查校對(duì),并通過(guò)每個(gè)樣品雙向測(cè)序和每個(gè)單倍型重新測(cè)序進(jìn)行雙重校正。采用標(biāo)準(zhǔn)的648 bp DNA條形碼序列(對(duì)應(yīng)小鼠COI基因第58—705位堿基)作為分析數(shù)據(jù)。所獲序列用Clustal X軟件[21]進(jìn)行對(duì)位排列后,用DnaSP5.0軟件[22]定義單倍型,計(jì)算單倍型多樣性(Haplotype diversity,)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity,π)和核苷酸差異均數(shù)()。通過(guò)NETWORK 4.6.1.4 軟件[23]構(gòu)建單倍型中介連接網(wǎng)絡(luò)圖(Median-joining networks)。以綠頭鴨為外群(,KJ883269),用MEGA6.0 軟件[24]中的Kimura 2-parameter(K2P)模型計(jì)算遺傳距離;應(yīng)用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    2 結(jié)果

    2.1 COI基因序列的核苷酸位點(diǎn)變異、核苷酸多樣性和單倍型多樣性

    除去PCR引物序列,獲得了695 bp COI基因片段。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼序列,截取648 bp 線粒體COI基因序列進(jìn)行分析。10個(gè)雞種203個(gè)個(gè)體線粒體COI基因共檢測(cè)到110個(gè)變異位點(diǎn),占分析位點(diǎn)的16.98%,其中單一位點(diǎn)突變90個(gè)(2型20個(gè),3型2個(gè)),簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)20個(gè)。五華三黃雞的平均核苷酸差異數(shù)最大,為3.629,文昌雞的最小,為1.455;相應(yīng)地,五華三黃雞的核苷酸多樣性最高,文昌雞的最?。ū?)。在110個(gè)變異位點(diǎn)中,定義了84種單倍型,其中單倍型1出現(xiàn)頻率最高,為64次(9個(gè)地方雞種所共有,隱性白羽雞除外),其次是單倍型9,為29次(8個(gè)雞種共有,杏花雞、文昌雞除外),第三是單倍型5,為19次(9個(gè)雞種共有,清遠(yuǎn)麻雞除外)(表3)。廣西三黃雞、五華三黃雞與中山沙欄雞的單倍型數(shù)最多,為13個(gè),隱性白羽雞與清遠(yuǎn)麻雞的最少,為8個(gè)。不同品種的單倍型分布差異較大,如隱性白羽雞單倍型主要分布在9和79,清遠(yuǎn)麻雞主要分布在1和9,惠陽(yáng)胡須雞主要分布在1、5和9,杏花雞主要分布在1(表3)。

    表2 10個(gè)雞種COⅠ基因序列變異位點(diǎn)數(shù)、平均核苷酸差異、核苷酸多樣性和單倍型多樣性

    表3 10個(gè)雞品種線粒體COI基因的單倍型及其在不同品種的分布

    續(xù)表3 Continued table 3

    單倍型Haplotype變異位點(diǎn)Variable sites (in bp)單倍型在品種的分布(頻率)Breeds (frequency) 1111111111111111122222222222222222223333333333333333334444444444444444444455555555555555666122344555566677899011123455666789990111122344556888999011123466788888999002233344555667777890000113555689901490121492378247473091035379155674046850368058051710461261048752697035680457868467041271825781702792611251104294 Hap27.............................G................................................................................SL(1) Hap28.........C........C................G.......................G..................................................SL(1) Hap29.........C........C................G...........................................C..................A...........SL(1) Hap30.........C........C................G....................A.....................................................SL(1),WH(1) Hap31...................G..........................................................................................SL(1),YS(1) Hap32...............................................................................................T........G.....SL(1) Hap33......................................................................C.......................................SL(1) Hap34.........C........C................G........C.................................................................SL(1) Hap35.........C......T.C................G..........................................................................YS(1) Hap36...............................................................................A..............................YS(1) Hap37.................G.................................C..........................................................YS(1) Hap38.........C........C................G..............C............................................T...G..........YS(1) Hap39......................G.......................................................................................YS(1) Hap40.........C........C.............G..G..........................................................................YS(1) Hap41......................................................................................................G.....A.XH(1) Hap42....................................................G.........................................................XH(1) Hap43.........CT.......C................G..........................................................................XH(1) Hap44.........................................................................C......................A.............XH(1) Hap45.........C........C....G...........G...................................C..................T...................XH(1) Hap46.....................................................C........................................................XH(1) Hap47.........C........C................G......................G....G....................................C.........XH(1) Hap48......................................................................................................G.......XH(1) Hap49...........................C...................................................................T..............XH(1) Hap50..........................T....................................................................T..............WH(1) Hap51.............................................C................................................................WH(1) Hap52.........C........C................G....................A........................................C............WH(1) Hap53............................T.................................................................................WH(1) Hap54.........C..AA....C...........G....G..................TCA.....G...AC.........G.........................A..G...WH(1) Hap55.........C........C......C.........G..........................................................................WH(1)

    續(xù)表3 Continued table 3

    單倍型Haplotype變異位點(diǎn)Variable sites (in bp)單倍型在品種的分布(頻率)Breeds (frequency) 1111111111111111122222222222222222223333333333333333334444444444444444444455555555555555666122344555566677899011123455666789990111122344556888999011123466788888999002233344555667777890000113555689901490121492378247473091035379155674046850368058051710461261048752697035680457868467041271825781702792611251104294 Hap56..................C............................................................................T..............WH(1) Hap57.........C........C................G............................G.............................................WH(1) Hap58.....C.........................................G..............................................................WC(1) Hap59........................................G.....................................................................WC(2) Hap60...........................C........G.........................................................................WC(1) Hap61..........................................................................C...................................WC(1) Hap62................................................................................C.............................WC(1) Hap63........................................................................C.....................................WC(1) Hap64................................................T..............................................T..............WC(1) Hap65......A.......................................................................................................WC(1) Hap66....A.A.......................................................................................................WC(1) Hap67...........T..................................................................................................WC(1) Hap68......................................................................................T.......................WC(1) Hap69..............................................C..................................C............................GX(1) Hap70.................................................T..................C.........................................GX(1) Hap71C.............................................................................................................GX(1) Hap72.......T......................................................................................................GX(1) Hap73...A..........................................................................................................GX(1) Hap74......................................G.......................................................................GX(1) Hap75.....................A........................................................................................GX(1) Hap76............................................................T...................C.............................GX(1) Hap77..A....................................G......................................................................GX(1) Hap78..............G..........................................................................G.....T..............GX(1) Hap79.........C........C................G.......................................G..................................RW(6) Hap80.........C........C................G.........................................................................CRW(1) Hap81.........C........C.....C..........G.......................................G..................................RW(1) Hap82.........C........C................G.........................G................................................RW(1) Hap83...............A.......................................................C.......................T..............RW(1) Hap84..................C........................G...................................................T..............RW(1)

    圓點(diǎn)表示與單倍型Hap1具有相同的堿基 Dots within the nucleotide position indicate the same nucleotides as given in Hap1

    2.2 10個(gè)雞品種群體內(nèi)與群體間遺傳距離

    對(duì)10個(gè)雞品種COI基因序列K2P距離和凈遺傳距離(Da)研究顯示,綠頭鴨與雞品種的遺傳距離明顯大于雞品種之間的遺傳距離(表4)。雞品種間遺傳距離范圍為0.003—0.006,隱性白羽雞與9種地方雞種的遺傳距離較遠(yuǎn);五華三黃雞品種內(nèi)的遺傳距離最大,為0.006,文昌雞品種內(nèi)遺傳距離最小,為0.002。10個(gè)雞種品種凈遺傳距離為0—0.003(表4)。

    表4 10個(gè)雞品種間Kiumura 雙參數(shù)距離和凈遺傳距離(Da)

    上三角為凈遺傳距離Da,下三角為Kiumura 雙參數(shù)距離

    Above dialogue was net distance (Da), down diagonal was K2P distance of COIgene among 10 chicken breeds

    2.3 COI基因中介網(wǎng)絡(luò)圖和系統(tǒng)發(fā)育樹

    利用表3的單倍型數(shù)據(jù)構(gòu)建中介網(wǎng)絡(luò)圖。中介網(wǎng)絡(luò)圖主要分為3個(gè)進(jìn)化枝,第1枝是以Hap1為中心節(jié)點(diǎn),另外2枝是從Hap1衍生出來(lái)的以Hap5、Hap9為中心節(jié)點(diǎn)(圖1)。Hap1最有可能是祖先單倍型,逐漸衍生出其他單倍型。以Hap9為中心的進(jìn)化枝表現(xiàn)出一定的品種特異性,如文昌雞和廣西三黃雞不在此枝;另外兩枝則未表現(xiàn)出此特征。

    紅色方塊是軟件NETWORK生成的媒介載體,代表在實(shí)際樣本未觀察到的推測(cè)的中間單倍型。圓的大小對(duì)應(yīng)于單倍型頻率。不同雞品種用不同顏色標(biāo)注

    采用K2P模型構(gòu)建本研究定義的單倍型(每個(gè)品種所有的單倍型,共121條序列)和下載已發(fā)表的雞COI基因序列(648 bp,29條序列)的系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接樹)。發(fā)育樹分為三枝,第一枝是黑尾原雞和灰原雞,第二枝是綠原雞,第三枝是包括五個(gè)紅原雞亞種在內(nèi)的地方雞(圖2)。第三枝又細(xì)分為兩枝,存在亞種/品種的個(gè)體交叉現(xiàn)象,沒有發(fā)現(xiàn)亞種/品種特異性。

    品種名稱縮寫見表1,數(shù)字表示樣品編號(hào) The breed Abbr. please see Table 1 in details, digit represent the sample number

    3 討論

    3.1 10個(gè)雞品種COI基因序列的遺傳多樣性

    本研究獲得了9個(gè)地方雞種和1個(gè)引進(jìn)雞品種共203個(gè)個(gè)體的648 bp線粒體COI基因序列,共檢測(cè)到110個(gè)變異位點(diǎn),定義了84種單倍型。其中五華三黃雞的遺傳多樣性最高,中山沙欄雞次之,文昌雞最低。由于分布在偏遠(yuǎn)山村,基因交流較少,未進(jìn)行系統(tǒng)選育且樣品為隨機(jī)采集如五華三黃雞[25],或采自祖代群如中山沙欄雞,或采樣時(shí)間較早如陽(yáng)山雞,這些品種保留著較高的遺傳多樣性。而來(lái)自商品群的地方雞遺傳多樣性則較低,如文昌雞(品種內(nèi)遺傳距離0.002,表4)。84種單倍型在不同的品種的分布有所差異,如單倍型1出現(xiàn)64次,除了隱性白羽雞,其他9個(gè)地方雞都有分布;其次是單倍型9和5;隱性白羽雞主要分布在單倍型9和79,清遠(yuǎn)麻雞主要分布在單倍型1和9,惠陽(yáng)胡須雞主要分布在單倍型1、5和9,杏花雞分布在單倍型1,而其他7個(gè)品種單倍型分布較為分散(表3)。本文研究的雞品種的COI基因序列變異位點(diǎn)數(shù)、平均核苷酸差異、核苷酸多樣性和單倍型多樣性比同等類型研究相近或更高[2,17-18],說(shuō)明本文選取的雞品種保護(hù)潛力較大,證明標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼用于研究雞品種遺傳多樣性的有效性。另外,以綠頭鴨為外群計(jì)算遺傳距離時(shí),綠頭鴨與雞品種間的遺傳距離明顯大于雞品種間的遺傳距離,表明COI基因可作為計(jì)算雞品種間的遺傳距離的分子標(biāo)記。

    3.2 中國(guó)地方雞品種COI基因系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

    鄰接樹顯示中國(guó)地方雞與紅原雞分為兩枝,雖然有些品種分布較為集中(如惠陽(yáng)胡須雞),但均存在亞種/品種的個(gè)體交叉現(xiàn)象(圖2)。當(dāng)提高建樹可信度時(shí)(1000步bootstrap、50% cut-off),所有中國(guó)地方雞與紅原雞聚為一枝(數(shù)據(jù)未顯示),說(shuō)明應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼技術(shù)無(wú)法將中國(guó)地方雞品種有效區(qū)分開來(lái)。而中國(guó)地方雞和紅原雞與黑尾原雞、灰原雞、綠原雞分開,間接支持了中國(guó)地方雞與紅原雞親緣關(guān)系較近的觀點(diǎn)。主要原因可能有兩點(diǎn):一是本研究的9個(gè)地方雞種在廣東飼養(yǎng)量較大,因地域鄰近和經(jīng)貿(mào)頻繁,不同的雞種在品種形成與進(jìn)化過(guò)程中不可避免存在不同程度的雜交,出現(xiàn)了個(gè)別品種間的交叉現(xiàn)象(圖2);二是COI基因的相對(duì)保守性,品種間的遺傳差異較小(表4)。在本研究中,雖然部分單倍型為特定品種所有,如單倍型12—19為清遠(yuǎn)麻雞特有,但這些單倍型與其他雞品種部分單倍型聚在同一枝(圖2);并且該結(jié)果是基于有限的樣品(10個(gè)品種,每個(gè)品種18—23只,共203只)得出的,在增加樣品數(shù)量或品種后是否還是清遠(yuǎn)麻雞特有還有待研究。因此,雜交使得亞種/品種鑒定變得困難,分析時(shí)需要在足夠的樣品數(shù)量和聯(lián)合多種方法后才能得出比較可靠的結(jié)論[2,12]。

    3.3 應(yīng)用COI基因鑒定地方雞品種

    研究表明DNA條形碼對(duì)鑒定差異較大的雞品種鑒定具有可行性和有效性[2,26]。在相近的COI基因片段長(zhǎng)度下,本研究在10個(gè)雞種203只個(gè)體共檢測(cè)到110個(gè)變異位點(diǎn),多于15個(gè)差異較大的雞種227個(gè)個(gè)體的38個(gè)變異位點(diǎn)[2],說(shuō)明本研究采用的COI基因片段信息含量較高。雖然不同的品種有特異的單倍型,但分布不集中,且大多只有1個(gè)個(gè)體(隱性白羽雞除外,單倍型79有6個(gè)個(gè)體),因此,無(wú)法確定是否能夠作為品種鑒定的診斷依據(jù),需加大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。在本研究的9種華南家雞中,外形特征較為顯著,同時(shí)按照品種標(biāo)準(zhǔn)采集樣品,因同品種異名而導(dǎo)致COI無(wú)法區(qū)分開這9種地方雞品種的可能性極低。此外,有趣的是,單倍型1為9個(gè)地方雞品種所共有,隱性白羽雞除外,可作為中國(guó)地方雞品種的鑒定依據(jù)。由于地方雞品種復(fù)雜的形成與進(jìn)化歷史和COI基因自身的屬性,運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼技術(shù)無(wú)法鑒定本研究的9個(gè)親緣關(guān)系較近、地域鄰近的華南地方雞種。因此,有效的品種鑒定還需聯(lián)合多種分子標(biāo)記如COI基因[26]、AFLP指紋技術(shù)[27]、細(xì)胞色素b[28]、LEI0258[29]、基因組SNP[30]等,以及與品種特定的外形特征如清遠(yuǎn)麻雞的“一楔、二細(xì)、三麻身”、杏花雞的“兩細(xì)(頭細(xì)、腳細(xì))、三黃(羽黃、腳黃、喙黃)、三短(頸短、體軀短、腿短)”。

    4 結(jié)論

    COI基因可用于地方雞的遺傳多樣性研究,但標(biāo)準(zhǔn)的DAN條形碼技術(shù)無(wú)法有效區(qū)分差異較小的雞品種,需要聯(lián)合其他分子標(biāo)記以及外形特征進(jìn)行鑒定。

    致謝:感謝鄒志冠、劉少豐提供部分試驗(yàn)樣品,感謝杜炳旺教授、古文良、陳浩、劉怡然、溫金星、黃豐勛、徐迪宗、陳勇杰、曾德鑫在收集樣品時(shí)提供的幫助。

    References:

    [1] 國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì). 中國(guó)畜禽遺傳資源志·家禽志. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2011.

    China National Commission of Aniamal Genetic Resources.:. Beijing: China Agriculture Press, 2011. (in Chinese)

    [2] 高玉時(shí), 唐修君, 屠云潔, 陸俊賢, 薛茂云, 施祖灝, 張小燕. 基于線粒體COI基因15個(gè)雞種的DNA 編碼研究. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(3): 587-594.

    GAO Y S, TANG X J, TU Y J, LU J X, XUE M Y, SHI Z H, ZHANG X Y. Studies on the DNA barcoding of fifteen chicken breeds by mtDNA COI gene., 2011, 44(3):587-594. (in Chinese)

    [3] TAVARES E S, GON?ALVES P, MIYAKI C Y, BAKER A J. DNA barcode detects high genetic structure within Neotropical bird species., 2011, 6(12): e28543.

    [4] BUCKLIN A, STEINKE D, BLANCO-BERCIAL L. DNA barcoding of marine metazoa., 2011, 3(1): 471-508.

    [5] LERAY M, KNOWLTON N. DNA barcoding and metabarcoding of standardized samples reveal patterns of marine benthic diversity., 2014, 112(7): 2076-2081.

    [6] SAITOH T, SUGITA N, SOMEYA S, IWAMI Y, KOBAYASHI S, KAMIGAICHI H, HIGUCHI A, ASAI S, YAMAMOTO Y, NISHIUMI I. DNA barcoding reveals 24 distinct lineages as cryptic bird species candidates in and around the Japanese Archipelago., 2015, 15(1): 177-186.

    [7] BAMANIYA D C, PAVAN-KUMAR A, GIREESH-BABU P, SHARMA N, REANG D, KRISHNA G, LAKRA W S. DNA barcoding of marine ornamental fishes from India.,:,,, 2016, 27(5): 3093-3097.

    [8] HEBERT P D, RATNASINGHAM S, DEWAARD J R. Barcoding animal life: cytochromeoxidase subunit 1 divergences among closely related species., 2003, 270(S1): S96-S99.

    [9] RATNASINGHAM S, HEBERT P D. BOLD: The barcode of life data system., 2007, 7(3): 355-364.

    [10] KERR K C, STOECKLE M Y, DOVE C J, WEIGT L A,FRANCIS C M, HEBERT P D. Comprehensive DNA barcode coverage of North American birds., 2007, 7(4): 535-543.

    [11] WARD R D. FISH-BOL, a case study for DNA barcodes., 2012, 858: 423-439.

    [12] WILSON J J, SING K W, SOFIAN-AZIRUN M. Building a DNA barcode reference library for the true butterflies (Lepidoptera) of peninsula malaysia: What about the Subspecies?, 2013, 8(11): e79969.

    [13] 孟瑋, 楊天燕, 海薩, 海沙爾·阿那斯. 基于線粒體COI基因序列的亞?wèn)|鮭DNA條形碼研究. 水產(chǎn)學(xué)雜志, 2010, 23(1): 6-10.

    MENG W, YANG T Y, HAI S, HAI S E. Study of DNA barcoding based on the mitochondrial COI Gene Sequences in., 2010, 23(1): 6-10. (in Chinese)

    [14] 馬明義, 閆穎, 王譯偉, 李靜, 蔡延森, 李佳凌. 我國(guó)32 種鳥類DNA條形碼分析. 四川動(dòng)物, 2012, 31(5): 729-733.

    MA M Y, YAN Y, WANG Y W, LI J, CAI Y S, LI J L. A study of DNA barcoding on 32 species of bird in China., 2012, 31(5): 729-733. (in Chinese)

    [15] 彭士明, 施兆鴻, 侯俊利. 基于線粒體D-loop區(qū)與COI基因序列比較分析養(yǎng)殖與野生銀鯧群體遺傳多樣性. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2010, 34(1): 19-25.

    PENG S M, SHI Z H, HOU J L. Comparative analysis on the genetic diversity of cultured and wild silver pomfret populations based on mt D-loop and COI gene., 2010, 34(1): 19-25. (in Chinese)

    [16] 張輝, 姚輝, 崔麗娜, 杜鶴, 林喆, 高曉晨, 郎雪, 宋經(jīng)元, 羅焜, 石林春, 陳士林. 基于COI條形碼序列的《中國(guó)藥典》動(dòng)物藥材鑒定研究. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2013, 15(3): 371-380.

    ZHANG H, YAO H, CUI L N, DU H, LIN Z, GAO X C, LANG X, SONG J Y, LUO K, SHI L C, CHEN S L. Application of COI-based DNA barcoding for identifying animal medical materials in the Chinese pharmacopoeia., 2013, 15(3): 371-380. (in Chinese)

    [17] 屠云潔, 高玉時(shí), 周新民, 張學(xué)余, 王克華, 唐修君. 我國(guó)6個(gè)地方雞品種線粒體COI基因遺傳多樣性分析. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2007, 28(3): 31-33.

    TU Y J, GAO Y S, ZHOU X M, ZHANG X Y, WANG K H, TANG X J. The genetic diversity analysis of mtDNA COI genes in six indigenous chicken breeds in China., 2007, 28(3): 31-33. (in Chinese)

    [18] 高玉時(shí), 屠云潔, 童海兵, 王克華, 陳寬維, 顧榮. 6個(gè)地方雞種線粒體COI基因的DNA條形碼. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2007, 15(6):924-930.

    GAO Y S, TU Y J, TONG H B, WANG K H, CHEN K W, GU R. DNA barcoding application of mtDNA COI Gene in identifying six indigenous chicken breeds in China., 2007, 15(6): 924-930. (in Chinese)

    [19] 陳國(guó)宏, 王克華, 王金玉, 丁鏟, 楊寧. 中國(guó)禽類遺傳資源. 上海: 上??茖W(xué)技術(shù)出版社, 2004.

    CHEN G H, WANG K H, WANG J Y, DING C, YANG N. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers, 2004. (in Chinese)

    [20] HEBERT P D, STOECKLE M Y, ZEMLAK T S, FRANCIS C M. Identification of birds through DNA barcodes., 2004, 2(10): e312.

    [21] THOMPSON J D, GIBSON T J, PLEWNIAK F, JEANMOUGIN F, HIGGINS D G. The Clustal_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools., 1997, 25(24): 4876-4882.

    [22] LIBRADO P, ROZAS J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data., 2009, 25(11): 1451-1452.

    [23] BANDELT H J, FORSTER P, R?HL A. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies., 1999, 16(1): 37-48.

    [24] TAMURA K, STECHER G, PETERSON D, FILIPSKI A, KUMAR S. MEGA6: Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0., 2013, 30(12): 2725-2729.

    [25] 黃勛和, 李威娜, 陳珊, 陳潔波, 鐘福生. 五華三黃雞群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析. 中國(guó)家禽, 2016, 38(1): 56-58.

    HUANG X H, LI W N, CHEN S, CHEN J B, ZHONG F S. Population genetic diversity and genetic structure of Wuhua three- yellow chicken., 2016, 38(1): 56-58.(in Chinese)

    [26] BONDOC O L, SANTIAGO R C. The use of DNA barcodes in the evolutionary analysis of domestic breeds and strains of chicken () in the Philippines., 2012, 95(4): 358-369.

    [27] 高玉時(shí), 屠云潔, 錢勇, 李慧芳, 陳寬維, 童海兵. 12個(gè)地方雞種遺傳多態(tài)性AFLP指紋分析. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2006, 14(4): 498-502.

    GAO Y S, TU Y J, QIAN Y, LI H F, CHEN K W, TONG H B. AFLP Fingerprinting analysis of genetic polymorphism in 12 indigenous chicken breeds., 2006, 14(4): 498-502. (in Chinese)

    [28] YACOUB H A, FATHI M M, SADEK M A. Using cytochromegene of mtDNA as a DNA barcoding marker in chicken strains., 2015, 26(2): 217-223.

    [29] HAN B, LIAN L, QU L J, ZHENG J X, YANG N. Abundant polymorphisms at the microsatellite locus LEI0258 in indigenous chickens., 2013, 92(12): 3113-3119.

    [30] KWAK W, SONG K D, OH J D, HEO K N, LEE J H, LEE W K, YOON S H, KIM H, CHO S, LEE H K. Uncovering genomic features and maternal origin of korean native chicken by whole genome sequencing., 2014, 9(12): e114763.

    (責(zé)任編輯 林鑒非)

    DNA Barcoding of Indigenous Chickens in China: a Reevaluation

    HUANG Xun-he1, CHEN Jie-bo1, HE Dan-lin2, ZHANG Xi-quan2, ZHONG Fu-sheng1

    (1School of Life Sciences, Jiaying University, Meizhou 514015, Guangdong;2College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)

    【Objective】 The aim of this study is to determine the feasibility of utility of mitochondrial cytochromeoxidase subunit I (COI) gene as DNA barcoding to identify indigenous chicken breeds with nearer appearances.【Method】 COI gene of 648 bp in length was obtained from nine indigenous chicken breeds of South China (Huaixiang, Qingyuan spotted, Huiyang bearded, Zhongshan shalan, Yangshan, Xinghua, Wuhua three-yellow, Wenchang and Guangxi yellow) and one commercial breed, Recessive White, with the method of direct sequencing of PCR products; while other COI sequences were downloaded from GenBank, including Chinese indigenous chickens and wild jungles and mallard (). These sequences were then used to analyze genetic diversity and genetic distance, construct median-joining network and phylogenetic tree based on haplotypes, as well as define breed specific haplotypes. 【Result】 COI gene of 695 bp in length was obtained after deletion of the primers sequences. And then 648 bp of standard barcoding was used for analysis. A total of 110 mutation sites were detected from 203 individuals of 10 breeds with 16.98% in all sites, of which 90 were singleton variable sites and the remaining 20 were parsimony informative sites. The average nucleotide diversity and haplotype diversity were 0.00394 (0.00349-0.00560) and 0.832 (0.763-0.905), respectively. Wuhua three-yellow chicken had the highest levels of genetic diversity, Zhongshan Shalan chicken had the second higher one, but Wenchang chicken had the lowest ones. A total of 84 haplotypes were defined, haplotype 1 had the highest frequency in nine indigenous chicken breeds. Haplotyes 9 and 5 were sharing both in indigenous and Recessive White chicken breeds, with the frequencies of 29 and 19, respectively. Each breed had its own haplotypes. Guangxi yellow, Wuhua three-yellow and Zhongshan shalan chickens had most 13 haplotypes, while Qingyuan spotted and Recessive White had least 8 haplotypes. The distribution of haplotypes of different breeds had a little of difference. For example, the haplotypes of Xinghua chicken was mostly distributed at 1, where Qingyuan spotted, Huiyang bearded and Recessive White was mostly distributed at 1 and 9, 1, 5 and 9, and 9 and 79, respectively. The genetic distance and net genetic distance between 10 breeds were ranged from 0.003 to 0.006 and from 0 to 0.003, respectively. The genetic distance among breeds was higher than those of within a breed; those of betweenand chickens were higher than 0.2. The 84 haplotyes of median-joining networks of were classified into three clusters with the characteristic of breed specific. For example, the cluster originated from in haplotype 9 had no Guangxi yellow and Wenchang chicken breeds. Other haplotypes were the descendent of 1. The Neighbor-joining tree showed that indigenous chickens in China andwere clustered into one branch, separating from,and. No branch with breed specificity was found. 【Conclusion】The results presented herein indicated that COI gene can be used as a candidate molecular marker for elucidate genetic diversity of indigenous chickens. It’s less effectivity of utility of standard COI gene as DNA barcoding to identify indigenous chicken with nearer appearance, there is highly need to incorporate multiple molecular markers such as COI gene, Cytochrome b gene, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SNP (Single Nucleotide Polymorphism) and breed specific appearances.

    mitochondrial cytochromeoxidase subunit I gene; DNA barcode; indigenous chicken; breed identification; genetic diversity

    2015-06-23;接受日期:2016-05-14

    廣東省自然科學(xué)基金(2014A030307018)、嘉應(yīng)學(xué)院“創(chuàng)新強(qiáng)校工程”項(xiàng)目(CQX019)、廣東省公益研究與能力建設(shè)項(xiàng)目(2015A020208020)

    黃勛和,E-mail:hxh826@126.com。通信作者鐘福生,E-mail:zfs@jyu.edu.cn

    猜你喜歡
    三黃雞雞種條形碼
    三黃雞疫病防疫技術(shù)要點(diǎn)
    創(chuàng)意條形碼
    從雞種識(shí)人
    意林(2019年17期)2019-10-07 12:28:52
    CENPA基因在不同雞種上的序列比較分析
    從條形碼到二維碼
    從條形碼到二維碼
    三黃雞果園、山地相結(jié)合的放養(yǎng)技術(shù)探討
    條形碼大變身
    不同雞種DMA基因序列比較分析
    ◆專利名稱:一種三黃雞用微量元素添加劑
    一区二区三区四区激情视频 | 免费观看精品视频网站| 99视频精品全部免费 在线| 深夜a级毛片| 国产精品三级大全| 99久国产av精品国产电影| 久久久国产成人精品二区| 成人精品一区二区免费| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲av成人av| 免费观看的影片在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美最新免费一区二区三区| 最好的美女福利视频网| 校园人妻丝袜中文字幕| 干丝袜人妻中文字幕| 欧美高清成人免费视频www| 免费在线观看影片大全网站| 波多野结衣高清作品| 日韩高清综合在线| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品乱码一区二三区的特点| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲美女视频黄频| 亚洲欧美清纯卡通| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产精品一及| 久久九九热精品免费| 天堂影院成人在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲欧美清纯卡通| 成人美女网站在线观看视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲无线在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品,欧美在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲美女搞黄在线观看 | 久久久久国内视频| 国产在视频线在精品| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久99热这里只有精品18| 色播亚洲综合网| 91精品国产九色| 伦精品一区二区三区| 国产三级在线视频| 色播亚洲综合网| 亚洲久久久久久中文字幕| 欧美激情久久久久久爽电影| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 男女那种视频在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久综合国产亚洲精品| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲av二区三区四区| 中文亚洲av片在线观看爽| 看非洲黑人一级黄片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美国产日韩亚洲一区| 九九在线视频观看精品| 亚洲熟妇熟女久久| 99热6这里只有精品| 成人精品一区二区免费| 五月伊人婷婷丁香| 午夜免费激情av| 男女那种视频在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 综合色丁香网| 直男gayav资源| 在线观看66精品国产| 高清日韩中文字幕在线| 成人av在线播放网站| 99久久精品一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 床上黄色一级片| 久99久视频精品免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 综合色av麻豆| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲色图av天堂| www.色视频.com| 最近手机中文字幕大全| 国产精品野战在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| а√天堂www在线а√下载| 欧美成人免费av一区二区三区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 男女下面进入的视频免费午夜| 精品免费久久久久久久清纯| 一本精品99久久精品77| 欧美+亚洲+日韩+国产| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美成人免费av一区二区三区| 国语自产精品视频在线第100页| 久久久成人免费电影| 美女cb高潮喷水在线观看| 天堂网av新在线| av在线蜜桃| 国产精品日韩av在线免费观看| 99热6这里只有精品| 国产精品99久久久久久久久| 高清日韩中文字幕在线| 免费在线观看成人毛片| 在线a可以看的网站| 久久中文看片网| 简卡轻食公司| 成人高潮视频无遮挡免费网站| www.色视频.com| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产av麻豆久久久久久久| 日日啪夜夜撸| 欧美在线一区亚洲| 亚洲在线自拍视频| 村上凉子中文字幕在线| av视频在线观看入口| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 久久午夜福利片| 欧美一级a爱片免费观看看| 日韩人妻高清精品专区| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日本熟妇午夜| 精品久久久久久久久亚洲| 一夜夜www| 能在线免费观看的黄片| 国产成人freesex在线 | 伦精品一区二区三区| 国产高清激情床上av| 久久九九热精品免费| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 精品久久久久久久久久久久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 欧美成人免费av一区二区三区| 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩欧美三级三区| 久久久国产成人精品二区| 网址你懂的国产日韩在线| 我的女老师完整版在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 欧美不卡视频在线免费观看| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 寂寞人妻少妇视频99o| 一级毛片电影观看 | 两个人视频免费观看高清| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲第一电影网av| 日本熟妇午夜| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久精品91蜜桃| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美激情久久久久久爽电影| 97超视频在线观看视频| 欧美中文日本在线观看视频| 国内精品美女久久久久久| 国产一区二区激情短视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 一个人看的www免费观看视频| 深夜精品福利| 午夜精品国产一区二区电影 | 亚洲av中文av极速乱| 亚洲av熟女| 国产高清三级在线| 村上凉子中文字幕在线| 在线免费十八禁| 欧美人与善性xxx| www.色视频.com| 最近2019中文字幕mv第一页| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产成人福利小说| 久久精品国产亚洲av天美| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲在线观看片| 色在线成人网| 听说在线观看完整版免费高清| 麻豆国产av国片精品| 中文在线观看免费www的网站| h日本视频在线播放| 亚洲精品成人久久久久久| 激情 狠狠 欧美| 99热6这里只有精品| 免费av观看视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 变态另类丝袜制服| 1024手机看黄色片| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产精品人妻久久久久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 99国产极品粉嫩在线观看| 久久久久久久久久黄片| 欧美在线一区亚洲| 最新在线观看一区二区三区| 青春草视频在线免费观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 深夜a级毛片| 露出奶头的视频| 在线免费十八禁| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品一区二区性色av| 变态另类丝袜制服| 国产精品久久久久久久久免| 国产乱人视频| 春色校园在线视频观看| 99久久九九国产精品国产免费| 九色成人免费人妻av| 成年免费大片在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲五月天丁香| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久久成人免费电影| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲经典国产精华液单| 日韩欧美免费精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 丰满的人妻完整版| 极品教师在线视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 免费av观看视频| 免费电影在线观看免费观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久久久久九九精品二区国产| 日日摸夜夜添夜夜爱| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品,欧美在线| 国产单亲对白刺激| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲五月天丁香| 日韩成人伦理影院| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧美成人a在线观看| 91在线观看av| 精品久久国产蜜桃| 亚洲在线观看片| 最新中文字幕久久久久| 最新在线观看一区二区三区| 此物有八面人人有两片| 久久久国产成人免费| 亚洲av二区三区四区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 老女人水多毛片| 村上凉子中文字幕在线| 99热6这里只有精品| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 中国美女看黄片| 亚洲,欧美,日韩| 天堂√8在线中文| 99热这里只有精品一区| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久精品国产亚洲网站| 22中文网久久字幕| 在现免费观看毛片| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲国产欧美人成| 一本精品99久久精品77| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲人成网站在线播| 国产三级中文精品| 一进一出抽搐动态| 国产免费一级a男人的天堂| 六月丁香七月| 黄色一级大片看看| 国产高清有码在线观看视频| 日韩成人伦理影院| 舔av片在线| 国内精品久久久久精免费| 国产高清激情床上av| 免费看av在线观看网站| 午夜福利在线在线| 精品无人区乱码1区二区| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 久久综合国产亚洲精品| 国产亚洲精品av在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产乱人偷精品视频| 国产一区二区三区av在线 | 中文字幕av在线有码专区| 在线免费观看的www视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产成人91sexporn| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 色在线成人网| 成人鲁丝片一二三区免费| 在线观看av片永久免费下载| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲五月天丁香| 天天一区二区日本电影三级| 我要搜黄色片| 搡老熟女国产l中国老女人| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 直男gayav资源| 此物有八面人人有两片| 亚洲av.av天堂| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲五月天丁香| 极品教师在线视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 俄罗斯特黄特色一大片| 最新在线观看一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区四那| av天堂在线播放| 91久久精品国产一区二区成人| 国产av一区在线观看免费| 不卡一级毛片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 精品久久久久久成人av| 国产一级毛片七仙女欲春2| 长腿黑丝高跟| 免费在线观看成人毛片| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久九九热精品免费| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 五月伊人婷婷丁香| 男人的好看免费观看在线视频| 国产精品野战在线观看| eeuss影院久久| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 草草在线视频免费看| 夜夜夜夜夜久久久久| 波多野结衣高清无吗| 国产麻豆成人av免费视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 日本一二三区视频观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 夜夜爽天天搞| 婷婷精品国产亚洲av| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲欧美日韩东京热| 一级毛片久久久久久久久女| 看黄色毛片网站| 一级毛片电影观看 | 丝袜美腿在线中文| 亚洲av二区三区四区| 免费搜索国产男女视频| 在线观看66精品国产| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 在线免费十八禁| 悠悠久久av| 老司机影院成人| 免费观看在线日韩| 亚洲国产精品成人久久小说 | 久久久久久国产a免费观看| 免费人成在线观看视频色| 久久精品影院6| 国产探花在线观看一区二区| 有码 亚洲区| 国产色婷婷99| 久久久久久久午夜电影| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日韩欧美免费精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产精品久久视频播放| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 久久九九热精品免费| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品欧美国产一区二区三| 寂寞人妻少妇视频99o| 麻豆国产av国片精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 男人和女人高潮做爰伦理| 永久网站在线| 可以在线观看的亚洲视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 热99re8久久精品国产| 波多野结衣高清无吗| 在线看三级毛片| 村上凉子中文字幕在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 婷婷六月久久综合丁香| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲国产精品sss在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美在线一区亚洲| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 黄色欧美视频在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 热99re8久久精品国产| 国产老妇女一区| 亚洲av第一区精品v没综合| 一级毛片aaaaaa免费看小| 成人国产麻豆网| 51国产日韩欧美| 中文亚洲av片在线观看爽| 中文字幕熟女人妻在线| 丝袜喷水一区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 伦精品一区二区三区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 色尼玛亚洲综合影院| 深夜a级毛片| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲电影在线观看av| 最近中文字幕高清免费大全6| 看片在线看免费视频| 久久精品综合一区二区三区| 中文资源天堂在线| 欧美zozozo另类| 欧美日韩综合久久久久久| 高清毛片免费观看视频网站| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久精品影院6| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产亚洲精品久久久久久毛片| 禁无遮挡网站| 日韩av不卡免费在线播放| 99热全是精品| 在线观看一区二区三区| 亚洲人成网站高清观看| 色综合站精品国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲中文字幕日韩| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲av免费在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 91久久精品国产一区二区三区| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国内精品美女久久久久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲欧美清纯卡通| 黄色日韩在线| 免费观看人在逋| 久久久久久久久中文| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 长腿黑丝高跟| 亚洲美女搞黄在线观看 | 在线看三级毛片| 22中文网久久字幕| 日本欧美国产在线视频| 国产高清不卡午夜福利| 69av精品久久久久久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| av专区在线播放| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产高清激情床上av| 成熟少妇高潮喷水视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久人人爽人人片av| 日韩av不卡免费在线播放| 精品一区二区三区视频在线| 嫩草影视91久久| 国产精品伦人一区二区| 丰满的人妻完整版| 波多野结衣巨乳人妻| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产精品野战在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲av.av天堂| 直男gayav资源| 在线观看一区二区三区| 国产69精品久久久久777片| 日韩av不卡免费在线播放| 国产成人aa在线观看| 国产成人精品久久久久久| 亚洲欧美清纯卡通| 久久精品91蜜桃| 春色校园在线视频观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美日韩国产亚洲二区| 精品久久久久久久久av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲美女视频黄频| 校园春色视频在线观看| av国产免费在线观看| 国产精品伦人一区二区| 深夜a级毛片| 一级av片app| 少妇人妻一区二区三区视频| 成年免费大片在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 在线免费观看不下载黄p国产| 97碰自拍视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 日韩欧美 国产精品| 成人性生交大片免费视频hd| 一区二区三区高清视频在线| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 午夜精品在线福利| 国内精品美女久久久久久| 久久九九热精品免费| 色哟哟哟哟哟哟| 午夜爱爱视频在线播放| av国产免费在线观看| 国产av一区在线观看免费| 成人特级av手机在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品人妻视频免费看| 真实男女啪啪啪动态图| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲av五月六月丁香网| 一进一出抽搐动态| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| a级毛片a级免费在线| h日本视频在线播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器| avwww免费| 联通29元200g的流量卡| 日本爱情动作片www.在线观看 | 美女内射精品一级片tv| 日本免费一区二区三区高清不卡| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 九色成人免费人妻av| 国产成人freesex在线 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产伦精品一区二区三区四那| 91久久精品国产一区二区成人| 国产精品一区二区性色av| 欧美中文日本在线观看视频| 波多野结衣高清作品| 亚洲最大成人中文| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一a级毛片在线观看| 亚洲在线观看片| 69人妻影院| 身体一侧抽搐| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲av美国av| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国内精品宾馆在线| 国产不卡一卡二| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲av一区综合| 免费观看在线日韩| 精品午夜福利视频在线观看一区| 有码 亚洲区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 少妇熟女欧美另类| 日日撸夜夜添| 搞女人的毛片| 欧美色视频一区免费| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产在线男女| 久久午夜福利片| 国产精品福利在线免费观看| 黄色欧美视频在线观看| 色播亚洲综合网| 日日啪夜夜撸| 亚洲在线自拍视频| 丝袜美腿在线中文| 午夜福利在线在线| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲精品亚洲一区二区| 老女人水多毛片| 日本a在线网址| 在线观看av片永久免费下载| 在线播放国产精品三级| 俄罗斯特黄特色一大片| av在线蜜桃| 亚洲国产精品久久男人天堂| 俄罗斯特黄特色一大片| 悠悠久久av| 国产精品永久免费网站| 日韩欧美免费精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲第一电影网av| 午夜亚洲福利在线播放| 在线观看av片永久免费下载| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲七黄色美女视频| 嫩草影视91久久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美zozozo另类| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产av在哪里看| 国产探花在线观看一区二区| 久久午夜福利片| 国产 一区精品| 成人精品一区二区免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 午夜a级毛片| 国产午夜精品论理片| 国产人妻一区二区三区在| 免费av毛片视频| 一个人看视频在线观看www免费| 久久久国产成人免费| 久久久久久伊人网av| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 热99re8久久精品国产|