抵擋湯早期干預對糖尿病大鼠腺苷酸活化蛋白激酶信號通路的影響

任單單，李晶，常柏，李春深，朱子昭

1.天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院，天津 300070；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193

抵擋湯早期干預對糖尿病大鼠腺苷酸活化蛋白激酶信號通路的影響

任單單1，2，李晶1，常柏1，李春深2，朱子昭1

1.天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院，天津 300070；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193

目的觀察不同時期給予抵擋湯干預對糖尿病大鼠血管內(nèi)皮細胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路相關(guān)因子的變化，探討其調(diào)控AMPK信號通路介導的線粒體能量代謝對糖尿病大血管病變防御功能的作用機制。方法采用尾靜脈注射鏈脲佐菌素配合高脂飼料喂養(yǎng)制作糖尿病大鼠模型。實驗大鼠隨機分為正常組、模型組、二甲雙胍組、辛伐他汀組和抵擋湯早、中、晚期組，Western blot檢測胸主動脈內(nèi)皮細胞AMPKα1、過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α（PGC-1α）的蛋白表達，ELISA檢測細胞內(nèi)一磷酸腺苷（AMP）、三磷酸腺苷（ATP）水平，實時熒光定量PCR檢測胸主動脈組織Caspase-3、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、Bcl-2的基因表達。結(jié)果與模型組比較，抵擋湯早、中期組和辛伐他汀組大鼠胸主動脈 AMPKα1、PGC-1α蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；抵擋湯早期組和辛伐他汀組Bcl-2、eNOS基因表達明顯升高（P＜0.05），Caspase-3基因表達明顯降低（P＜0.05）；抵擋湯早期組和辛伐他汀組ATP水平明顯升高（P＜0.05），AMP水平明顯降低（P＜0.05），其中以抵擋湯早期組效果最顯著。結(jié)論抵擋湯早期干預可通過調(diào)控AMPK信號通路，增強血管內(nèi)皮細胞線粒體的能量代謝，從而加強血管內(nèi)皮的防御功能。

抵擋湯；腺苷酸活化蛋白激酶；Caspase-3；能量代謝；早期干預；大鼠

大血管病變是2型糖尿病患者常見的動脈病變，但臨床觀察部分患者在血糖控制理想的情況下，仍發(fā)生嚴重的大血管病變［1］。抵擋湯在《傷寒論》《金匱要略》中均有記載，具有破血逐瘀的功效。本研究組前期實驗發(fā)現(xiàn)，早期應(yīng)用抵擋湯能降低單核細胞趨化蛋白-l、巨噬細胞 CD68、E-選擇素的表達，影響單核/巨噬細胞活化、遷移、黏附，且能降低細胞間黏附分子-1、血管細胞黏附分子-1、血管內(nèi)皮生長因子、人轉(zhuǎn)化生長因子-β1和蛋白激酶C-β2的mRNA在視網(wǎng)膜組織的表達，抑制糖尿病微血管病變的炎癥反應(yīng)［2-3］。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）為能量變化感受器，在糖尿病患者體內(nèi)可觀察到內(nèi)皮祖細胞活性功能受損并伴有AMPK磷酸化減少［4］。本實驗從調(diào)節(jié)AMPK信號通路介導的血管內(nèi)皮細胞能量代謝的角度，在給予干預的不同時期觀察血管內(nèi)皮細胞 AMPK信號通路相關(guān)因子的變化，探討其調(diào)控 AMPK通路介導的線粒體能量代謝對糖尿病大血管病變防御功能的作用機制。

1　實驗材料

1.1動物

健康雄性SD大鼠150只，普通級，4周齡，體質(zhì)量（200.4±2.2）g，天津?qū)嶒瀯游镏行?，合格證號SCXK（津）2014-0001。飼養(yǎng)環(huán)境干燥、通風，室溫25 ℃，相對濕度 60%，自然晝夜光線照明，自由進食飲水。

1.2藥物

抵擋湯（桃仁10 g，大黃6 g，水蛭10 g，虻蟲10 g），飲片購于天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，按傳統(tǒng)工藝制備成水煎劑，減壓濃縮至含原藥材1 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩｛}酸二甲雙胍片，上海施貴寶公司，0.5 g/片，批號20140509；辛伐他汀片，西安楊森制藥有限公司，20 mg/片，批號20140902。

1.3主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司；PCR試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司。血糖儀（拜耳公司），胰島素放免測定試劑盒（天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司），顯微鏡、全自動圖像分析儀（日本奧林巴斯公司），切片機（德國徠卡 Microststems Mussloch公司），熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司），臺式低俗高速離心機（德國Eppendorf公司），電泳儀（北京六一儀器廠），HPIAS-2000型圖像分析軟件（同濟千屏影像工程公司）。

2　實驗方法

2.1分組和造模

大鼠正常適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機抽取15只作為正常組，其余為造模組。采用高脂飼料（20%蔗糖、1%膽固醇、10%豬油、5%蛋黃粉、0.2%膽酸鈉、63.8%普通飼料）喂養(yǎng)8周，內(nèi)眥靜脈取血，檢測空腹血糖和血清胰島素，任選胰島素抵抗大鼠（HOMA-IR指數(shù)判斷大鼠胰島素抵抗）20只為抵擋湯早期組；其余大鼠至12周后，空腹24 h，尾靜脈注射STZ，1周后隨機血糖值＞16.9 mmol/L為2型糖尿病模型制備成功（成模率約 80%），按體質(zhì)量、血糖分層隨機分為抵擋湯早期組、抵擋湯中期組、抵擋湯晚期組、二甲雙胍組、辛伐他汀組和模型組。

2.2干預及標本采集

正常組、模型組予等量無菌飲用水灌胃，抵擋湯早期組于成模前4周予抵當湯原藥材3.24 g/kg灌胃，抵擋湯中期組（3.24 g/kg）、二甲雙胍組（0.36 mg/kg）、辛伐他汀組（2.67 mg/kg）均于成模時（即第12周）灌胃給藥，抵擋湯晚期組（3.24 g/kg）于成模后4周灌胃給藥，每日1次，給藥體積均為1 mL/100 g。至實驗24周結(jié)束，脫頸處死大鼠，迅速剖取大鼠胸主動脈組織，一部分以4%多聚甲醛溶液4 ℃固定，用于普通光學顯微鏡和透射電鏡檢查，另一部分分別放于不同的凍存管中，置于液氮1 d后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于Western blot、PCR和ELISA檢測。

2.3基本指標檢測

觀察大鼠一般狀況，如精神狀態(tài)、皮毛、自由飲食、飲水情況，記錄各組大鼠的體質(zhì)量，并尾靜脈取血檢測隨機血糖。

2.4Western blot檢測腺苷酸活化蛋白激酶α1和過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α蛋白表達

用 SDS堿裂解法裂解大鼠主動脈組織，提取總蛋白，用考馬斯亮藍法測定各細胞樣本蛋白含量；加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液，將樣品至于凝膠孔中，接通電源進行電泳；將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，半干轉(zhuǎn)膜后封閉；加1∶200稀釋的AMPKα1和過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α（PGC-1α）一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋度為1∶3000）進行結(jié)合，洗膜，放入暗盒曝光顯影，用Image J軟件分析灰度值。

2.5實時熒光定量PCR檢測Caspase-3、內(nèi)皮型一氧化氮合酶和Bcl-2基因表達

取約100 mg主動脈組織，超純RNA提取試劑盒提取組織總RNA，取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測RNA的完整性。引物序列：Caspase-3上游5'-TACTGCCGGAGTCTGACTG-3'，下游5'-CTC CAGGAATAGTAACCAGG-3'，產(chǎn)物長度142 bp；內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）上游5'-ACCTACGTGCA AGACCTCC-3'，下游5'-GCTTCATCCAGCTCCATG-3'，產(chǎn)物長度133 bp；Bcl-2上游5'-TGCCACCTGTGGT CCATCTG-3'，下游5'-TGAAGAGTTCCTCCACCA-3'，引物長度112 bp。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：95 ℃預變性10 min，1個循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、20 s，72 ℃、30 s，共45個循環(huán)。擴增完畢后，60～95 ℃進行融解曲線分析，熒光定量分析儀自動采集給出目的基因和對照基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法計算基因表達量。

2.6ELISA檢測一磷酸腺苷、三磷酸腺苷

將加入一定量PBS（pH 7.4）的標本，棄培養(yǎng)液，PBS洗2遍，胰酶消化后吹打成單細胞懸液，按試劑說明進行操作，繪制標準曲線，按曲線方程計算各樣本的濃度值，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。每組取6個樣本，取其平均值。

3　統(tǒng)計學方法

4　結(jié)果

4.1一般狀況結(jié)果

正常組大鼠靈敏、活潑，皮膚有彈性，毛發(fā)光亮柔順；模型組大鼠精神萎靡，倦怠懶惰，反應(yīng)遲鈍，皮膚松弛，毛發(fā)無光澤，并出現(xiàn)多飲、多尿、多食等表現(xiàn)；其他組一般狀況較模型組好轉(zhuǎn)。

4.2抵擋湯對模型大鼠血糖的影響

與正常組比較，模型組大鼠血糖明顯升高（P＜0.01），并出現(xiàn)糖尿病“三多一少”癥狀，提示造模成功；與模型組比較，二甲雙胍組大鼠血糖明顯降低（P＜0.05），其他各組血糖變化不明顯，提示抵擋湯和辛伐他汀對血糖影響不大。結(jié)果見表1。

表1　各組大鼠血糖比較（±s，mmol/L）

表1　各組大鼠血糖比較（±s，mmol/L）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別　只數(shù)　劑量/ （g/kg）　第0周　第12周　第24周正常組　14　5.25±1.25　5.97±1.29　5.85±1.08模型組　15　26.10±3.45**28.34±4.37**27.56±3.21**抵擋湯早期組　16　3.24　27.24±4.25 27.02±5.20 27.81±6.50抵擋湯中期組　12　3.24　27.78±6.60 25.38±7.25 26.22±8.10抵擋湯晚期組　14　3.24　28.11±5.56 26.46±5.34 25.76±6.23二甲雙胍組　12　0.003 6　25.98±3.47#14.67±3.58#10.92±3.60#辛伐他汀組　16　0.026 7　27.95±2.67 27.22±6.45 26.10±7.15

4.3抵擋湯對模型大鼠胸主動脈病理形態(tài)的影響

光鏡觀察結(jié)果顯示，正常組動脈內(nèi)膜相對光滑、完整，內(nèi)皮下有少量脂質(zhì)沉積，中膜平滑肌細胞排列相對整齊，極少量平滑肌細胞變性、壞死，炎細胞浸潤；模型組動脈內(nèi)膜不完整，內(nèi)皮細胞大部分缺失，脂質(zhì)沉積，中膜排列紊亂，大量平滑肌細胞變性、壞死，炎細胞浸潤；抵擋湯早期組和辛伐他汀組動脈內(nèi)膜相對光滑，內(nèi)皮細胞局部缺失，其下有脂質(zhì)沉積，中膜排列整齊，平滑肌變性、壞死少見；抵擋湯中、晚期組和二甲雙胍組動脈內(nèi)膜相對完整，有不同程度的內(nèi)皮細胞缺失及中膜排列稍紊亂，少量平滑肌細胞變性、壞死。結(jié)果見圖1。

圖1　各組大鼠胸主動脈病理形態(tài)（HE染色，×400）

4.4抵擋湯對模型大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞病理形態(tài)的影響

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，正常組內(nèi)皮細胞形態(tài)規(guī)則，彈力膜均勻，平滑肌細胞正常，線粒體結(jié)構(gòu)無異常；模型組可見細胞質(zhì)碎片和空泡，甚至內(nèi)皮細胞溶解消失，彈力膜界限不清排列混亂，平滑肌細胞核不清晰；除二甲雙胍組較模型組改善不明顯，其余各干預組電鏡下呈現(xiàn)細胞的溶解、彈力膜增厚斷裂得到不同程度的改善，線粒體的結(jié)構(gòu)得到不同程度的恢復，其中辛伐他汀組和抵擋湯早期組改善最明顯。結(jié)果見圖2。

圖2　各組大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞病理形態(tài)（Bar=2 μm）

4.5抵擋湯對模型大鼠胸主動脈一磷酸腺苷活化蛋白激酶α1和過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠AMPKα1和PGC-1α蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，抵擋湯早、中期組和辛伐他汀組AMPKα1和PGC-1α蛋白表達明顯升高（P＜0.05），抵擋湯早期組變化較明顯（P＜0.05）。結(jié)果見圖3、表2。

圖3　各組大鼠胸主動脈AMPKα1和PGC-1α蛋白表達免疫印跡電泳圖

表2　各組大鼠胸主動脈AMPKα1和PGC-1α蛋白表達比較（±s）

表2　各組大鼠胸主動脈AMPKα1和PGC-1α蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與抵擋湯早期組比較，△P＜0.05

組別　n　AMPKα1　PGC-1α正常組　6　1.24±0.17　1.16±0.04模型組　6　1.16±0.06**　1.01±0.20**抵擋湯早期組　6　1.27±0.04#　1.20±0.04#抵擋湯中期組　6　1.24±0.78#△　1.14±0.09#△抵擋湯晚期組　6　1.20±0.05△　1.11±0.14△二甲雙胍組　6　1.19±0.05　1.11±0.05辛伐他汀組　6　1.35±0.05#　1.37±0.14#

4.6抵擋湯對模型大鼠胸主動脈Caspase-3、內(nèi)皮型一氧化氮合酶和Bcl-2基因表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠eNOS和Bcl-2基因表達明顯降低（P＜0.01），Caspase-3基因表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，抵擋湯早、中期組和辛伐他汀組eNOS和Bcl-2基因表達明顯升高（P＜0.05），Caspase-3基因表達明顯降低（P＜0.05），抵擋湯早期組變化較明顯（P＜0.05），見表3。各基因?qū)崟r擴增曲線及產(chǎn)物融解曲線見圖4～圖7。

4.7抵擋湯對模型大鼠胸主動脈一磷酸腺苷、三磷酸腺苷水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠胸主動脈AMP水平明顯升高（P＜0.01），ATP水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，抵擋湯早、中期組和辛伐他汀組AMP水平明顯降低（P＜0.05），ATP水平明顯升高（P＜0.05），抵擋湯早期組變化較明顯（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表3　各組大鼠胸主動脈Caspase-3、eNOS、Bcl-2基因表達比較（±s）

表3　各組大鼠胸主動脈Caspase-3、eNOS、Bcl-2基因表達比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與抵擋湯早期組比較，△P＜0.05

組別　n　Caspase-3　eNOS　Bcl-2正常組　6　1.04±0.02　1.06±0.05　1.15±0.07模型組　6　3.05±0.02**　0.58±0.03**　0.82±0.02**抵擋湯早期組　6　2.49±0.04#　1.82±0.04#　2.02±0.04#抵擋湯中期組　6　2.02±0.01#△　2.19±0.03#△　2.55±0.04#△抵擋湯晚期組　6　1.54±0.03△　2.57±0.08△　3.01±0.06△二甲雙胍組　6　1.34±0.03　2.96±0.02　3.21±0.05辛伐他汀組　6　1.33±0.04#　3.20±0.05#　3.45±0.01#

圖4　Bcl-2基因?qū)崟r擴增曲線和產(chǎn)物融解曲線

圖5　eNOS基因?qū)崟r擴增曲線和產(chǎn)物融解曲線

圖6　Caspase-3基因?qū)崟r擴增曲線及產(chǎn)物融解曲線

圖7　內(nèi)參基因?qū)崟r擴增曲線及產(chǎn)物融解曲線

表4　各組大鼠胸主動脈AMP、ATP水平比較（±s）

表4　各組大鼠胸主動脈AMP、ATP水平比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與抵擋湯早期組比較，△P＜0.05

正常組　6　106.7±14.4　60.1±5.5　1.40～2.21模型組　6　136.4±25.3**　42.9±2.4**　2.45～3.99抵擋湯早期組　6　90.2±17.4#　70.2±4.2#　0.97～1.63抵擋湯中期組　6　110.8±18.0#△　60.8±9.4#△　1.29～2.50抵擋湯晚期組　6　106.0±17.6△　54.8±6.1△　1.20～2.22二甲雙胍組　6　103.0±22.4　58.7±4.0　1.28～2.30辛伐他汀組　6　90.7±26.2#　72.1±6.0#　0.82～1.76組別　n　AMP　ATP　AMP/ATP

5　討論

血管內(nèi)皮細胞在維持血管張力、改善炎癥狀態(tài)和平滑肌細胞增殖方面起著關(guān)鍵作用，糖尿病相關(guān)的代謝綜合征導致的內(nèi)皮細胞功能障礙是大血管病變發(fā)展的重要原因。

AMPK是細胞的能量變化感受器，包括α、β、γ亞基，α亞基起催化作用，主要受 AMP/ATP比值的調(diào)節(jié)，AMP/ATP升高，蘇氨酸-172（Thr-172）被上游蛋白磷酸化，同時抑制 Thr-172被絲氨酸磷酸酶PP2Cα去磷酸化，導致AMPK變構(gòu)激活［5-6］。有研究表明，AMPKα2缺失或活性降低對于血管損傷后新生內(nèi)膜的形成發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這有利于血管平滑肌細胞增殖［7-8］。而AMPKα1占總AMPKα活性的大部分，是血管平滑肌細胞主要的亞型，可導致eNOS減少，降低與抗氧化防御相關(guān)基因的表達，增加內(nèi)皮細胞活性氧［9］。其使內(nèi)皮細胞存活的機制為增加細胞內(nèi)ATP含量，從而參與內(nèi)皮細胞屏障修復和血管內(nèi)皮形成［10］。

一氧化氮（NO）是血管內(nèi)皮細胞的重要遞質(zhì)，主要受eNOS調(diào)節(jié)，eNOS生物活性降低會導致內(nèi)皮細胞功能障礙、血管收縮、舒張失衡，促使內(nèi)皮細胞滲透性增加、血小板聚集等，引起動脈粥樣硬化病變［11］。eNOS位于AMPK的下游，是AMPK參與介導血管內(nèi)皮功能改善過程的又一個重要靶點［12-13］。AMPK通過調(diào)節(jié)PGC-1α-核呼吸因子1通路，激活編碼線粒體蛋白的核基因和線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄復制，從而線粒體得以表達，修復受損內(nèi)皮細胞［14］。線粒體通路和死亡受體通路是血管內(nèi)皮細胞凋亡的主要信號轉(zhuǎn)導通路，這兩條通路最終末端都需激活Caspase-3才能引起凋亡，表現(xiàn)為經(jīng)典的染色質(zhì)凝結(jié)和DNA裂解。在線粒體通路中，累積活性氧、活化的促凋亡蛋白等導致線粒體膜滲透功能改變，引起釋放的細胞色素 C（Cyt c）與凋亡蛋白酶活化因子 1、ATP/dATP結(jié)合，活化的Caspase-9再激活下游Caspase-3，引起細胞凋亡［15］。

AMPK激活可抑制高糖引起的血管內(nèi)皮細胞中Caspase-3的活性，減少細胞凋亡［16］。而Bcl-2家族通過與其他凋亡因子相互作用而控制線粒體結(jié)構(gòu)與功能，發(fā)揮細胞凋亡的主開關(guān)作用，其中Bcl-2保持線粒體外膜完整性，增加線粒體質(zhì)子的外流，阻止Cyt c穿過線粒體膜進入細胞質(zhì)，也發(fā)揮抗凋亡的作用［17］。

由此可見，AMPK信號通路的作用較為復雜，涉及大量因子的調(diào)控作用，而AMP、ATP、AMPKα1、Caspase-3、eNOS、PGC-1α和Bcl-2則在通路中作為多個關(guān)鍵調(diào)控點發(fā)揮著重要作用。

抵擋湯主要用于太陽病之下焦蓄血證，《注解傷寒論》載“苦走血，咸勝血，虻蟲、水蛭之咸苦以除蓄血；甘緩結(jié)，苦泄熱，桃仁、大黃之苦以下結(jié)熱”。本研究采用久煎大黃法，以減輕其瀉下作用而增加活血化瘀的功效。現(xiàn)代藥理研究顯示，水蛭和虻蟲具有抗凝血、抗血栓和抗炎的作用；大黃具有很強的抗感染、調(diào)節(jié)免疫、降脂抗炎、止血等多種作用；桃仁可降低血管阻力、改善血流動力學，抗血栓形成，其抗炎鎮(zhèn)痛作用顯著［18］。

糖尿病屬中醫(yī)學“消渴”范疇，其發(fā)病過程以陰虛為本，燥熱為標。陰虛內(nèi)熱，損津耗液，則血脈為之虛澀而成血瘀，瘀血阻絡(luò)，導致臟腑氣機失調(diào)，其引起的心血管并發(fā)癥以動脈粥樣硬化最為常見，這是糖尿病患者致死致殘的主要原因，源自糖尿病的心血管事件導致的死亡率是非糖尿病患者的2～4倍［19］。血管內(nèi)皮參與構(gòu)成血管壁選擇通透性的屏障，還可分泌多種血管活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管功能［20］。

本實驗結(jié)果顯示，抵擋湯早期干預可通過調(diào)控AMP/ATP比值，增加AMPKα1活性，從而開啟AMPK激酶系統(tǒng)，引起eNOS磷酸化，PGC-1α級聯(lián)反應(yīng)，同時抑制Caspase-3活性，升高Bcl-2活性。這可能是抵擋湯調(diào)節(jié)大血管內(nèi)皮細胞的能量代謝，減少內(nèi)皮細胞的凋亡，促進線粒體生成，增強大血管內(nèi)皮防御功能的作用，延緩糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機制。然而，由于 AMPK信號通路調(diào)控機制較為復雜，涉及大量因子在其中發(fā)揮多方面的作用，抵擋湯是否會通過調(diào)節(jié)其他關(guān)鍵因子而影響糖尿病血管功能改變，則需要進一步深入研究。

［1］ EMOFSSON M， SIEGBANN A. Platelet-derived growth factor-BB and monocyte chemotactic protein-1 induce human peripheral blood monocytes to express tissue factor［J］. Thromb Res，1996，83（4）：307-320.

［2］ 常柏，潘從清，孟東，等.抵擋湯對2型糖尿病患者血管內(nèi)皮功能影響的臨床研究［J］.天津中醫(yī)藥，2011，28（6）：457-458.

［3］ 李春深，常柏，苗戎，等.抵擋湯早期干預對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜 ICAM-1 和VCAM-1表達的影響［J］.北京中醫(yī)藥，2013，32（2）：129-134.

［4］ WANG X R， ZHANG M W， CHEN D D， et al. AMP-activated protein kinase rescues the angiogenic functions of endothelial progenitor cells via manganese superoxide dismutase induction in type 1 diabetes［J］. Am J Physiol Endocrinol Metab，2011，300（6）：E1135-E1145.

［5］ HATTORI Y， NAKANO Y， HATTORI S， et al. High molecular weight adiponectin activates AMPK and suppresses cytokine-induced NF-κB activation in vascular endothelial cells［J］. FEBS Letters，2008，582（12）：1719-1724.

［6］ LAGE R. AMPK：a metabolic gauge regulating whole-body energy homeostasis［J］. Trends Mol Med，2008，14（12）：539-549.

［7］ SONG P， WANG S， HE C， et al. AMPKα2 deletion exacerbates neointima formation by upregulating skp2 in vascular smooth muscle cells［J］. Circ Res，2011，109（11）：1230-1239.

［8］ HAN D， YANG B， OLSON L K， et al. Activation of autophagy through modulation of 5'-AMP-activated protein kinase protects pancreatic beta-cells from high glucose［J］. Biochem J，2010，425（3）：541-551.

［9］ MA X， ZHANG J， DENG R， et al. Synergistic effect of smoking with genetic variants in the AMPKα1 gene on the risk of coronary artery disease in type 2 diabetes［J］. Diabetes Metab Res Rev，2014，30（6）：483-488.

［10］ CREIGHTON J， JIAN M， SAYNER S， et al. Adenosine mono- phosphate activated kinaseα1 promotes endothelial barrier repair［J］. FASEB J，2011，25（10）：3356-3365.

［11］ DUDZINSKI D M， MICHEL T. Michel Life history of eNOS：partners and pathways［J］. Cardiovasc Res，2007，75（2）：247-260.

［12］ CHEN Z， PENG I C， SUN W， et al. AMP-activated protein kinase functionally phosphorylates endothelial nitric oxide synthase ser633［J］. Circ Res，2009，104（4）：496-505.

［13］ CHEN Z P， MITCHELHILL K I， MICHELL B J， et al. AMP-activated protein kinase phosphorylation of endothelial NO synthase［J］. FEBS Lett，1999，443（3）：285-289.

［14］ BERGERON R， REN J M， CADMAN K S， et al. Chronic activation of AMP kinase results in NRF-1 activation and mitochondrial biogenesis［J］. Am J Physiol Endocrinol Metab，2001，281（6）：1340-1346.

［15］ SNIGDHA S， SMITE D H， PRIETO G A， et al. Caspase-3 activation as a bifurcation point between plasticity and cell death［J］. Neurosci Bull，2012，28（1）：14-24.

［16］ SUKRITI S， TAUSEEF M， YAZBECK P， et al. Mechanisms regulating endothelial permeability［J］. Pulmonary Circulation，2014，4（4）：535-551.

［17］ HAYASHI T， SAKURAI M， ABE K， et al. Apoptosis of motorneurons with induction of caspases in the spinal cord after ischemia［J］. Stroke，1998，29（5）：1007-1013.

［18］ 沈丕安.中藥藥理與臨床運用［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：407-669.

［19］ DEVEREUX R B， ROMAN M J， PARANICAS M， et al. Impact of diabetes on cardiac structure and function：the strong heart study［J］. Circulation，2000，101（19）：2271-2276.

［20］ RUBANYI G M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases［J］. J Cardiovasc Pharmacol，1993，22（Suppl 4）：S1-14.

Effects of Early Intervention of Didang Decoction on AMP-activated Protein Kinase Signaling Pathway in Diabetic Rats

REN Dan-dan1，2， LI Jing1， CHANG Bai1， LI Chun-shen2， ZHU Zi-zhao1
（1. Metabolic Diseases Hospital， Tianjin Medical University， Tianjin 300070， China； 2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China）

Objective To observe the effects of the intervention of Didang Decoction at different times on changes of AMPK signaling pathway related factors in macrovascular endotheliocytes of diabetic rats； To discuss the mechanism of mitochondria energy metabolism regulating the AMPK signaling pathway for macrovascular endothelial defense function. Methods Injection of STZ into the caudal vein and administration of high fat diet wer used to generate diabetic rat model. All rats were randomly divided into the following 7 groups∶ control， model，metformin， simvastatin， early-， middle-， and late-stage Didang Decoction group. Western blot was used to detect the expressions of APMKα1 and PGC-1α in rat aortic endothelial cells. Changes in the intracellular AMP and ATP levels were detected by ELISA. Real time fluorescence quantitative PCR was used to detected mRNA expressions of Caspase-3， eNOS， and Bcl-2 in tissue of thoracic aorta. Results Compared with the model group， the expressions of AMPKα1 and PGC-1α in the early-stage and middle-stage Didang Decoction group and simvastatin group increased （P＜0.05）； the gene expressions of Bcl-2， and eNOS significantly increased in the early-stage Didang Decoction group and simvastatin group （P＜0.05）， while the expressions of Caspase-3 decreased significantly （P＜0.05）. The expression of ATP increased significantly and the expression of AMP decreased significantly in the early-stage Didang Decoction group and simvastatin group （P＜0.05）， and the best effects were shown in the early-stage Didang Decoction group. Conclusion Early intervention of Didang Decoction can enhance energy metabolism in the mitochondria ofmacrovascular endothelial cells by regulating the AMPK signaling pathway， and then plays a role in strengthening the defense function of macrovascular endothelial cells.

Didang Decoction； AMP-activated protein kinase； Caspase-3； energy metabolism； early intervention； rats

R285.5

A

1005-5304（2016）10-0072-06

2015-12-19）

（

2016-01-05；編輯：華強）

國家自然科學基金（81473622、81273914）；天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研課題（13111）

常柏，E-mail：changbai1972@126.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.017