大型溞ChE和NAGase間接競爭和非競爭ELISA方法的比較

郎倩萍， 李少南， 鄭佳豪， 張文萍

(浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境獨(dú)立研究所，浙江杭州 310029)

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大型溞ChE和NAGase間接競爭和非競爭ELISA方法的比較

郎倩萍， 李少南*， 鄭佳豪， 張文萍

(浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境獨(dú)立研究所，浙江杭州 310029)

[目的]探索間接非競爭ELISA和間接競爭ELISA法測定大型溞ChE和NAGase的試驗(yàn)條件及方法靈敏度。[方法]分別采用間接競爭和間接非競爭ELISA方法測定大型溞ChE和NAGase。[結(jié)果]對于ChE，間接非競爭ELISA的最適抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù)分別為1.466 μg/mL和1∶10 000，靈敏度為7.426 7 ng/mL；間接競爭ELISA的最適抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù)分別為5.277 μg/mL和1∶8 000，靈敏度為0.163 4 ng/mL。對于NAGase，間接非競爭ELISA的最適抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù)分別為8.961 μg/mL和1∶6 000，靈敏度為4.199 9 ng/mL；間接競爭ELISA的最適抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù)分別為6.450 μg/mL和1∶4 000，靈敏度為0.250 8 ng/mL。[結(jié)論]無論是ChE還是NAGase，間接競爭ELISA在最適抗體濃度下的檢測靈敏度均高于間接非競爭ELISA，加之其操作簡便，間接競爭ELISA在生物和環(huán)境樣品ChE和NAGase含量檢測中值得推廣應(yīng)用。

膽堿酯酶;氨基葡糖糖苷酶;間接競爭ELISA；間接非競爭ELISA；大型溞

在水生生態(tài)毒理研究中和環(huán)境監(jiān)測上,人們常利用ChE和NAGase作為農(nóng)藥，特別是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑水體污染的生物指示物[1-2]。因?yàn)樗w中NAGase比較容易失去活性，大型溞體內(nèi)ChE在受到某些刺激下容易高于正常值，所以通過大型溞ChE、NAGase酶活性變化來了解農(nóng)藥對溞類的毒性或作為指示物監(jiān)測農(nóng)藥對水體污染,其結(jié)果存在一定的不準(zhǔn)確性。如果建立ChE、NAGase的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法來測定農(nóng)藥暴露下的溞體內(nèi)ChE含量變化和水環(huán)境中NAGase含量的變化,就可以使結(jié)果更準(zhǔn)確。

劉洪翠等[3-4]建立了大型溞ChE、NAGase的間接非競爭ELISA。間接競爭ELISA方法是利用已知抗原包被固相載體，加入待檢測樣品和限量抗體后，已知抗原與樣品中待檢抗原競爭性結(jié)合限量抗體，不同濃度的待檢抗原對已知抗原與抗體結(jié)合形成不等的抑制率。在一定范圍內(nèi)，該抑制率與待檢樣品濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，因此，可通過抑制率反映出樣品中待檢樣品的濃度[5]。競爭ELISA法常用于檢測食品和藥品中農(nóng)藥殘留、毒素、各種化學(xué)品等有毒有害物質(zhì)[6]。該方法在病毒、特種蛋白等的檢測上取得了很好的成效[7-8]。Wang等[9]建立間接競爭ELISA法用于檢測羊乳中是否摻偽牛乳，最低檢測限為0.35 ng/mL,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12%,適用于檢測高溫高壓處理的乳制品,加之操作簡單高效,應(yīng)用于大規(guī)模高通量樣品篩查及羊乳樣本中牛奶蛋白半定量分析。Xie等[10]制備黃曲霉毒素B1單克隆(AFB_1)抗體,建立間接競爭ELISA檢測方法用于受污染樣品中的AFB_1，檢測限為1.04 mug/L，且特異性高，可用于實(shí)際樣品中黃曲霉毒素B1的快速篩檢。筆者比較了間接非競爭ELISA和間接競爭ELISA法測定大型溞ChE和NAGase的試驗(yàn)條件及方法靈敏度，以期為間接競爭ELISA檢測方法在生物和環(huán)境樣品ChE和NAGase含量檢測中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1抗原和抗體。大型溞ChE：按照楊艷霞的方法[11]分離純化大型溞體內(nèi)的ChE，得到電泳純ChE。大型溞ChE-IgG：由浙江杭州華安生物技術(shù)有限公司制備。以純化的ChE蛋白免疫新西蘭大白兔，得到兔抗ChE多克隆抗血清，純化后得到ChE-IgG，濃度為3.35 mg/mL。大型溞NAGase：按照曾晨杰的方法[4]分離純化大型溞體內(nèi)的NAGase，得到電泳純的NAGase。大型溞NAGase抗體：以純化的NAGase蛋白免疫新西蘭大白兔，得到兔抗NAGase多克隆抗血清，效價(jià)為1∶8 000。

1.1.2試劑。稀釋液:pH 7.4,0.01 mol/L磷酸鹽(PBS)緩沖液。包被液:pH 9.6,0.20 mol/L碳酸鹽(CBS)緩沖液。洗滌液:pH 7.4,0.01 mol/L PBST緩沖溶液,即pH 7.4,0.01 mol/L PBS緩沖液加體積分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫-20。封閉液:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%脫脂奶粉。顯色劑:EL-TMB顯色試劑盒，3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)無色物質(zhì)，作為供氫體，在辣根過氧化物酶作用下，可被氧化生成藍(lán)色的產(chǎn)物，主要吸收峰在370和652 nm,加入酸后變黃，在450 nm波長處有最大吸收峰，購自上海生工生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1間接非競爭ELISA試驗(yàn)。

1.2.1.1抗原抗體最適工作濃度的選擇。用方陣試驗(yàn)法對間接非競爭ELISA 法抗體抗原最適工作濃度進(jìn)行選擇,其基本操作如下:用CBS將酶稀釋成不同蛋白質(zhì)濃度后包被于固相載體,每一種包被濃度設(shè)置不同的抗體稀釋倍數(shù),然后按間接非競爭ELISA法的基本步驟進(jìn)行操作。當(dāng)OD450值約為1、抗原抗體用量最少、對照孔的OD450值小于0.1時(shí)，抗原抗體濃度即為最適工作濃度[12]。

1.2.1.2間接非競爭ELISA 法基本操作步驟。包被不同蛋白濃度的酶在96孔酶標(biāo)板,每孔100 μL,裝入保濕盒內(nèi),放入37 ℃培養(yǎng)箱中，靜置2 h,PBST洗滌3次；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的脫脂奶粉封閉,每孔200 μL,裝入保濕盒內(nèi)，放入37 ℃培養(yǎng)箱中,靜置0.5 h，用PBST洗滌3 次；加入經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的脫脂奶粉稀釋的最適濃度抗體100 μL,放入37 ℃培養(yǎng)箱中，靜置1 h,用PBST洗滌3次；加入經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的脫脂奶粉稀釋5 000倍的羊抗兔酶標(biāo)IgG-HRP液100 μL,放入37 ℃培養(yǎng)箱中1 h,PBST洗滌3次；加入顯色劑,每孔100 μL,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 min；每孔加入2 mol/L硫酸50 μL終止反應(yīng),并用Molecular Devices VERSA max microplate reader測定各孔的OD450值[12]。

1.2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。將標(biāo)準(zhǔn)品(純化酶液)用含1 mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.1)稀釋成系列質(zhì)量濃度，按“1.2.1.1”得到的最適抗體稀釋倍數(shù)稀釋抗體，用“1.2.1.2”所示的間接非競爭ELISA方法測定其與系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)的OD450值，用分析軟件CurveExpert 2.2中的Exponential Association(2)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]。

1.2.1.4靈敏度檢測。靈敏度是指該法能夠檢測出待測抗原的最低量，即最小檢出量；測定10個(gè)0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，計(jì)算OD450的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，根據(jù)公式Z=X+2SD

求出最低檢測限，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出Z所對應(yīng)的濃度即為標(biāo)準(zhǔn)品最小檢出量[13]。

1.2.2間接競爭ELISA試驗(yàn)。

1.2.2.1抗原抗體最適工作濃度的選擇。用方陣試驗(yàn)法對間接競爭ELISA 法抗體抗原最適工作濃度進(jìn)行選擇,其基本操作如下:用CBS將酶稀釋成不同蛋白質(zhì)量濃度后包被固相載體,每一種包被濃度設(shè)置不同的抗體稀釋倍數(shù),然后按間接競爭ELISA法的基本步驟進(jìn)行操作。當(dāng)OD450值約為1,抗原抗體用量最少時(shí)的抗原抗體濃度即為最適工作濃度[14]。

1.2.2.2間接競爭ELISA 法基本操作步驟。包被最適濃度的抗原在96孔酶標(biāo)板,每孔100 μL,裝入保濕盒內(nèi),放入37 ℃養(yǎng)箱中靜置2 h,PBST洗滌3次；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的脫脂奶粉封閉,每孔200 μL,裝入保濕盒內(nèi),放入37 ℃培養(yǎng)箱中,靜置0.5 h，用PBST洗滌3次；加入50 μL抗原，再加入經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的脫脂奶粉稀釋的最適濃度抗體50 μL,放入37 ℃培養(yǎng)箱中，靜置1 h,用PBST洗滌3次；加入經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的脫脂奶粉稀釋5 000倍的羊抗兔酶標(biāo)IgG-HRP液100 μL,放入37 ℃培養(yǎng)箱中1 h,PBST洗滌3 次；加入顯色劑,每孔100 μL,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 min；每孔加入2 mol/L硫酸50 μL終止反應(yīng),并用Molecular Devices VERSA max microplate reader測定各孔的OD450值。參考Reinhold Kittelberger的方法并稍作改進(jìn)[14]。

1.2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。將標(biāo)準(zhǔn)品(純化酶液)用含1 mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.1)稀釋成系列質(zhì)量濃度，按“1.2.2.1”得到的最適抗原抗體稀釋倍數(shù)稀釋抗體，用“1.2.2.2”所示的間接競爭ELISA方法測定其與系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)的OD450值，用分析軟件CurveExpert 2.2中的線性模型擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

1.2.2.4靈敏度檢測。靈敏度是指該法能夠檢測出待測抗原的最低量，即最小檢出量；測定10個(gè)0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，計(jì)算OD450的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，根據(jù)公式Y(jié)=[(X-2SD)/X]×100%求出最低檢測限，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出Y所對應(yīng)的濃度即為標(biāo)準(zhǔn)品最小檢出量[15]。

2　結(jié)果與分析

2.1膽堿酯酶間接非競爭ELISA

2.1.1最適抗原抗體濃度。由表1可知，當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)是10 000倍時(shí)，隨著抗原濃度的增加，OD450 nm值也隨之升高，當(dāng)抗原濃度為1.466 μg/mL時(shí)，OD450 nm值約為1.0，以抗原濃度為1.466 μg/mL作為包被原，測定抗體稀釋倍數(shù)對OD450 nm值的影響，隨著抗體稀釋倍數(shù)的增加，OD450 nm值隨之減小，抗體稀釋倍數(shù)為10 000時(shí)OD450 nm值約為1.0，抗體的最適工作濃度為1∶10 000。即當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)為10 000、抗原濃度為1 466 μg/mL時(shí)達(dá)到了抗原抗體用量最少，OD450nm值約為1.0。

表1　ChE間接非競爭ELISA法最適抗原抗體濃度測定結(jié)果(OD450 nm值)

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成系列濃度(0～10 μg/mL)，抗體1∶10 000稀釋，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。曲線方程為：Y=1.439 9×(1-e-0.810 6x),相關(guān)系數(shù)r=0.985 4,標(biāo)準(zhǔn)誤差S=0.271 6。

2.1.3靈敏度。由“2.1.2”標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式可得出ChE間接非競爭ELISA的靈敏度為7.426 7 ng/mL (X=0.006 4,2SD=0.002 1)。

2.2膽堿酯酶間接競爭ELISA

2.2.1最適抗原抗體濃度。由表2可知，當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)是8 000倍時(shí)，隨著抗原濃度的減小，OD450 nm值也隨之降低，當(dāng)抗原濃度為5.277 μg/mL時(shí)，OD450 nm值約為1.0。以抗原濃度為5.277 μg/mL作為包被原，測定抗體稀釋倍數(shù)對OD450 nm值的影響，隨著抗體稀釋倍數(shù)的增加，OD450 nm值隨之減小，抗體稀釋倍數(shù)為8 000時(shí)OD450 nm值約為1.0，抗體的最適工作濃度為1∶8 000。即當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)為8 000、抗原濃度為5 277 μg/mL時(shí)達(dá)到了抗原抗體用量最少，OD450 nm值約為1.0。

圖1　ChE間接非競爭ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of indirect and non-competitive ELISA for ChE

抗體稀釋倍數(shù)Antiserumdilution抗原濃度Antigenconcentration∥μg/mL13.1908.7906.5905.2704.3902.1901.0900.5001∶20002.4413.1912.7992.3392.5611.8251.2150.5501∶40001.7381.9121.9731.5641.7141.2750.7570.3161∶60001.5991.5731.5031.0751.3630.8060.4720.2601∶80000.8891.2901.3980.9980.8600.7630.4570.2551∶100000.6901.1661.1210.6750.6200.4890.3450.2081∶120000.6560.9210.9520.5710.7230.4650.3210.2291∶140000.8310.6370.8330.5230.6800.4170.3080.2241∶160000.7080.5090.6770.4740.5600.4370.3290.194

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成系列濃度(0～2.5 μg/mL)，抗體1∶8 000稀釋，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=94.261 9-28.717 8X,相關(guān)系數(shù)r=0.995 9,標(biāo)準(zhǔn)誤差S=2.260 0。

圖2　ChE間接競爭ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curve of indirect and competitive ELISA for ChE

2.2.3靈敏度。由“2.2.2”標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式可得出ChE間接競爭ELISA的靈敏度為0.163 4 ng/mL (X=1.008 1,2SD=0.060 7)。

2.3NAGase間接非競爭ELISA

2.3.1最適抗原抗體濃度。由表3可知，當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)是6 000倍時(shí)，隨著抗原濃度的減小，OD450 nm值也隨之降低，當(dāng)抗原濃度為8.961 μg/mL時(shí)，OD450 nm值約為1.0。以抗原濃度為8.961 μg/mL作為包被原，測定抗體稀釋倍數(shù)對OD450 nm值的影響，隨著抗體稀釋倍數(shù)的增加，OD450 nm值隨之減小，抗體稀釋倍數(shù)為6 000時(shí)OD450 nm值約為1.0，抗體的最適工作濃度為1∶6 000。即當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)為6 000、抗原濃度為8 961 μg/mL時(shí)達(dá)到了抗原抗體用量最少，OD450 nm值約為1.0。

表3　NAGase間接非競爭ELISA法最適抗原抗體濃度測定結(jié)果(OD450 nm值)

接下表

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成系列濃度(0～36 μg/mL)，抗體1∶6 000稀釋，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。曲線方程為：Y=1.286 4×(1-e-2.119 1x)，相關(guān)系數(shù)r=0.995 7,標(biāo)準(zhǔn)誤差S=0.048 4。

圖3　NAGase間接非競爭ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(大型溞)Fig.3　Standard curve of indirect and non-competitive ELISA for NAGase

2.3.3靈敏度。由“2.3.2”標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式可得出NAGase間接非競爭ELISA的靈敏度為4.199 9 ng/mL (X=0.009,2SD=0.002 4)。

2.4NAGase間接競爭ELISA

2.4.1最適抗原抗體濃度。由表4可知，當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)是4 000倍時(shí)，隨著抗原濃度的減小，OD450 nm值也隨之降低，當(dāng)抗原濃度為6.450 μg/mL時(shí)，OD450 nm值約為1.0。以抗原濃度為6.450 μg/mL作為包被原，測定抗體稀釋倍數(shù)對OD450 nm值的影響，隨著抗體稀釋倍數(shù)的增加，OD450 nm值隨之減小，抗體稀釋倍數(shù)為4 000時(shí)OD450 nm值約為1.0，抗體的最適工作濃度為1∶4 000。即當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)為4 000、抗原濃度為6.450 μg/mL時(shí)達(dá)到了抗原抗體用量最少，OD450 nm值約為1.0。

表4　NAGase間接競爭ELISA法最適抗原抗體濃度測定結(jié)果(OD450 nm值)

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成系列濃度(0～8 μg/mL)，抗體1∶4 000稀釋，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=90.752 6-12.066 4X,相關(guān)系數(shù)r=0.991 8,標(biāo)準(zhǔn)誤差S=4.871。

圖4　NAGase間接競爭ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　Standard curve of indirect and competitive ELISA for NAGase

2.4.3靈敏度。由“2.4.2”標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式可得出NAGase間接競爭ELISA的靈敏度為0.250 8 ng/mL (X=1.011 3,2SD=0.106 8)。

3　討論

該研究建立了大型溞ChE和NAGase的間接競爭ELISA方法，其靈敏度分別為0.163 4和0.250 8 ng/mL，劉洪翠等[3]曾報(bào)道大型溞ChE間接非競爭ELISA方法的靈敏度為24.000 0 ng/mL。曾晨杰[4]曾報(bào)道大型溞NAGase間接非競爭ELISA方法的靈敏度為2.120 0 ng/mL。該研究比較了ChE和NAGase 的競爭法和非競爭法，結(jié)果表明在靈敏度方面間接競爭法占有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢。

間接競爭ELISA方法是先在固相載體上加入已知抗原，然后加入限量抗體，同時(shí)加入待檢樣品，樣品中待檢抗原與固相載體上包被的已知抗原競爭性結(jié)合抗體,洗滌后，固相載體上只剩下固相已知抗原與抗體結(jié)合物，經(jīng)顯色檢測OD值，計(jì)算待檢抗原的競爭抑制率，通過抑制率反映樣品中待檢抗原的濃度水平。間接競爭ELISA方法的理論基礎(chǔ)是反應(yīng)體系中加入限量抗體，只有在限量抗體基礎(chǔ)上，2種抗原才能形成競爭關(guān)系[15]。

由于ELISA方法靈敏度高，很多因素會(huì)對結(jié)果產(chǎn)生影響。對競爭反應(yīng)體系而言，加樣順序是影響ELISA結(jié)果的重要因素。目前，常用競爭反應(yīng)體系的加樣方式有2種：一種是加待檢樣品(抗原)后加特異性抗體(順序加樣方式)，另一種是先將待檢樣品(抗原)與特異性抗體混合然后加入反應(yīng)板孔(混合加樣方式)。江湖[16]在建立黃曲霉毒素B1 (AFB1) 間接競爭ELISA檢測方法時(shí)比較了2種加樣方式的靈敏度，當(dāng)抑制率為50%時(shí)，順序加樣方式和混合加樣方式檢測AFB1的最低濃度分別為2.5和1.5 ng/mL，即混合加樣方式的靈敏度更高。梁明燕[15]檢測金黃色葡萄球菌腸毒素的間接競爭ELISA的結(jié)果顯示順序加樣和混合加樣方式檢測到的抗原最低濃度分別為5.068和8.905 ng/mL，即順序加樣方式的靈敏度較高。這與江湖[16]的報(bào)道并不一致。這些結(jié)果表明不同的檢測樣品對試驗(yàn)條件要求不同。同一樣品在不同的試驗(yàn)條件下結(jié)果也會(huì)不同。在該試驗(yàn)中，并未很好地摸索競爭ELISA的最適條件，也未比較2種加樣順序是否會(huì)影響靈敏度，或者哪種加樣順序靈敏度高，而是主要比較了間接競爭ELISA和間接非競爭ELISA，2種方法基于相同的包被液、洗滌液和溫育時(shí)間，后續(xù)試驗(yàn)中可以進(jìn)一步摸索間接競爭ELISA的最適試驗(yàn)條件，比較不同條件下ELISA的靈敏度。

4　結(jié)論

ChE間接非競爭ELISA的最適抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù)分別為1.466 μg/mL和1∶10 000，靈敏度為7.426 7 ng/mL；ChE間接競爭ELISA的最適抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù)分別為5.277 μg/mL和1∶8 000，靈敏度為0.163 4 ng/mL；NAGase間接非競爭ELISA的最適抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù)分別為8.961 μg/mL和1∶6 000，靈敏度為4.199 9 ng/mL；NAGase間接競爭ELISA的最適抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù)分別為6.45 ng/mL和1∶4 000，靈敏度為0.250 8 ng/mL；對于大型溞ChE和NAGase，間接競爭ELISA法的靈敏度明顯高于間接非競爭ELISA法。

[1] HANSON M L,LAGADIC L.Chitobiase activity as an indicator of aquatic ecosystem health[J].Aquatic ecosystem health & management,2005,8(4):441-450.

[2] DIAMANTINO T C,ALMEIDA E,SOARES M V M,et al.Characterization of cholinesterases fromDaphniamagnastraus and their inhibition by zinc[J].Environmental contamination and toxicology,2003,71(2):219-225.

[3] 劉洪翠，楊艷霞,李少南.大型溞膽堿酯酶間接非競爭酶聯(lián)免疫吸附定量分析法的建立[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2012,38(3):347-354.

[4] 曾晨杰.大型溞NAGase多克隆抗體檢測水生節(jié)肢動(dòng)物豐度的適用性研究[D].杭州：浙江大學(xué),2012.

[5] 王碩，張鴻雁，王俊平.酶聯(lián)免疫吸附分析方法：基本原理及其在食品化學(xué)污染物檢測中的應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，2011：25-41.

[6] LU S Y,ZHOU Y,LI Y S,et al.Production of monoclonal antibody and application in indirect competitive ELISA for detecting okadaic acid and dinophytoxin-1 in seafood[J].Environmental science and pollution research,2012,19(7):2619-2626.

[7] 李媛媛，劉賓，曹鳳波，等.測定三種乳蛋白抗原性間接競爭ELISA法的建立[J].食品工業(yè),2015,36(3):290-294.

[8] 布冠好,朱婷偉,陳復(fù)生,等.大豆球蛋白間接競爭ELISA檢測方法的建立[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014(4):1-5,11.

[9] WANG S F,ZHANG S W,LAI X T，et al.Detection of adulteration of bovine milk into goat milk by a high specific indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay[J].China dairy industry,2015,43(10):41-43,46.

[10] XIE H,ZHANG X,WANG X，et al.Preparation of anti-aflatoxin B1 monoclonal antibodies and its use in an indirect competitive ELISA for aflatoxin B1[J].Microbiology China,2015,42(10):2033-2040.

[11] 楊艷霞.大型溞膽堿酯酶免疫測定：有機(jī)磷污染的生物指示[D].杭州：浙江大學(xué),2010.

[12] 楊利國，胡少昶，魏平華.酶免疫測定技術(shù)[M].南京:南京大學(xué)出版社，1998：385-481．

[13] KHATTAB A D,ALI L S.Immunoassays for avian butyrylcholinesterase:Implications for ecotoxicological testing and clinical biomonitoring[J].Environmental toxicology and pharmacology,2007,24(3):275-285.

[14] KITTELBERGER R,MCFADDEN A M J,HANNAH M J，et al.Comparative evaluation of four competitive/blocking ELISAs for the detection of influenza A antibodies in horses[J].Veterinary microbiology,2011,148:377-383.

[15] 梁明燕.金葡菌腸毒素表位的串聯(lián)表達(dá)與間接競爭ELISA方法的建立[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[16] 江湖.黃曲霉毒素B1間接競爭ELISA檢測方法的建立與單克隆抗體免疫親和柱的初步研究[D].南昌：南昌大學(xué),2005.

Comparison of Competitive and Non-competitive ELISA for Determination of ChE and NAGase fromDaphniamagna

LANG Qian-ping,LI Shao-nan*,ZHENG Jia-hao et al

(Institute of Pesticide and Environmental Toxicology,Zhejiang University,Hangzhou,Zhejiang 310029)

[Objective] To explore the test condition and method sensitivity of Cholinestersae (ChE) and β-N-Acetyl-D-glucosaminidase (NAGase) fromDaphniamagnaby the methods of competitive and non-competitive ELISA.[Method] ChE and NAGase ofDaphniamagnawere detected by the methods of indirect competitive and non-competitive ELISA,respectively.[Result] As for ChE,the optimal dilutions for the antigen and the antibody were 1.466 μg/mL and 1∶10 000,respectively, and the sensitivity was measured to be 7.426 7 ng/mL if the enzyme was tested by indirect non-competitive ELISA.In case that the enzyme was tested by indirect and competitive ELISA,the optimal dilutions for the antigen and the antibody were 5.277 ug/mL and 1∶8 000,respectively,and the sensitivity was 0.163 4 ng/mL. As for the NAGase,the optimal dilutions for the antigen and the antibody were 8.961 μg/mL and 1∶6 000,respectively,and the sensitivity was 4.199 9 ng/mL if the enzyme was tested by the indirect and non-competitive ELISA.In case that the enzyme was test by indirect and competitive ELISA,the optimal dilutions for the antigen and the antibody were 6.450 μg/mL and 1∶4 000,respectively,and the sensitivity was 0.250 8 ng/mL.[Conclusion] Indirect and competitive ELISA is more sensitive than the non-competitive ELISA under the optimal concentration antigen for both ChE and NAGase.Moreover,it is simple in operation.Thus,indirect and competitive ELISA is worth to be promoted in determining NAGase and ChE content in biological and environmental samples.

ChE; NAGase; Indirect and competitive ELISA; Indirect and non-competitive ELISA;Daphniamagna

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY12B07008)。

郎倩萍(1990- )，女，浙江湖州人，碩士研究生，研究方向：水生生態(tài)毒理學(xué)。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事農(nóng)藥生態(tài)毒理研究。

2016-06-06

S 917.4

A

0517-6611(2016)24-001-05