木薯MeHB2轉(zhuǎn)錄因子的克隆與表達(dá)分析

丁澤紅，付莉莉，鐵韋韋，顏 彥，夏志強(qiáng)，王文泉，胡 偉

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101)

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木薯MeHB2轉(zhuǎn)錄因子的克隆與表達(dá)分析

丁澤紅，付莉莉，鐵韋韋，顏 彥，夏志強(qiáng)，王文泉，胡 偉*

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101)

該研究以木薯(ManihotesculentaCrantz)Ku50為實(shí)驗(yàn)材料，采用RT-PCR方法從葉片中克隆了1個HD-Zip基因MeHB2。MeHB2基因含有882 bp的開放閱讀框，編碼293個氨基酸。蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，MeHB2編碼的蛋白含有Homeodomain、Leu zipper和HD-Zip_N等結(jié)構(gòu)域，屬于HD-Zip II成員。進(jìn)化樹分析表明，MeHB2與麻瘋樹、楊樹和杞柳中同源基因的親緣關(guān)系較近。實(shí)時熒光定量PCR分析表明，低溫脅迫、滲透脅迫、ABA和H2O2均可誘導(dǎo)MeHB2基因的表達(dá)，而鹽脅迫抑制其表達(dá)。此外，MeHB2的表達(dá)量還受到遮蔭脅迫的誘導(dǎo)。研究表明，MeHB2在木薯非生物逆境調(diào)控中扮演重要角色。

木薯；HD-Zip；MeHB2；克隆；基因表達(dá)

木薯(ManihotesculentaCrantz)是重要的糧食作物，是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的熱能來源作物。同大多數(shù)作物一樣，干旱脅迫嚴(yán)重地影響了木薯的生長和發(fā)育(如生長緩慢、光合作用下降等)，導(dǎo)致木薯塊根產(chǎn)量嚴(yán)重減少[1]。此外，隨著全球氣候和植物生長環(huán)境的惡劣變化，低溫、高鹽、遮蔭(密植)等逆境脅迫也嚴(yán)重地影響了木薯的種植，對木薯生產(chǎn)造成了非常嚴(yán)重的損失[2-4]。因此，挖掘和鑒定逆境相關(guān)重要功能基因，深入研究它們在各種逆境脅迫下的表達(dá)變化，對進(jìn)一步提高木薯抗逆能力具有指導(dǎo)意義。

HD-Zip是植物中一類特異的轉(zhuǎn)錄因子，含有高度保守的HD(Homeodomain)結(jié)構(gòu)域和Leu zipper(Zip)元件。根據(jù)HD-Zip結(jié)合的特異性DNA序列和基因結(jié)構(gòu)，HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子可以分為4個亞類[5]。4個亞類的HD-Zip蛋白具有各自不同的功能，在植物生長發(fā)育、形態(tài)建成、生物與非生物脅迫等逆境應(yīng)答中起著非常重要的調(diào)控作用[6-7]。例如，HD-Zip Ⅱ類蛋白與光形態(tài)建成及遮蔭反應(yīng)相關(guān)。AtHB2是擬南芥HD-Zip Ⅱ家族成員之一，在黑暗生長的黃化苗中，AtHB2高度表達(dá)，但紅光(R)和遠(yuǎn)紅光(FR)強(qiáng)烈抑制了它的表達(dá)[8]。在綠色植物中，AtHB2的表達(dá)量受到低R∶FR強(qiáng)烈誘導(dǎo)，這會導(dǎo)致植物的避蔭響應(yīng)，表現(xiàn)為莖伸長、葉片減小等[8-9]。除此之外，HD-Zip Ⅱ家族成員還受干旱、高鹽、ABA和冷害等環(huán)境的誘導(dǎo)，通過參與激素信號途徑來提高植物耐逆性[10]。目前在擬南芥、水稻、玉米和楊樹等許多物種中已鑒定出數(shù)十個HD-Zip家族成員[7]。然而，木薯中有關(guān)HD-Zip基因的研究還很少，這些基因在木薯抗逆脅迫中的響應(yīng)尚不清楚。

本研究從木薯中克隆了1個HD-Zip基因(MeHB2)，對其序列進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析，并在低溫、鹽、甘露醇、ABA、H2O2和遮蔭等多種非生物逆境脅迫下研究其表達(dá)特性，為揭示HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子MeHB2在木薯逆境調(diào)控中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)所用木薯品種Ku50由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 材料種植與處理 將木薯種莖切成長度大約15 cm的莖段，挑選芽眼(3～4個/莖段)且粗細(xì)均勻一致的莖段扦插于塑料盆(高18.8 cm，上直徑18.5 cm，下直徑14.8 cm)中，1莖段/盆?；|(zhì)采用營養(yǎng)土與蛭石以1∶1的體積比進(jìn)行混合。木薯種植約10 d后進(jìn)行間苗，保留1苗/盆。

種植60 d后，選取長勢一致的木薯幼苗作為供試材料。以不處理的木薯為對照，共設(shè)置5個處理：(1)用300 mmol/L甘露醇和200 mmol/L NaCl分別對幼苗進(jìn)行灌根處理0、2和6 h以及3、14、18和24 d；(2)用100 μmol/L ABA和10 mmol/L H2O2分別對幼苗進(jìn)行噴施或灌根處理0、2、6、10、24、48和72 h；(3)4 ℃低溫處理木薯0、2、5、15、48 h后回復(fù)到室溫7和14 d。之后對上述所有時間點(diǎn)的木薯葉片進(jìn)行取樣，抽提RNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。

遮蔭處理的木薯種植于樹蔭底下，其對照處理的木薯種植于室外。2個月后選擇長勢比較一致的植株，分別提取不同葉片(包括未展開葉、第一片完全展開葉和老葉)的RNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。

1.2.2 RNA提取與qRT-PCR 用RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取木薯總RNA。之后用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃儲存。用Primer 6.0設(shè)計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。

用SYBR Green I試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行qRT-PCR，按照操作手冊和反應(yīng)體系在Mx 3005P熒光定量PCR儀(Stratagene公司)上進(jìn)行。每個樣品3次生物學(xué)重復(fù)，按照2-ΔΔCt計算基因相對表達(dá)量[11]。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 用BLASTP搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫獲取其他物種與MeHB2同源性較高的序列；用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和GENSCAN (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)預(yù)測開放閱讀框；用ClustalX進(jìn)行序列比對；用MEGA 5.2軟件構(gòu)建進(jìn)化樹；用ExPASy ProtParam軟件(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)；用CDD數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。

表1 本研究中用到的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 MeHB2基因的克隆

根據(jù)木薯中與擬南芥AtHB2(AT4G16780.1)高度同源的cDNA序列(Manes.01G084500.1)設(shè)計基因特異性引物，以木薯栽培種Ku50葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序后獲得一個長1 191 bp的片段(圖1)，將該基因命名為MeHB2。它包括128 bp的5′-UTR、181 bp的3′-UTR和882 bp的開放閱讀框，該序列編碼293個氨基酸。

Blast結(jié)果表明，MeHB2與Phytozome木薯(栽培品種：AM506)數(shù)據(jù)庫中公布的序列相似性高達(dá)99%。它們之間共有6個堿基的差異，其中4個為非同義突變(圖2)。預(yù)測蛋白質(zhì)的分子量為32 859.0 Da，理論等電點(diǎn)為7.54。蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，MeHB2編碼的蛋白含有Homeodomain(cd00086)和Leu zipper(smart00340)結(jié)構(gòu)域，表明克隆到的MeHB2基因?qū)儆贖D-Zip家族。此外，在N端還發(fā)現(xiàn)了HD-Zip_N(pfam04618)結(jié)構(gòu)域(圖3)，進(jìn)一步表明MeHB2屬于HD-Zip Ⅱ成員。

M. DNA marker；1. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 MeHB2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M. DNA marker；1. Product of PCRFig. 1 PCR amplification result of MeHB2

A. 核苷酸序列；B. 氨基酸序列圖2 MeHB2序列比對A. Nucleotide sequence；B. Protein sequenceFig. 2 Sequence alignment of MeHB2

圖3 MeHB2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析Fig. 3 Protein domain analysis of MeHB2

圖中各分支處數(shù)值表示重復(fù)1 000次Bootstrap值，括號內(nèi)為氨基酸登錄號圖4 MeHB2與其他HB2基因的進(jìn)化樹分析The number at each node represents the Bootstrap value derived from 1 000 replicates, and the accession number of each sequence is given in the bracketFig. 4 Phylogenetic analysis of MeHB2 and other HB2 genes

2.2 MeHB2基因進(jìn)化樹分析

利用MEGA5.2軟件對MeHB2與來自其他物種的同源性較高的氨基酸序列進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果表明，這些序列大致上可以聚類為2組：第I組以C4物種為代表，包括谷子、狗尾草、柳枝稷、玉米和高粱；第Ⅱ組包括白菜型油菜、擬南芥、可可樹、柑橘、麻瘋樹、木薯、楊樹和杞柳。其中木薯與麻瘋樹(XP_012070041.1)、楊樹(Potri.001G155100.1)和杞柳(SapurV1A.0886s0110.1)的親緣關(guān)系較近，氨基酸序列相似度分別達(dá)到84%、78.5%和77.5%。

2.3 MeHB2表達(dá)模式分析

為了研究MeHB2基因?qū)Ω鞣N非生物脅迫的響應(yīng)，我們利用qRT-PCR方法檢測了其在木薯葉片中的表達(dá)量(圖5)。在低溫脅迫處理下，MeHB2的表達(dá)量在2 h有輕微上升，5 h達(dá)到顯著水平，之后在15 h輕微下降，在回復(fù)室溫7 d后達(dá)到最高水平。在甘露醇處理后2 h ～ 18 d，MeHB2的表達(dá)量無明顯變化，但在24 d顯著增強(qiáng)。在NaCl處理下，MeHB2的表達(dá)量均顯著下降了，其中以14和18 d最為明顯，分別下降了86.8%和74.6%。在ABA處理下，MeHB2的表達(dá)量在2 h無明顯變化，6 h顯著增強(qiáng)，之后在10 h下降，直至72 h表達(dá)水平最高。在H2O2處理下，MeHB2的表達(dá)量在2 h顯著下降，在6 h顯著增強(qiáng)，之后再稍微下降，在24～48 h達(dá)到最高表達(dá)水平。這些結(jié)果充分表明，在低溫、滲透脅迫、ABA和H2O2處理?xiàng)l件下，MeHB2基因的表達(dá)水平被顯著誘導(dǎo)，而鹽脅迫強(qiáng)烈地抑制MeHB2基因的表達(dá)。

另外，檢測了MeHB2基因?qū)φ谑a處理的響應(yīng)(圖5)。與對照相比，遮蔭處理后MeHB2在未展開葉中的表達(dá)量有輕微上升，但在第一片完全展開葉和老葉中均顯著地上升，說明MeHB2的表達(dá)量還受到遮蔭處理的誘導(dǎo)。

數(shù)據(jù)用“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，不同小寫字母表示相同處理下不同時間點(diǎn)(或組織)之間差異顯著(P<0.05)圖5 MeHB2在不同脅迫下的表達(dá)模式Data are shown as mean ± standard deviation, and different lowercase letters represent significant difference among different time points (or tissues) under the same treatment (P<0.05)Fig. 5 Expression patterns of MeHB2 gene under different stress treatments

3 討 論

HD-Zip是植物中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育、形態(tài)建成、生物與非生物脅迫等逆境應(yīng)答中起著非常重要的調(diào)控作用[6-7]。HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子是一個龐大的基因家族，在擬南芥、水稻、玉米和楊樹等物種中報道存在33～63個HD-Zip成員[7]。與模式植物相比，木薯基因型高度雜合，其基礎(chǔ)理論研究還相對薄弱。目前木薯中HD-Zip家族成員的數(shù)目尚不清楚，木薯中有關(guān)HD-Zip家族基因的報道也十分有限[12]。在本研究中，我們克隆了一個木薯HD-Zip基因(MeHB2)的全長cDNA序列。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明，MeHB2含有HD-Zip家族保守結(jié)構(gòu)域，如Homeodomain和Leu zipper結(jié)構(gòu)域等。從基因結(jié)構(gòu)上看，MeHB2與擬南芥AtHB2一樣[6]，也屬于HD-Zip Ⅱ家族成員。聚類分析表明，它與麻瘋樹、楊樹和杞柳的同源基因的相似性較高。

AtHB2是第一個在綠色植物中被發(fā)現(xiàn)的受R∶FR誘導(dǎo)的基因[8]。AtHB2反義和超表達(dá)植株分別表現(xiàn)出比野生型較短和較長的下胚軸，呈現(xiàn)典型的避蔭反應(yīng)表型[8]。本研究從木薯中克隆了AtHB2的同源基因MeHB2，并研究了該基因在遮蔭處理下的表達(dá)量變化。如預(yù)期的那樣，MeHB2的表達(dá)量在遮蔭處理(低R:FR)下被強(qiáng)烈誘導(dǎo)了。而且，這種趨勢在成熟的葉片中更加明顯，與擬南芥中報道的AtHB2表達(dá)模式較為相似[13]。

研究表明，HD-Zip Ⅱ基因受到干旱、高鹽等多種逆境脅迫的調(diào)控。如在擬南芥中，HAT2和HAT22的表達(dá)量受干旱誘導(dǎo)上調(diào)[14]；在水稻中，OsHOX11、OsHOX19和OsHOX27的表達(dá)量在干旱條件下上調(diào)或下調(diào)[10]；在復(fù)蘇植物車前草(C.plantagineum)中，CpHB2基因在根中的表達(dá)量受到水分和ABA誘導(dǎo)[15]。本研究中qRT-PCR分析表明，MeHB2的表達(dá)量受到低溫、甘露醇、ABA和H2O2誘導(dǎo)，但受到鹽脅迫處理抑制，說明該基因在多種非生物逆境脅迫條件下參與基因表達(dá)調(diào)控，可以作為木薯抗性育種較為重要的候選基因。這些研究結(jié)果將有助于了解HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子MeHB2在木薯逆境調(diào)控中的作用，為進(jìn)一步研究和解析HD-Zip家族其他成員的功能提供參考。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression ofMeHB2 Transcription Factor in Cassava

DING Zehong, FU Lili, TIE Weiwei, YAN Yan, XIA Zhiqiang, WANG Wenquan, HU Wei*

(Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Science, Haikou 571101, China)

Cassava cultivar ‘Ku50’ was used as experiment materials in this study. A HD-Zip gene,MeHB2, was cloned from leaves of cassava ‘Ku50’ by RT-PCR method. This gene contained 882 bp open reading frame (ORF) encoding 293 amino acids. Protein conserved domain prediction showed thatMeHB2 protein contained several domains such as Homeodomain, Leu zipper and HD-Zip_N, indicating this gene belonged to members of HD-Zip II. Phylogenetic analysis exhibited thatMeHB2 had close genetic relationship with its homologous genes inJatrophacurcas,PopulustrichocarpaandSalixpurpurea. Quantitative real-time PCR analysis revealed that low temperature, osmotic, ABA and H2O2treatments significantly induced the expression ofMeHB2, but salt stress depressed its expression. In addition, the expression ofMeHB2 was also induced by shade stress. The results indicated thatMeHB2 plays important roles in abiotic stress regulation in cassava.

cassava; HD-Zip;MeHB2; cloning; gene expression

1000-4025(2016)08-1522-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.08.1522

2016-04-13;修改稿收到日期:2016-07-06

海南省自然科學(xué)基金(20163120，20153048)

丁澤紅(1982-)，男，博士，助理研究員，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail: dingzehong@itbb.org.cn

*通信作者:胡 偉，博士，副研究員，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail: huwei2010916@126.com

Q785; Q786

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