沙棘種子形成發(fā)育過程中油脂合成積累關(guān)鍵基因的表達(dá)分析

丁 健，阮成江，單金友，關(guān) 瑩

(1 大連民族大學(xué) 資源植物研究所，遼寧大連 116600；2 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 漿果研究所，黑龍江綏棱 152200)

?

沙棘種子形成發(fā)育過程中油脂合成積累關(guān)鍵基因的表達(dá)分析

丁 健1，2，阮成江1*，單金友2，關(guān) 瑩2

(1 大連民族大學(xué) 資源植物研究所，遼寧大連 116600；2 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 漿果研究所，黑龍江綏棱 152200)

為探討沙棘種子油脂積累與相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系，以不同發(fā)育期間(6月25日、7月6日、7月17日、7月28日、8月8日和8月19日)的近緣高油品系‘新俄3號’和低油品系‘綏棘1號’種子為試材，利用氯仿甲醇法測定含油率，采用實(shí)時熒光定量PCR方法分析限速酶基因的表達(dá)模式，驗(yàn)證各基因在天然高低油種子間的表達(dá)差異。結(jié)果表明：(1)除7月17日外，其他時期‘新俄3號’的種子含油率均高于‘綏棘1號’；7月6日～7月28日期間油脂迅速積累，而且‘新俄3號’種子含油率增速大于‘綏棘1號’。(2)油脂迅速積累期的GPD1基因高表達(dá)，可能通過促進(jìn)3-磷酸甘油合成進(jìn)而加速‘新俄3號’種子油脂高積累；油脂積累過程中DGAT1和DGAT2基因在‘新俄3號’種子中的表達(dá)量一直高于‘綏棘1號’。研究認(rèn)為，GPD1、DGAT1和DGAT2基因可能與‘新俄3號’種子油脂的相對高積累有關(guān)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入驗(yàn)證沙棘油脂合成限速酶基因功能奠定基礎(chǔ)。

沙棘；含油率；油脂合成；基因表達(dá)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬多年生灌木或小喬木，其果實(shí)油脂中高積累的omega-3、omega-6和omega-7脂肪酸，在預(yù)防和治療癌癥、冠心病和胃腸疾病等方面具有顯著療效[1]。但較低的含油率(種子為7%～11%，鮮果肉為1%～5%)制約了沙棘油的高效開發(fā)和利用[2-3]，目前關(guān)于沙棘種子油脂合成積累機(jī)制的研究較少，其中的關(guān)鍵基因及代謝途徑尚未清晰[4]。

沙棘油脂的主要成分是甘油三酯(triacylglycerols，TAG)，其含量與種子含油率密切相關(guān)[2,5]。TAG以3-磷酸甘油(glycerol-3-phosphate，G3P)為骨架，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上連續(xù)組裝來自于細(xì)胞溶質(zhì)的acyl-CoA脂肪酸而成[6]，而G3P是由糖酵解的中間產(chǎn)物磷酸二羥丙酮(dihydroxyacetone phosphate，DHAP)被3-磷酸甘油脫氫酶還原而來[7]，GPD1(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)是3-磷酸甘油脫氫酶的編碼基因，它在碳水化合物和脂類代謝中起關(guān)鍵作用[8]，是脂類合成的限速酶[9]。Vigeolas等[7,10]研究發(fā)現(xiàn)注射甘油到油菜(BrassicanapusL)種子中可提高G3P和TAG含量，隨后，在油菜中異位表達(dá)酵母GPD1基因，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量增加2倍可使G3P水平增加3～4倍，種子含油率提高40%，而且G3P含量與種子油脂積累存在協(xié)同關(guān)系。因此，GPD1基因可能是影響沙棘種子含油率的重要基因。以G3P為初始底物的Kennedy途徑是植物種子TAG合成的主要途徑，即G3P經(jīng)3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT)和溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(lyso-phosphatidic acid acyltransferase，LPAAT)酰基化生成磷酯酸(phosphatidic acid，PA)，然后PA經(jīng)磷酸水解酶(phosphohydrolase)脫磷酸化為二酰甘油(diacylglycerol，DAG)，最后經(jīng)二酰甘油轉(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferases，DGAT)?；癁門AG[11]。DGAT是影響脂類積累的限速酶[12-13]，在許多植物體中編碼2類非同源的DGAT基因(DGAT1和DGAT2)[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)DGAT1基因突變體可限制野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)的TAG合成，而過量表達(dá)DGAT1基因可增加種子含油率11%～28%[13]。而DGAT2基因在TAG合成過程中具有使DAG特異結(jié)合某些特殊脂肪酸的作用，如油桐(Verniciafordii)中的桐油酸(eleostearic acid)，其為一種十八碳三烯酸[16]。Chen等[17]將油桐的VfDGAT2基因?qū)爰t酵母(Rhodotorulaglutinis)和擬南芥中，發(fā)現(xiàn)VfDGAT2基因表達(dá)量與總脂肪酸含量線性相關(guān)。因此，DGAT1和DGAT2基因也可能與沙棘種子油脂形成有密切關(guān)系。

本研究以高油品系‘新俄3號’和低油品系‘綏棘1號’種子為試材，分析不同時期的種子含油率，并研究GPD1、DGAT1和DGAT2基因表達(dá)模式及其在高低油種子中的表達(dá)差異，揭示高低油種子的油脂積累與相關(guān)限速酶基因的關(guān)系，這可為深入驗(yàn)證沙棘油脂合成限速酶基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

以2個蒙古沙棘亞種‘新俄3號’(‘Xin’e 3’)和‘綏棘1號’(‘Suiji 1’)為試驗(yàn)材料，二者間基于ISSR標(biāo)記分析的遺傳相似系數(shù)為0.756[18]，果實(shí)分別于2015年6月25日、7月6日、7月17日、7月28日、8月8日和8月19日采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果研究所。各品系樣品采自3株無性繁殖植株的多個部位，同植株果實(shí)混合，用錫紙包裹后置于液氮中速凍。樣品運(yùn)抵大連民族大學(xué)資源植物研究所，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 方 法

1.2.1 種子含油率測定 采用氯仿甲醇法[2,19-20]測定不同時期沙棘種子含油率：冷凍干燥的種子粉末轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，加入甲醇和氯仿(均為色譜純，Honeywell公司)漩渦混勻后超聲30 min，上清液轉(zhuǎn)移到新試管中，殘?jiān)寐确录状?體積濃度百分比2∶1)再次提取，合并的上清液加入其1/4體積的氯化鉀溶液(質(zhì)量濃度0.88%)，收集下層液至玻璃樣品瓶中，揮發(fā)至恒重。含油率(%)=(m1-m2)/m×100；m1為油脂和玻璃樣品瓶的質(zhì)量(g)；m2為玻璃樣品瓶的質(zhì)量(g)；m為干燥樣品粉末的質(zhì)量(g)，3次重復(fù)。

表1 熒光定量RT-PCR引物

1.2.2 熒光定量RT-PCR檢測 參照柱式植物總RNA抽提純化試劑盒(上海生物工程公司)方法提取沙棘種子總RNA，根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(大連寶生物公司)方法合成第一鏈cDNA[21]。

本研究前期構(gòu)建了沙棘種子、果肉、葉、莖和根轉(zhuǎn)錄組，獲得了大量的功能基因注釋以及差異表達(dá)基因信息。利用篩選獲得的目的基因片段和PrimerQuest在線軟件設(shè)計(jì)特異引物(表1)。參照SYBR Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒(大連寶生物公司)方法和ABI7500 Real time PCR儀(美國Applied Biosystems公司)推薦程序進(jìn)行qRT-PCR[11]，以沙棘UBQ5為內(nèi)參基因[4]，采用2-ΔΔCt方法分析目的基因相對表達(dá)量[22]。實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD法進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，采用Excel2010進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘種子形成發(fā)育過程中含油率的動態(tài)變化

與6月25日相比，7月6日后種子明顯增大(圖1)，8月8日后種子體積減小，6月25日～8月8

日期間種子和果實(shí)顏色變化明顯。除7月17日外，其他5個時期的‘新俄3號’種子含油率均高于‘綏棘1號’(圖2)。6月25日～7月6日期間含油率的下降，可能與‘綏棘1號’和‘新俄3號’種子未發(fā)育完全及多糖和蛋白質(zhì)的積累有關(guān)[23]。7月6日～7月17日為‘綏棘1號’的油脂迅速積累期，‘新俄3號’為7月17日～7月28日，且‘綏棘1號’更早進(jìn)入油脂積累穩(wěn)定期。7月28日后‘新俄3號’的種子含油率是‘綏棘1號’的1.2～1.3倍(圖2)。

不同的小寫字母表示同一采收期2個品種間含油率在0.05水平上的顯著差異圖2 ‘新俄3號’和‘綏棘1號’種子形成和發(fā)育過程中含油率變化Different normal letters indicate significant differences of oil content between two lines at the same harvest time at the level of 0.05Fig. 2 Changes of oil contents in the seeds of lines ‘Suiji 1’ and ‘Xin’e 3’ during seed formation and development

圖1 品系‘新俄3號’和‘綏棘1號’果實(shí)和種子形態(tài)和顏色變化Fig. 1 Shape and color of fruits and seeds of lines ‘Suiji 1’ and ‘Xin’e 3’

*表示同一采收期2個品種間的基因相對表達(dá)量在0.05水平上的顯著差異圖3 GPD1、DGAT1和DGAT2基因在‘新俄3號’和‘綏棘1號’種子中的表達(dá)差異* indicates significant differences of gene relative expression level between the two lines on the same harvest time at the level of 0.05Fig. 3 Differences of GPD1, DGAT1 and DGAT2 genes expression in seeds between the line ‘Suiji 1’ and ‘Xin’e 3’

2.2 GPD1、DGAT1和DGAT2基因表達(dá)分析

‘新俄3號’和‘綏棘1號’的GPD1基因表達(dá)量在7月17日達(dá)峰值(圖3，A)，且‘新俄3號’的峰值顯著高于‘綏棘1號’(約1.6倍)。GPD1基因催化合成G3P，油菜的G3P含量達(dá)峰值后的第5～15天，其種子油脂含量才開始迅速上升至峰值[10]?！露?號’的種子含油率在7月28日達(dá)峰值(圖2)，滯后于GPD1表達(dá)量峰值11 d。

7月6日后‘新俄3號’和‘綏棘1號’開始形成完整的種子結(jié)構(gòu)，‘新俄3號’的DGAT1和DGAT2基因表達(dá)量一直高于‘綏棘1號’(圖3，B、C)；而且在7月28日～8月19日期間達(dá)顯著差異水平，與這一期間的‘新俄3號’種子含油率顯著高于‘綏棘1號’相一致。尤其，‘新俄3號’的種子含油率(圖2)和DGAT2基因表達(dá)量均在7月28日達(dá)峰值(圖3，C)。

3 討 論

沙棘種子油脂中亞油酸和亞麻酸比值符合健康食用油的國際標(biāo)準(zhǔn)(1∶1～4∶1)[2,24]，但較低的產(chǎn)量限制了沙棘油的開發(fā)利用。本研究考察了不同時期沙棘高低油種子的含油率，其變化趨勢與麻瘋樹、油菜和芝麻相似[25-27]。沙棘在4月末～5月初授粉后以營養(yǎng)生長為主，且種子結(jié)構(gòu)不完整，需要脂類參與其結(jié)構(gòu)發(fā)育[28]，這可能與發(fā)育初期含油率下降有關(guān)。6月25日～7月28日期間，相對較高GPD1基因表達(dá)量，為TAG的合成積累更多初始底物G3P[7]，進(jìn)而提升種子含油率。在Vigeolas等[10]向油菜種子注射外源甘油的實(shí)驗(yàn)中，G3P含量并未迅速上升，而且油脂含量高峰滯后于G3P高峰15 d。本研究中含油率的變化也滯后于GPD1基因表達(dá)量的變化，6月25日～7月6日期間‘綏棘1號’的GPD1基因表達(dá)量高于‘新俄3號’，可能促進(jìn)‘綏棘1號’積累了更多G3P，使7月17日的含油率高于‘新俄3號’；隨后‘新俄3號’的GPD1基因表達(dá)量超過‘綏棘1號’且達(dá)峰值(7月17日)，促使‘新俄3號’的含油率在7月28日達(dá)峰值且顯著高于‘綏棘1號’，而且在油脂積累穩(wěn)定期兩個品系的種子含油率相差1.2～1.3倍，與GPD1基因表達(dá)量峰值相差倍數(shù)相近(1.6倍)。因此，推測GPD1基因可促進(jìn)沙棘種子油脂合成。近年來，在麻瘋樹(JatrophacurcasL.)和印加果(PlukenetiavolubilisL.)種子中也發(fā)現(xiàn)GPD基因表達(dá)量與TAG含量變化相關(guān)[21,25]。

‘新俄3號’的GPD1和DGAT2基因在油脂迅速積累期間均呈現(xiàn)出明顯的表達(dá)量高峰，且顯著高于‘綏棘1號’，表明GPD1和DGAT2基因在種子發(fā)育期間的高表達(dá)可能促進(jìn)油脂高積累。發(fā)育期的印加果GPD1和DGAT2基因表達(dá)量也呈明顯的單峰曲線變化規(guī)律，且與油脂合成相關(guān)[21]。DGAT1和DGAT2基因具有促進(jìn)脂肪酸參與TAG組裝的作用[11]?！露?號’種子的DGAT1和DGAT2基因表達(dá)量在7月6日～8月19日期間均高于‘綏棘1號’，可催化更多DAG轉(zhuǎn)化為TAG，進(jìn)而使種子含油率高于‘綏棘1號’。發(fā)育期文冠果胚的油脂積累與XsDGAT1和XsDGAT2基因表達(dá)模式相關(guān)，與非轉(zhuǎn)基因植株相比，異源表達(dá)文冠果XsDGAT1和XsDGAT2基因的擬南芥種子油脂含量分別提高71.6(20.3%)和30.9 μg/mg(8.8%)[11]。不同物種和組織對DGAT1和DGAT2基因的響應(yīng)程度存在一定差異，而它們對沙棘種子含油率的影響程度還需要進(jìn)一步驗(yàn)證?！椉?號’和‘新俄3號’有相近的遺傳關(guān)系，均為中國自主選育的蒙古沙棘亞種實(shí)生子代，‘綏棘1號’在黑龍江選育，而‘新俄3號’選育自遼寧，父本的差異也可能是導(dǎo)致‘綏棘1號’種子含油率低于‘新俄3號’的原因。有研究表明沙棘種子油脂含量受父本基因型影響，而父本基因型通過改變C18脂肪酸(尤其亞麻酸)比例來影響TAG[29]，亞麻酸(十八碳三烯酸)是沙棘種子中的主要脂肪酸[2]。Li等[16]發(fā)現(xiàn)油桐中有催化桐油酸(十八碳三烯酸)與TAG特異結(jié)合的DGAT2基因。吳永美等[30]將貓爪草(Doxanthaunguis-cati)的Δ9D(delta-9 desaturase)基因(催化棕櫚酸去飽和為棕櫚油酸)和對棕櫚油酸有特異選擇性的DGAT酶基因在大豆中共表達(dá)發(fā)現(xiàn)，大豆體細(xì)胞胚的棕櫚油酸含量上升到19%，比單獨(dú)轉(zhuǎn)化Δ9D基因高7%。因此在后續(xù)研究中獲得對亞麻酸有特異選擇性的DGAT基因?qū)M(jìn)一步解析沙棘種子油脂合成積累機(jī)理具有重要意義。

阮成江等[31]研究表明TAG的生物合成與“源基因”和“匯基因”相關(guān)，同時調(diào)控GPD1關(guān)鍵限速酶基因(源基因)和DGAT關(guān)鍵酶基因(匯基因)可提高植物種子含油量，二者的相互作用機(jī)制對提高油脂產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要作用。隨后有學(xué)者將脂肪酸的生物合成形容為“推”，將脂肪酸組裝合成TAG形容為“拉”，在煙草中瞬時共表達(dá)擬南芥的WRI1和DGAT1基因可產(chǎn)生協(xié)同作用，轉(zhuǎn)基因煙草的干葉TAG含量可提高約100倍(2.48%)，是轉(zhuǎn)化單一基因的5倍左右[32]。Chen等[17]將油桐的VfFAD2和VfDGAT2基因融合導(dǎo)入紅酵母和擬南芥中，發(fā)現(xiàn)它們具有協(xié)同促進(jìn)不飽和脂肪酸積累的作用，且可獲得更高含量的C18:3(紅酵母中提高174%，擬南芥中提高14.6%)。沙棘種子油脂生物合成途徑復(fù)雜，同時涉及到果肉油脂的合成，這些結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因?qū)ι臣N子油脂積累的影響正在進(jìn)一步的研究驗(yàn)證之中。

[1] CENKOWSKI S, YAKIMISHEN R, PRZYBYLSKI R,etal. Quality of extracted sea buckthorn seed and pulp oil[J].CanadianBiosystemsEngineering, 2006, 48(3): 9-16.

[2] YANG B R, KALLIO H. Fatty acid composition of lipids in sea buckthorn (HippophaerhamnoidesL.) berries of different origins[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry, 2001, 49(4): 1 939-1 947.

[3] RUAN C J, RUMPUNEN K, NYBOM H. Advances in improvement of quality and resistance in a multipurpose crop: sea buckthorn[J].CriticalReviewsinBiotechnology, 2013, 33(2): 126-144.

[4] FATIMA T, SNYDER C L, SCHROEDER W R,etal. Fatty acid composition of developing sea buckthorn (HippophaerhamnoidesL.) berry and the transcriptome of the mature seed[J].PlosOne, 2012, 7(4): e34099.

[5] YANG B R, KALLIO H. Analysis of Triacylglycerols of seeds and berries of sea buckthorn (Hippophaerhamnoides) of different origins by mass spectrometry and tandem mass spectrometry[J].Lipid, 2006, 41(4): 381-392.

[6] RAMLI U S, BAKER D S, QUANT P A,etal. Use of control analysis to study the regulation of plant lipid biosynthesis[J].BiochemicalSocietyTransactions, 2002, 30(6): 1 043-1 046.

[7] VIGEOLAS H, WALDECK P, ZANK T,etal. Increasing seed oil content in oil-seed rape (BrassicanapusL.) by over-expression of a yeast glycerol-3-phosphate dehydrogenase under the control of a seed-specific promoter[J].PlantBiotechnologyJournal, 2007, 5(3): 431-441.

[8] 張 霞, 張 樺, 張富春. 鹽脅迫下鹽穗木甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的表達(dá)與亞細(xì)胞定位分析[J]. 西北植物學(xué)報, 2015, 35(7): 1 283-1 288.

ZHANG X, ZHANG H, ZHANG F C. Subcellular localization and expression of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene fromHalostachyscaspicaunder salt stress[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2015, 35(7): 1 283-1 288.

[9] REMIZE F, BARNAVON L, DEQUIN S. Glycerol export and glycerol-3-phosphate dehydrogenase, but not glycerol phosphatase, are rate limiting for glycerol production inSaccharomycescerevisiae[J].MetabolicEngineering, 2001, 3(4): 301-312.

[10] VIGEOLAS H, GEIGENBERGER P. Increased levels of glycerol-3-phosphate lead to a stimulation of flux into triacylglycerol synthesis after supplying glycerol to developing seeds ofBrassicanapusL. inplanta[J].Planta, 2004, 219(5): 827-835.

[11] GUO H H, WANG T T, LI Q Q,etal. Two novel diacylglycerol acyltransferase genes fromXanthocerassorbifoliaare responsible for its seed oil content[J].Gene, 2013, 527(1): 266-274.

[12] ZHENG P, ALLEN W B, ROESLER K,etal. A phenylalanine in DGAT is a key determinant of oil content and composition in maize[J].NatureGenetics, 2008, 40(3): 367-372.

[13] JAKO C, KUMAR A, WEI Y D,etal. Seed-specific over-expression of anArabidopsiscDNA encoding a diacylglycerol acyltransferase enhances seed oil content and seed weight[J].PlantPhysiology, 2001, 126(2): 861-874.

[14] CASES S, SMITH S J, ZHENG Y,etal. Identification of a gene encoding an acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase, a key enzyme in triacylglycerol synthesis[J].ProceedingsofNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 1998, 95(22): 13 018-13 023.

[15] KROON J T M, WEI W X, SIMON W J,etal. Identification and functional expression of a type 2 acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (DGAT2) in developing castor bean seeds which has high homology to the major triglyceride biosynthetic enzyme of fungi and animals[J].Phytochemistry, 2006, 67(23): 254-259.

[16] LI R, YU K, HILDEBRAND D F.DGAT1,DGAT2 andPDATexpression in seeds and other tissues of epoxy and hydroxy fatty acid accumulating plants[J].Lipids, 2010, 45(2): 145-157

[17] CHEN Y C, CUI Q Q, XU Y J,etal. Effects of tung oilseedFAD2 andDGAT2 genes on unsaturated fatty acid accumulation inRhodotorulaglutinisandArabidopsisthaliana[J].MolecularGeneticsandGenomics, 2015, 290(4): 1 605-1 613.

[18] DING J, RUAN C J, BAO Y H,etal. Analysis of genetic relationships in sea buckthorn (Hippophaerhamnoides) germplasm from China and other countries using ISSR markers[J].JournalofHorticulturalScience&Biotechnology, 2015, 90(6): 599-606.

[19] CHRISTIE W W. Fatty acids and lipids: Structures, extraction and fractionation into classes[M]// Christie W W. Gas Chromatography and Lipids. Glasgow, UK: The Oily Press Ltd., 1989: 11-42.

[20] VUORINEN A L, MARKKINEN N, KALPIO M,etal. Effect of growth environment on the gene expression and lipids related to triacylglycerol biosynthesis in sea buckthorn (Hippophaerhamnoides) berries[J].FoodResearchInternational, 2015, 77(3): 608-619.

[21] WANG X J, LIU A Z, Expression of genes controlling unsaturated fatty acids biosynthesis and oil deposition in developing seeds of Sacha Inchi (PlukenetiavolubilisL.)[J].Lipids, 2014, 49(10): 1 019-1 031.

[22] SCHMITTGEN T D, LIVAK K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J].NatureProtocols, 2008, 3(6): 1 101-1 108.

[23] BOREK S, PUKACKA S, MICHALSKI K,etal. Lipid and protein accumulation in developing seeds of three lupine species:LupinusluteusL.,LupinusalbusL., andLupinusmutabilisSweet[J].JournalofExperimentalBotany, 2009, 60(12): 3 453-3 466.

[24] WALL R, ROSS R P, FITZGERALD G F,etal. Fatty acids from fish: the anti-inflammatory potential of long-chain omega-3 fatty acids[J].NutritionReviews, 2010, 68(5): 280-289.

[25] XU R H, WANG R L, LIU A Z. Expression profiles of genes involved in fatty acid and triacylglycerol synthesis in developing seeds of Jatropha (JatrophacurcasL.)[J].BiomassandBioenergy, 2011, 35(5): 1 683-1 692.

[26] HU Y P, WU G, CAO Y L,etal. Breeding response of transcript profiling in developing seeds ofBrassicanapus[J].BMCMolecularBiology, 2009, 10:49.

[27] 李曉丹, 肖 玲, 吳 剛, 等. 芝麻種子發(fā)育過程中脂肪酸積累模式的研究[J]. 中國油料作物學(xué)報, 2008, 30(1): 84-89.

LI X D, XIAO L, WU G,etal. Accumulation pattern of fatty acids during the seed development of sesame (SesamumindicumL.)[J].ChineseJournalOilCropSciences, 2008, 30(1): 84-89.

[28] BAUD S, BOUTIN J P, MIQUEL M,etal. An integrated overview of seed development inArabidopsisthalianaecotype WS[J].PlantPhysiologyandBiochemistry, 2002, 40(2): 151-160.

[29] OOMAH B D, 土小寧, 陸 海. 沙棘油脂[J]. 國際沙棘研究與開發(fā), 2005, 3(3): 1-10, 14.

OOMAH B D, TU X N, LU H. Sea buckthorn lipid[J].GlobalSeabuckthornResearchandDevelopment, 2005, 3(3): 1-10, 14.

[30] 吳永美, 毛 雪, 王書建, 等. 植物ω-7脂肪酸的系統(tǒng)代謝工程[J]. 植物學(xué)報, 2011, 46(5): 575-585.

WU Y M, MAO X, WANG S J,etal. Systematic metabolic engineering of ω-7 fatty acids in plants[J].ChineseBulletinofBotany, 2011, 46(5): 575-585.

[31] 阮成江, 李 群. 基因調(diào)控種子含油量研究進(jìn)展及生物柴油用海濱錦葵遺傳改良策略[J]. 可再生能源, 2008, 26(4): 35-40.

RUAN C J, LI Q. Status of oil content control in seed by genetic regulation and the strategy for improving the gene ofKosteletzkyafor biodiesel production[J].RenewableEnergyResources, 2008, 26(4): 35-40.

[32] VANHERCKE T, EI TAHCHY A, SHRESTHA P,etal. Synergistic effect ofWRI1 andDGAT1 coexpression on triacylglycerol biosynthesis in plants[J].FEBSLetters, 2013, 587(4): 364-369.

(編輯:宋亞珍)

Expression of Key Genes Involved in Lipid Biosynthesis and Accumulation during Seeds Formation and Development inHippophaerhamnoides

DING Jian1,2, RUAN Chengjiang1*, SHAN Jinyou2, GUAN Ying2

(1 Institute of Plant Resources, Dalian Nationalities University, Dalian, Liaoning 116600, China; 2 Institute of Berries, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Suiling, Heilongjiang 152200, China)

To explore the relationship between lipid biosynthesis and relevant gene expression in sea buckthorn seeds, we harvested the developing seeds of the line ‘Xin’e 3’ with high oil content and the line ‘Suiji 1’ with low oil content as experimental materials on June 25, July 6, 17, 28, August 8 and 19. These two lines had closed genetic relationship. The oil content in seeds was determined by the method of chloroform methanol, and the expression profiles ofGPD1,DGAT1 andDGAT2 genes involved in lipid biosynthesis were tested using real-time quantitative PCR. The results showed that: (1) the oil content in the seeds of ‘Xin’e 3’ was higher than that in ‘Suiji 1’ except for July 17. The rapid accumulations of seed lipid of these two lines were during July 6 to 28, and the increasing rates in ‘Xin’e 3’ were higher than that in ‘Suiji 1’; (2) the high expression ofGPD1 gene occurred in the period of rapid lipid accumulation, which may speed up lipid biosynthesis in ‘Xin’e 3’ seeds through promoting the biosynthesis of glycerol-3-phosphate. The expression levels ofDGAT1 andDGAT2 genes in line ‘Xin’e 3’ were higher than that in line ‘Suiji 1’ during lipid accumulation. Thus,GPD1,DGAT1 andDGAT2 genes may be associated with the high accumulation of lipid in ‘Xin’e 3’ seeds. These results provided scientific bases for validating the function of genes encoding for rate-limiting enzymes involved in sea buckthorn lipid biosynthesis and accumulation.

Hippophaerhamnoides; oil content; lipid biosynthesis; gene expression

1000-4025(2016)08-1642-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.08.1642

2016-05-16;修改稿收到日期:2016-07-12

國家自然科學(xué)基金(31570681)

丁 健(1983-)，男，在讀博士研究生，助理研究員，主要從事資源植物開發(fā)利用與遺傳育種研究。E-mail: mervyntin2901@aliyun.com

*通信作者:阮成江，教授，主要從事木本油料種質(zhì)創(chuàng)新與開發(fā)利用研究。E-mail: ruan@dlnu.edu.cn

Q945.4；Q786

A