甘草次酸修飾細菌纖維素包載紫杉醇口服膠束的構建與評價

耿宇婷，張曉雪，康荷笛，趙修華*

甘草次酸修飾細菌纖維素包載紫杉醇口服膠束的構建與評價

耿宇婷1, 2, 3, 4, 5，張曉雪1, 2, 3, 4, 5，康荷笛1, 2, 3, 4, 5，趙修華1, 2, 3, 4, 5*

1. 東北林業(yè)大學 森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 東北林業(yè)大學化學化工與資源利用學院，黑龍江 哈爾濱 150040 3. 東北林業(yè)大學林業(yè)生物制劑教育部工程中心，黑龍江 哈爾濱 150040 4. 黑龍江省林源活性物質生態(tài)利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040 5. 東北林業(yè)大學生物資源生態(tài)利用國家地方聯合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040

構建一種以肝靶向分子甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）修飾的細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）兩親性納米載體用于紫杉醇（paclitaxel，PTX）口服給藥。以丁二酸酐（succinic anhydride，SA）作為連接臂，將甘草次酸與BC進行偶連，獲得GA-BC），采用紅外光譜法、核磁共振氫譜法對合成產物進行結構表征。通過超聲法制備GA-BC- PTX載藥膠束，再通過粒徑、ζ電位、透射電子顯微鏡及臨界膠束濃度的測定進行表征，采用穩(wěn)定性實驗、體外釋放實驗、MTT、細胞攝取、小鼠活體成像實驗及斑馬魚安全性實驗對該載藥系統進行評價。成功構建GA-BC載體，經過紅外光譜、核磁共振氫譜等檢測證明偶連成功，GA-BC-PTX載藥膠束平均粒徑為（292.4±3.7）nm，表面電位為（?16.8±0.9）mV，載藥量為（17.89±0.61）%，包封率為（59.81±0.73）%，臨界膠束質量濃度為0.063 mg/mL，呈均一球形，制備的載體穩(wěn)定性較好，體外釋放實驗表明該載體能在胃腸道環(huán)境穩(wěn)定存在，MTT實驗表明GA-BC-PTX膠束對HepG2細胞存在明顯抑制作用，并通過共聚焦顯微鏡觀察流式細胞儀分析證明HepG2細胞對GA-BC膠束載尼羅紅的攝取明顯高于游離的尼羅紅。通過對小鼠活體成像證明GA-BC聚合物膠束具有肝靶向作用。通過斑馬魚卵安全性檢測證明當GA-BC載體質量濃度小于2 mg/mL時，聚合物載體基本不具有生物毒性。GA-BC載體具有良好的生物安全性和肝靶向作用，制備GA-BC- PTX口服載藥膠束可以有效抑制肝腫瘤細胞HepG2的生長，為肝癌的靶向治療提供新的思路。

細菌纖維素；甘草次酸；兩親性自組裝膠束；肝靶向；口服遞送；紫杉醇

癌癥一直是嚴重威脅人類生命健康，其中肝癌更是我國高發(fā)惡性腫瘤之一[1]，大多數抗腫瘤藥物如紫杉醇水溶性差（＜1 μg/mL），口服生物利用度較低（＜2%）[2-3]，在體內易被肝臟及免疫系統下清除，不能有效到達病變部位而引發(fā)全身性毒性等副作用[4]。為解決這一難題，本課題組提出將藥物包載于載體內進行輸送，因此，開發(fā)一種高效低毒同時具有靶向性的載體具有重要意義。

近年來，將大分子聚合物改性為兩親性聚合物作為藥物遞送系統受到極大的關注，兩親性聚合物在水中可自組裝形成具有親水外殼和疏水核心的納米膠束，疏水區(qū)可用于包裹疏水藥物，不僅提高了藥物的水溶性，同時可以保護核內藥物在生物介質中的活性[5-7]。細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）又稱β-1,4-葡聚糖，是一種天然高分子聚合物[8]。因其低毒、生物相容性高，制成的醫(yī)用植入物僅引起輕度的炎癥反應等優(yōu)點被廣泛應用于傷口敷料、人工血管和組織再生等[9-13]，同時其獨特的載藥特性具有極大的開發(fā)前景。

甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）是從傳統中藥甘草中提取的一種五環(huán)三萜化合物，是臨床上常用的保肝藥物，甘草次酸具有抗炎、抗病毒、和抗腫瘤作用[14-17]。并且研究發(fā)現肝臟具有甘草次酸特異性結合位點[18]，因此，本研究以甘草次酸作為疏水端同時作為載體的靶向基團，丁二酸酐（succinic anhydride，SA）作為連接臂與親水端BC進行接枝，制成具有優(yōu)良肝靶向的兩親性聚合物載體GA-BC，并負載紫杉醇（paclitaxel）制成口服膠束（GA-BC-PTX），并考察載體的靶向性及GA-BC- PTX初步抗癌效果，為將來肝癌的治療提供重要的依據和方向。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Nexus 670型傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；Avance III HD 500 MHz型核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司；LD-900型超聲波細胞破碎儀，常州零點設備有限公司；Waters 1525型高效液相色譜儀，美國沃特世公司；Zeta PALS型激光粒度儀，美國布魯克海文儀器有限公司；JEM-2100型透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會社；F-7000型熒光分光光度計，日立高新技術公司；Infinite 200 Pro型多功能酶標儀，上海帝肯貿易有限公司；高內涵細胞成像儀，美國BioTek儀器公司；MoFlo Astrios EQ型流式細胞儀，美國貝克曼公司；Scientz-10N型冷凍干燥器，寧波新芝生物科技股份有限公司；IVIS Lumina Series III型活體成像系統，珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司。

1.2 試劑

細菌纖維素，北京美科美生物公司代理Cellulose Lab；甘草次酸（批號A08GS156949，質量分數≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；丁二酸酐（批號20180404）購自國藥集團化學試劑有限公司；四丁基醋酸銨（實驗室自制）；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl，批號D2121158）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-二甲氨基吡啶（DMAP，批號E1923045）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、無水乙醇，分析純，購自天津市富宇精細化工有限公司；紫杉醇（批號NF-20170316，質量分數≥99%）購自西安天豐生物科技公司；尼羅紅（批號C12499771）購自上海麥克林生物有限公司；DIR熒光探針（批號DD0413）購自上海百賽生物技術股份有限公司；四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），批號EZ2811F374，購自德國Biofroxx生物科技公司；色譜乙腈、色譜甲醇均購自湖北弗頓科技技術有限公司。

1.3 動物及細胞

2 方法與結果

2.1 GA-BC聚合物的合成

將1.62 g BC溶于100 mL含四丁基醋酸銨的DMSO溶液中，攪拌至BC完全溶解，制備成均一的BC溶液。稱取4.7 g甘草次酸與1 g 丁二酸酐加入到20 mL DMSO溶液中，于40 ℃下加熱攪拌24 h，加入與甘草次酸同等物質的量的DMAP與EDC進行活化，繼續(xù)攪拌1 h后將上述反應液緩慢滴加入到BC溶液中，混合均勻于40 ℃下繼續(xù)加熱攪拌24 h，反應結束。利用反溶劑沉淀法[19]將反應溶液滴加到自身5倍體積比的無水乙醇中，離心除去上清，用無水乙醇洗滌3～4次，將沉淀溶于蒸餾水攪拌均勻后再次離心取上清，凍干，即得GA-BC聚合物。合成路線見圖1。

圖1 GA-BC合成路線

2.2 GA-BC表征及結果

2.2.1 紅外光譜（IR）檢測及結果 采用IR法分別將BC、甘草次酸、GA-BC聚合物進行表征，IR結果如圖2所示。BC的IR中，3520～3200 cm?1出現寬峰歸屬于BC上的-OH伸縮振動特征峰，2895 cm?1處的吸收峰為C-H的伸縮振動峰，1651 cm?1處歸屬于BC半縮醛基（-C＝O）對稱伸縮振動，1148～993 cm?1為環(huán)上C-O伸縮振動，且C-O的面外彎曲振動造成了893 cm?1處的吸收峰。在甘草次酸IR圖中，3447 cm?1處為-OH伸縮振動特征峰，2936～2868 cm?1為C-H的伸縮振動峰、1709 cm?1處-COOH以及1658 cm?1處C＝O均為甘草次酸的特征峰。與BC和甘草次酸相比，新合成的GA-BC聚合物在保留了BC在3 403.8 cm?1處-OH的特征峰但峰形明顯變窄，表明BC的-OH發(fā)生接枝反應，同時破壞了BC分子內氫鍵，在2875 cm?1處出現-CH2伸縮振動吸收峰外，在1 734.2 cm?1處出現了屬于C＝O伸縮振動峰，吸收峰增強，說明新和成的載體化合物中屬于甘草次酸的-OH與作連接臂的丁二酸酐反應生成了新的酯鍵，在1 161.8 cm?1處出現C-O-C的不對稱吸收峰，證明BC與甘草次酸偶聯成功。

2.2.2 核磁共振氫譜（1H-NMR）檢測及結果 使用CDCl3溶解甘草次酸，D2O溶解GA-BC聚合物載體，溶解后分別移至核磁管中進行1H-NMR分析，圖3-A所示為甘草次酸的1H-NMR譜，0.68～1.35分別為甘草次酸的7個強甲基峰，2.33為H-9單峰特征峰，3.02為H-3的2個二重峰；5.40為H-12的烯氫信號，為單峰，4.31為H-18為β構型，圖3-B為GA-BC聚合物的1H-NMR譜，通過對比，GA-BC聚合物在0.98～1.20處出現了甘草次酸的特征峰，2.63處出現新的吸收峰歸屬于連接臂丁二酸酐上的-CH2CH2-，3.2～4.5處為BC環(huán)狀結構的特征峰證明膠束偶聯成功。

圖2 GA-BC (A)、BC (B) 和甘草次酸(C)的IR圖

圖3 GA (A) 和GA-BC (B) 的1H-NMR圖

2.3 GA-BC與GA-BC-PTX的制備及表征

2.3.1 GA-BC自組裝空白膠束的制備 GA-BC為兩親性聚合物，在水中可自組裝形成納米膠束，稱取定量的GA-BC凍干品溶于蒸餾水中，為了使納米顆粒分散均勻，使用探頭式超聲發(fā)生器在冰浴條件下超聲處理，超聲程序設置為工作4 s停2 s，超聲功率為180 W，每次處理2 min，超聲后過0.45 μm的濾膜，即得自組裝空白膠束。

2.3.2 載藥膠束GA-BC-PTX制備 取10 mg凍干的GA-BC聚合物溶于10 mL蒸餾水中制備成1 mg/mL的GA-BC膠束溶液，稱取2 mg PTX溶于1 mL無水乙醇中，冰浴下滴加到GA-BC膠束溶液中，采用探針型超聲裝置輔助GA-BC膠束對紫杉醇進行包載，混合物在冰浴下超聲20 min后，移至室溫環(huán)境在磁力攪拌器攪拌24 h，揮發(fā)除去乙醇，離心機3000 r/min離心10 min，分離出上清溶液進行冷凍干燥，即得GA-BC-PTX載藥膠束。

持這種理論的人，主要認為應區(qū)別對待“專門用于執(zhí)行專利方法的產品”、“專門用于制造專利商品的零部件或設備”和“專利產品”、“依據專利方法直接獲得的產品”。這些論者一般都認可權利用盡規(guī)則適用于后兩者，而對于前兩者，最多適用默示許可規(guī)則。

2.3.3 膠束粒徑、ζ電位 采用激光粒度電位分析儀來測定的粒徑分布并測其ζ電位。具體為取適量凍干后的GA-BC和GA-BC-PTX樣品加入蒸餾水中，配制成膠束溶液，進行測試，每個樣品測試3次，結果（表1）顯示，GA-BC載體平均粒徑為（287.2±4.4）nm，表面電位為（?19.2±1.2）mV；GA-BC-PTX載藥膠束平均粒徑為（292.4±3.7）nm，表面電位為（?20.3±1.2）mV。

2.3.4 膠束形態(tài)觀察 將GA-BC與GA-BC-PTX膠束溶于蒸餾水中，適當稀釋后滴至滴到碳涂層的200目銅網格上，晾干后用1%磷鎢酸溶液染色，染色2 min后吸取多余的溶液，自然晾干，通過透射電鏡觀察到載體呈球形或類球形，外觀圓整，粒徑分布均勻，見圖4。

2.3.5 穩(wěn)定性考察 取適量GA-BC和GA-BC-PTX用PBS溶解置于西林瓶中，在4 ℃條件下放置7 d進行穩(wěn)定性試驗。分別在0、0.5、1、2、3、5、7 d時取樣測定其粒徑和ζ電位分布。結果如圖5所示，0～7 d的儲存時間段內，GA-BC和GA-BC-PTX的粒徑和電位均無較大變化，說明具有較好的穩(wěn)定性。

表1 GA-BC和GA-BC-PTX的粒徑與ζ電位(, n = 3)

Table 1 Particle size and ζ potential of GA-BC and GA-BC-PTX (, n = 3)

組別粒徑/nmζ電位/mV GA-BC287.2±4.4?19.2±1.2 GA-BC-PTX292.4±3.7?16.8±0.9

圖4 GA-BC (A) 及GA-BC-PTX (B) 的TEM圖

圖5 GA-BC和GA-BC-PTX在不同時間點時的粒徑(A) 和ζ電位(B) (, n = 3)

2.3.6 臨界膠束濃度（CMC）測定 采用熒光探針技術對GA-BC聚合物的CMC進行測定。首先將丙酮配制的芘溶液（0.1 mmol/L）加入試管中，通過氮氣干燥除去丙酮后各加入不同體積的GA-BC母液，蒸餾水定容至10 mL。使所配制的溶液質量濃度分別為3.75、7.50、15.00、20.00、31.25、62.50、100.00、125.00、250.00、500.00 μg/mL。室溫下超聲30 min后，將其在黑暗條件中37 ℃下平衡24 h。通過熒光分光光度計測量熒光強度。激發(fā)波長為340 nm，發(fā)射波長范圍是350～600 nm。芘會被膠束所包裹，環(huán)境的極性發(fā)生變化，第1波段（373 nm，1）和第3波段（391 nm，3）強度的比值也隨之變化，將1/3的值進行擬合，2條切線的交點確定CMC值。經檢測，GA-BC載體在水中的CMC為0.063 mg/mL（圖6），具備良好的抗體液稀釋能力。

2.4 載藥量和包封率的測定

精密稱取2 mg GA-BC-PTX載藥膠束用1 mL蒸餾水溶解，再加入甲醇定容至10 mL，離心機5000 r/min離心10 min，取上清，過0.22 μm有機濾膜，取10 μL進樣高效液相色譜儀進行測定，并按公式計算載藥量和包封率。

載藥量＝1/2

包封率＝1/3

1為測得GA-BC膠束中紫杉醇的含量，2為GA-BC-PTX的總質量，3為紫杉醇的總投藥量

圖6 GA-BC的CMC圖

紫杉醇的含量測定色譜條件[20]：色譜柱為Diamonsil C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-乙腈-水（40∶30∶30）；體積流量1 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。建立關于紫杉醇對照品質量濃度（）和峰面積積分值（）線性回歸方程＝24 022＋6 677.3，2＝0.999 8，經HPLC法測得GA-BC-PTX載藥膠束樣品的載藥量為（17.89±0.61）%，包封率為（59.81±0.73）%（＝3）。

2.5 體外釋放考察

采用透析袋法考察紫杉醇原藥和GA-BC-PTX膠束溶液的體外釋藥情況。采用pH 1.2，含0.5%聚山梨酯-80的鹽酸溶液的人工胃液，和pH 6.8含0.5%聚山梨酯-80的磷酸鹽緩沖液的人工腸液作為釋放介質模擬胃腸道環(huán)境，分別將0.4 mg紫杉醇、GA-BC-PTX（含紫杉醇0.4 mg）置于透析袋（截留相對分子質量3500）中，浸入200 mL人工胃液（或腸液），在體系溫度為37 ℃的恒溫磁力攪拌器中攪拌，轉速為100 r/min，分別在5、10、15、20、25、30、60、120、240、360、480、720 min以及24 h時間點取樣1 mL，同時補充1 mL相同基質的空白人工胃液（或腸液），取出的樣品經離心后取上清液，用0.22 μm有機濾膜濾過后，采用高效液相色譜儀檢測紫杉醇的含量并計算藥物的累積釋放率，每組平行3次。

紫杉醇原藥和GA-BC-PTX載藥膠束在人工胃液及人工腸液中的釋放曲線如圖7所示。游離的紫杉醇原藥在0～6 h時間段內累積釋放率隨著時間的增長有明顯提高，6～24 h時間段內累積釋放率的變化趨于平緩。GA-BC-PTX中紫杉醇的釋放率在0～2 h時間段內隨著時間的增長累積釋放率有明顯提高和紫杉醇原藥較為相似，而2～6 h表現為紫杉醇緩慢釋放，之后趨于平緩，紫杉醇原藥在人工胃液及人工腸液中至24 h的累積釋放率分別為20.81%和24.36%，釋放趨勢基本相同，在人工胃液累積釋放率稍高于人工腸液，GA-BC-PTX在人工胃液及人工腸液中至24 h的累積釋放率分別為11.81%和8.01%，載藥膠束的累積釋放率明顯低于紫杉醇原藥，表明載藥膠束（GA-BC-PTX）結構穩(wěn)定能夠承受酸性條件和胃腸道的稀釋，可將藥物穩(wěn)定地包載在納米膠束的內部，提高了紫杉醇經胃腸道進入人體的穩(wěn)定性。

圖7 紫杉醇與GA-BC-PTX在人工胃液及人工腸液中的累積釋放率(, n = 3)

2.6 MTT實驗

通過MTT法評價GA-BC空白膠束及GA-BC- PTX載藥膠束的抗癌活性。取對數生長期的HepG2細胞接種于96孔板中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細胞貼壁情況良好后吸走孔內培養(yǎng)基，將GA-BC空白膠束及GA- BC-PTX載藥膠束質量濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL的溶液分別加入HepG2細胞系培養(yǎng)24 h。利用MTT法測量570 nm處的吸光度（）值，根據公式計算細胞抑制率。

細胞抑制率＝1－實驗/對照

對照組為給藥為與膠束同等體積的純化水

實驗結果如表2所示，游離紫杉醇的質量濃度在1.0～10.0 μg/mL時，對HepG2細胞的抑制率隨著藥物質量濃度的增大而呈現顯著增長，而質量濃度增長到100.0 μg/mL時對HepG2細胞的抑制率并未隨著藥物質量濃度的增加而顯著增長，同時也未隨著孵育時間的延長而抑制效果增加。這可能由于紫杉醇為疏水性藥物，溶解度極差且粒徑較大不利于細胞的攝取，多數通過被動擴散進入細胞。而實驗組顯示出良好的腫瘤細胞抑制性，隨藥物質量濃度的上升，抑制率也逐步增加，GA-BC-PTX負載的紫杉醇質量濃度為100.0 μg/mL時，HepG2細胞24 h時的抑制率為79.7%，48 h時細胞抑制率為87.5%，抑制效果隨著時間的延長而增加，可能由于GA-BC-PTX納米載藥膠束具有較小的粒徑有助于細胞對藥物的攝取，實現藥物在細胞內的累積，GA修飾后能存在對肝癌細胞的主動靶向，很大程度的提高了紫杉醇的抗癌活性。

表2 不同質量濃度的紫杉醇與GA-BC-PTX載藥膠束與HepG2細胞孵育24 h和48 h的細胞抑制率(, n = 3)

Table 2 Rate of cellular inhibition of different concentrations of PTX and GA-BC-PTX loaded micelles incubated with HepG2 cells for 24 h and 48 h (, n = 3)

紫杉醇質量濃度/(μg?mL?1)細胞抑制率/% 24 h48 h 紫杉醇GA-BC-PTX紫杉醇GA-BC-PTX 1.017.9947.7837.0955.88 2.537.8056.0648.5165.56 5.054.1864.7854.9870.92 10.060.5070.2861.8677.51 25.063.7473.8865.6780.38 50.064.6276.8766.9584.56 100.066.5779.7269.0287.55

2.7 細胞攝取

以尼羅紅（Nile Red，NR）作為疏水性熒光探針通過超聲將其負載入GA-BC聚合物中，游離尼羅紅作為陽性對照組，PBS溶液為空白對照組。取對數生長期的HepG2細胞接種于24孔板中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細胞貼壁情況良好后吸走孔內培養(yǎng)基，每孔加入200 μL載有尼羅紅的GA- BC-NR膠束溶液，以含有相同含量的尼羅紅溶液為對照組，每組設4個復孔。分別培養(yǎng)2、4 h后吸棄藥液，用PBS清洗2次，然后用DAPI將細胞核染色10 min，吸棄染液，PBS清洗2次，再加入4%多聚甲醛固定細胞30 min，固定結束吸棄多聚甲醛再用PBS清洗2次，使用高內涵細胞成像儀觀察細胞內熒光分布情況，并通過流式細胞儀對細胞攝取熒光定量分析。

比較2組內熒光強度結果如圖8所示，尼羅紅特有的紅色熒光顯示了藥物的位置，細胞核用DAPI染為藍色。孵育2 h后游離尼羅紅的紅色熒光在細胞質和細胞核中幾乎不可見。相比之下，GA-BC-NR在相同藥量的相同孵育條件下，細胞質中觀察到清晰的紅色藥物熒光。

圖8 孵育2 h和4 h后HepG2細胞攝取游離尼羅紅和GA-BC-NR膠束的高內涵細胞成像圖像(圖中標尺為100 μm)

利用流式細胞儀和SPSS統計學軟件進行熒光定量分析結果如圖9所示，孵育2 h，GA-BC-NR的熒光攝取量是游離的尼羅紅的8.1倍；孵育4 h，游離的尼羅紅熒光強度幾乎未發(fā)生變化，而GA- BC-NR膠束熒光強度明顯增強，HepG2細胞對其的攝取量是游離的尼羅紅的16倍，遠高于游離尼羅紅。結果表明GA-BC納米膠束有助于HepG2細胞對藥物的攝取，由于甘草次酸受體介導，明顯增強了GA-BC膠束對HepG2肝癌細胞的靶向能力，能夠實現藥物在細胞內的富集。

2.8 肝靶向效果評價

由于紫杉醇和載體本身不具有熒光性，因此將近紅外熒光染料DiR作為熒光探針載入GA-BC納米膠束中，通過IVIS Lumina Series III活體成像系統記錄小鼠口服給藥后2、4、6、8、12、24 h全身的熒光分布情況。24 h全身熒光觀察結束后，取出小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟用于體外的成像和定量分析。使用Living Image軟件進行定量分析，測定熒光強度。結果如圖10-A所示，游離DiR主要集中在胃腸道進行循環(huán)消化，在給藥6 h熒光強度最強，此后開始逐漸下降，24 h后幾乎不可見。相比之下，GA-BC-DiR納米膠束給藥2 h進入胃腸道后逐漸被體內吸收，4～6 h肝臟部位熒光信號變強，說明GA-BC-DiR納米膠束可進入肝臟，實現熒光積累。

與同組NR處理比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

圖10 小鼠口服DiR和GA-BC-DiR納米膠束24 h內的體內熒光成像(A)及24 h后的離體器官的熒光成像(B1)和平均熒光強度(B2)(, n = 3)

實驗結束進一步解剖器官的體外熒光圖像及定量分析如圖10-B1、B2所示，在肝臟部位GA-BC- DiR組的熒光強度是游離DiR組的2.65倍，進一步證實負載DiR的GA-BC納米膠束比游離DiR更容易在肝臟積累，表明GA修飾的GA-BC納米膠束對肝臟存在靶向作用，可用于肝臟靶向給藥。

2.9 GA-BC膠束安全性評價

2.9.1 斑馬魚胚胎的準備 挑選健康的斑馬魚雌雄成魚進行追尾交配自然受精，收集受精卵，在顯微鏡下觀察，剔除未受精或已經死掉的魚卵，隨后將其放入（29±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱孵育2～4 h，選取受精后4 hpf（hours postfertilization）后胚胎發(fā)育階段相同的魚卵用于毒性暴露試驗。

2.9.2 斑馬魚胚胎毒性實驗 胚胎發(fā)育至4 hpf時開始加藥處理，將同步發(fā)育的胚胎分選到24孔板內，每孔5枚，小心吸出24孔板中置有斑馬魚胚胎的培養(yǎng)液，沿室壁緩慢輕柔地加入含有不同質量濃度的待測藥物（載體質量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、10.00 mg/mL）配制的胚胎培養(yǎng)液，輕輕分散胚胎，避免聚集，每個質量濃度設置3組相同質量濃度進行平行重復試驗，以單純培養(yǎng)基為空白對照。置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育。分別在受精后24、48、72、96 h時放置顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育情況并記錄實驗結果。

實驗結果表明如圖11所示，在受精24 h時，載體質量濃度在0.01～2 mg/mL時受精卵發(fā)育狀態(tài)正常，48 h開始孵化，通過顯微鏡可以清楚地觀察到受精卵內斑馬魚的頭、腦、尾以及卵黃囊等發(fā)育正常，至72 h斑馬魚脫膜而出，成功孵化為小魚，此時載體質量濃度在2 mg/mL的條件下存在少量魚卵發(fā)育遲緩未脫膜現象，其余均可正常生長發(fā)育，由于10 mg/mL的藥物質量濃度過高，藥液呈現粘稠膠狀，存在藥物毒性使胚胎不能發(fā)育成功，大多數受精卵中的卵黃囊消失，并且斑馬魚卵內部無明顯的頭、腦和尾巴等特征出現，受精卵出現大量死亡情況并逐漸消融。因此，當載體質量濃度低于2 mg/mL時基本對斑馬魚卵的正常發(fā)育生長無毒副作用，可作為安全的藥物遞送載體。

圖11 不同質量濃度的GA-BC對斑馬魚胚胎整體發(fā)育的影響

3 討論

紫杉醇是近些年來經臨床驗證療效最為顯著的抗癌藥物之一，具有廣譜抗腫瘤活性[21-24]，然而由于紫杉醇本身水溶性低，口服生物利用度差并且在體內非特異性分布會對正常細胞造成傷害等原因，使其本身能夠發(fā)揮的療效及臨床使用的安全性受到極大的挑戰(zhàn)。因此提高紫杉醇的療效及靶向性，減少藥物的不良反應，最大限度地提高藥物局部作用仍是新藥開發(fā)的重點方向[25-26]。

本研究選擇GA作為疏水端，對BC進行化學修飾，獲得兩親性聚合物GA-BC。BC具有獨特的超細網狀纖維結構，同時具有高含水率、高結晶度、多微孔性可以容納大量的藥物分子以及便于藥物的持續(xù)釋放等優(yōu)點[27-28]，可作為藥物載體進行開發(fā)。但關于BC用于制備兩親性聚合物鮮有報道，根本原因為雖然BC本質上為親水結構，但其內部強烈的氫鍵作用使其在水和多數有機溶劑中難以溶解，并且BC缺乏靶向性，這限制了BC在藥物遞送上的效率[29-30]。本研究首先通過離子液體四丁基醋酸銨溶液削弱BC分子間氫鍵作用，再通過接枝反應改變BC結構，改善BC的親水性能，同時使BC獲得GA的肝靶向作用，以GA-BC為載體制備負載PTX的口服納米膠束。制成的GA-BC載體臨界膠束質量濃度為0.063 mg/mL，據報道較低的臨界膠束質量濃度（＜0.135 mg/mL）和較小的粒徑（＜500 nm）可通過內吞作用被腸上皮細胞吸收，能有效提高膠束在體液中的抗稀釋能力，增強藥物體內的穩(wěn)定性[31-33]。

胃腸道的生理和物理屏障是阻礙藥物遞送系統吸收的一大難題，通常大多數藥物進入胃腸道就會被分解釋放，難溶性藥物更不易被胃腸道吸收，因此藥物未到達病變部位就被體內代謝和清除，導致血藥濃度無法滿足治療需要[34]。體外釋放實驗分別考察它們在人工胃液和人工腸液2種模擬人工介質中的釋放情況，結果顯示，GA-BC-PTX在人工胃液及人工腸液中在0～2 h內紫杉醇累積釋放率有明顯提高外，2～6 h表現為紫杉醇緩慢釋放，之后膠束的幾乎不釋藥，至24 h的累積釋放率分別為11.81%和8.01%，明顯低于紫杉醇原藥，提示膠束可能以完整膠束形式被胃腸壁細胞攝取從而增強藥物吸收。

腫瘤化療所面臨的另一個挑戰(zhàn)是由于化療藥物體內非特異性分布對正常細胞所造成的傷害[4]。為克服這個問題，設計GA作為肝靶向配體構建靶向膠束。據文獻報道GA具有肝靶向作用并且在肝癌細胞的表達是正常肝組織的1.5～5倍[35]，GA與該位點的結合呈可飽和性、高度特異性。已有研究將GA在多種耐藥癌細胞系以及多種動物模型上進行了測試，均表現出良好的靶向作用[36-39]。因此將GA作為肝靶向配體來進行靶向治療可使藥物準確作用于肝部病變部位，減少藥物對其他器官的損傷[40]。本研究采用細胞攝取和小鼠活體成像考察膠束的主動靶向性，通過高內涵細胞成像系統觀察到2 h HepG2細胞內的GA-BC-NR熒光強度比游離的NR更強，隨著時間延長至4 h，其熒光強度進一步增強，表明更多的膠束進入細胞。

通過流式細胞儀進行熒光定量分析，結果顯示孵育4 h HepG2細胞對GA-BC-NR膠束攝取量是游離尼羅紅的16倍，由此證明GA介導的GA-BC膠束對HepG2肝癌細胞具有靶向能力，能夠實現藥物在細胞內的富集。MTT毒性實驗同時也說明了這一現象，與游離的紫杉醇原藥相比，GA-BC-PTX載藥膠束可以明顯抑制HepG2細胞的活性，初步評價了GA-BC-PTX載藥膠束的抗腫瘤效果。為了進一步驗證GA-BC膠束的靶向性，在小鼠口服給藥后，對其進行活體成像，可以在不同時間節(jié)點觀察藥物在體內吸收分布，結果顯示2～12 h小鼠的腹部區(qū)域存在明顯的熒光，可能是由于GA-BC膠束對腸道表面具有較強的黏附性，增加了藥物在消化系統中的停留時間，12 h后小鼠腹部區(qū)域的熒光由于吸收或消除作用逐漸脫離胃腸系統。

小鼠離體器官熒光成像圖片對比全身熒光定位時可能存在少許誤差，這是由于熒光成像是平面的，體內深層器官或組織被采集的信號將會衰減很多，所以在整體成像過程中不能很好地定位熒光的分布。因此實驗再次對離體器官進行熒光定位及定量分析，結果顯示，GA-BC-DiR載藥膠束已經進入肝臟和脾臟等一些組織或器官的可能在體內停留的時間更長，肝臟處GA-BC-DiR組的熒光強度是游離DiR組的2.65倍，進一步證實了GA-BC聚合物膠束的肝靶向能力，更易使藥物在肝臟累積，提高藥物作用效果。

綜上所述，GA-BC膠束可用于紫杉醇口服遞藥系統的開發(fā)，具有良好的肝臟靶向性和生物安全性可降低紫杉醇非特異性帶來的不良反應，同時針對HepG2細胞，GA-BC-PTX載藥膠束表現出較好的抗腫瘤活性和入胞能力，為肝癌治療提供新思路，具有良好的應用前景。此外，對于紫杉醇口服膠束的抗腫瘤效果仍需進行更系統、深入地研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 俞悅, 黃慧瑤, 吳大維, 等. “十三五”期間中國肝癌藥物臨床試驗進展 [J]. 肝癌電子雜志, 2021, 8(4): 26-30.

[2] 呂冬穎, 黃碩, 沙露平, 等. 載有紫杉醇的氧化還原敏感混合膠束的制備及評價 [J]. 藥學學報, 2020, 55(6): 1320-1326.

[3] 楊富恒, 李國鋒, 李振東, 等. 基于甘草酸為載體的紫杉醇-甘草酸納米膠束的構建和口服生物利用度的評價 [J]. 中國醫(yī)院藥學雜志, 2018, 38(10): 1040-1044.

[4] 陳旭玲, 陳顏, 趙艷麗, 等. 基于前藥構建混合膠束實現紫杉醇/阿霉素共遞送 [J]. 藥物生物技術, 2021, 28(1): 12-20.

[5] Yuan H, Lu L J, Du Y Z,. Stearic acid-g-chitosan polymeric micelle for oral drug delivery:transport andabsorption [J]., 2011, 8(1): 225-238.

[6] 張菊, 魏丹, 張雪, 等. 蝙蝠葛堿復合納米膠束的制備及大鼠體內藥動學研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(8): 2276- 2284.

[7] 趙麗娟, 陳祥娥, 楊敏. 紫杉醇口服給藥系統的研究進展 [J]. 藥物生物技術, 2020, 27(2): 169-172.

[8] 汪麗粉, 李政, 賈士儒, 等. 細菌纖維素性質及應用的研究進展 [J]. 微生物學通報, 2014, 41(8): 1675-1683.

[9] 黃弘軒, 白波, 賴琛, 等. 高分子修飾細菌纖維素細胞相容性的初步研究 [J]. 中華關節(jié)外科雜志: 電子版, 2020, 14(1): 63-67.

[10] Li T, Chen C J, Brozena A H,. Developing fibrillated cellulose as a sustainable technological material [J]., 2021, 590(7844): 47-56.

[11] Silva N H C S, Rodrigues A F, Almeida I F,. Bacterial cellulose membranes as transdermal delivery systems for diclofenac:dissolution and permeation studies [J]., 2014, 106: 264-269.

[12] Shi Z J, Gao X, Ullah M W,. Electroconductive natural polymer-based hydrogels [J]., 2016, 111: 40-54.

[13] R?mling U, Galperin M Y. Bacterial cellulose biosynthesis: Diversity of operons, subunits, products, and functions [J]., 2015, 23(9): 545- 557.

[14] 白文靜, 夏春玉, 李曼, 等. 共遞送IR-780及18β-甘草次酸的還原敏感膠束型納米粒的構建及其抗腫瘤效果評價 [J]. 藥學學報, 2022, 57(1): 211-221.

[15] 王若寧, 柳雨影, 陳健, 等. 甘草酸、甘草次酸的抗腫瘤機制及其作為藥物遞送載體的研究進展 [J]. 中草藥, 2019, 50(23): 5876-5886.

[16] 梁俊杰, 夏國園, 程祖勝, 等. 甘草次酸的肝靶向應用進展 [J]. 廣東醫(yī)學, 2019, 40(17): 2554-2557.

[17] 劉景華, 趙陽, 李賓, 等. 甘草次酸對胃癌細胞SGC7901增殖、凋亡及PI3K-Akt-mTOR通路的影響 [J]. 藥物評價研究, 2020, 43(12): 2444-2449.

[18] 王莎莎, 陳家琦, 王華華, 等. 甘草次酸修飾多西紫杉醇磁性納米粒的制備與表征 [J]. 中國藥房, 2020, 31(19): 2345-2350.

[19] 俞潔. 反溶劑沉淀法制備生物相容性載藥納米粒子及其抗菌應用 [D]. 上海: 華東理工大學, 2021.

[20] 許秋霞, 莊奕筠, 高雅莉, 等. 高效液相色譜法測定紫杉醇血藥濃度的研究進展[J]. 海峽藥學, 2019, 31(8): 100-102.

[21] 陳聰慧, 張佩語. 雙靶向共載紫杉醇及白藜蘆醇納米系統構建及其體外抗多藥耐藥腫瘤研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(2): 395-402.

[22] 李雨澎, 林睿, 母潤紅. 紫杉醇及其聯合用藥抗腫瘤的研究進展 [J]. 吉林醫(yī)藥學院學報, 2021, 42(6): 440- 442.

[23] 馬晶晶, 楊政, 郭惠, 等. 水溶性及靶向性紫杉醇前藥的研究進展 [J]. 中國新藥雜志, 2021, 30(16): 1489- 1497.

[24] 李小江, 趙陽, 牟睿宇, 等. 注射用香菇多糖聯合AC方案和紫杉醇治療晚期三陰性乳腺癌的臨床研究 [J]. 現代藥物與臨床, 2020, 35(1): 26-31.

[25] 鄭婉榕, 賴佛寶. 紫杉醇新劑型研究進展 [J]. 現代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2020, 36(2): 216-219.

[26] 張倩, 楊壇, 黎枰坪, 等. 左旋肉堿修飾的殼聚糖-硬脂酸協載槲皮素口服紫杉醇納米膠束的制備、表征及在體腸循環(huán)研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(21): 5440-5446.

[27] Li G H, Wang L, Deng Y,. Research progress of the biosynthetic strains and pathways of bacterial cellulose [J]., 2022, doi: 10.1093/JIMB/ KUAB071.

[28] Alkhatib Y, Dewaldt M, Moritz S,. Controlled extended octenidine release from a bacterial nanocellulose/poloxamer hybrid system [J]., 2017, 112: 164-176.

[29] Gregory D A, Tripathi L, Fricker A T R,. Bacterial cellulose: A smart biomaterial with diverse applications [J]., 2021, 145: 100623.

[30] Islam S U, Ul-Islam M, Ahsan H,. Potential applications of bacterial cellulose and its composites for cancer treatment [J]., 2021, 168: 301-309.

[31] Gaucher G, Satturwar P, Jones M C,. Polymeric micelles for oral drug delivery [J]., 2010, 76(2): 147-158.

[32] 范曉慧, 趙艷麗, 徐巍, 等. 半胱氨酸修飾的荷載紫杉醇聚離子復合物膠束口服給藥的體內體外研究 [J]. 藥物生物技術, 2015, 22(2): 95-99.

[33] 曹姍, 夏云, 曲虹, 等. 納米技術提高難溶性藥物口服給藥生物利用度 [J]. 吉林醫(yī)學, 2020, 41(1): 206-208.

[34] 趙陽, 劉仁鳳, 竇寅, 等. 自組裝法構建的疏水藥物新型口服遞送系統及其體內外評價 [J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2020, 42(10): 1053-1063.

[35] 韓德恩, 辛玉鳳, 田萍, 等. 甘草次酸修飾大黃素納米結構脂質載體制備及藥動學和肝靶向評價 [J]. 中國醫(yī)院藥學雜志, 2022, 42(2): 136-141.

[36] Tian Q, Wang X H, Wang W,. Self-assembly and liver targeting of sulfated chitosan nanoparticles functionalized with glycyrrhetinic acid [J]., 2012, 8(6): 870-879.

[37] Han X F, Wang Z, Wang M Y,. Liver-targeting self-assembled hyaluronic acid-glycyrrhetinic acid micelles enhance hepato-protective effect of silybin after oral administration [J]., 2016, 23(5): 1818-1829.

[38] Guan Q X, Zhang X, Zhang Y,. Design, synthesis, and characterization of glycyrrhetinic acid-mediated multifunctional liver-targeting polymeric carrier materials [J]., 2020, 35(10): 1236-1248.

[39] Zheng Y, Shi S D, Liu Y R,. Targeted pharmacokinetics of polymeric micelles modified with glycyrrhetinic acid and hydrazone bond in H22 tumor- bearing mice [J]., 2019, 34(1): 141-151.

[40] 魏田田, 周洪偉, 鄔瑞光. 甘草次酸及其衍生物在肝靶向載藥系統中的應用 [J]. 中醫(yī)藥信息, 2016, 33(6): 109-112.

Construction and evaluation of loaded paclitaxel oral micelles by glycyrrhetinic acid-modified bacterial cellulose

GENG Yu-ting1, 2, 3, 4, 5, ZHANG Xiao-xue1, 2, 3, 4, 5, KANG He-di1, 2, 3, 4, 5, ZHAO Xiu-hua1, 2, 3, 4, 5

1. Key Laboratory of Forest Plant Ecology, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China 2. College of Chemistry, Chemical Engineering and Resource Utilization, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China 3. Engineering Research Center of Forest Bio-preparation, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040,China 4. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of ecological utilization of Forestry-based active substances, Harbin 150040, China 5. National and Local Joint Engineering Laboratory for Ecological Utilization of Biological Resources, Northeast Forestry University, Harbin 150040,China

To establish a bacterial cellulose (BC) amphiphilic nanocarrier modified with the liver- targeted molecule glycyrrhetinic acid (GA) for oral administration of paclitaxel (PTX).Using succinic anhydride as a connecting arm, glycyrrhetinic acid is coupled with bacterial cellulose to obtain a glycyrrhizic acid modified bacterial cellulose carrier (GA-BC). The structure of the combination was detected by IR and1H-NMR. The GA-BC-PTX drug-loading micelle was prepared by ultrasonic method, and then characterized by particle size, ζ potential, transmission electron microscopy and critical micelle concentration determination. The drug carrier system was evaluated by stability experiment,release experiment, MTT, cell uptake,imaging experiment in mice and zebrafish safety experiment.In this experiment, the GA-BC carrier was successfully constructed, and the detection of infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy proved that the coupling was successful, the average particle size of the GA-BC-PTX drug-loading micelle was (292.4 ± 3.7) nm, the surface potential was (?16.8 ± 0.9) mV, the drug load was (17.89 ± 0.61)%, the encapsulation rate was (59.81 ± 0.73) %, and the critical micelle concentration was 0.063 mg/mL, which was uniformly spherical, and the prepared carrier stability was good.release showed that the carrier could be stable in the gastrointestinal environment, MTT experiments showed that GA-BC-PTX micelles had a significant inhibitory effect on HepG2 cells, and the uptake of GA-BC-NR micellar by confocal microscopy was shown to be significantly higher than that of free NR. GA-BC polymer mice are shown to have a hepatic targeting effect by imaging mice. Zebrafish safety testing proved that when the GA-BC carrier concentration is less than 2 mg/mL, the polymer carrier is basically not biologically toxic.GA-BC carrier has good biosafety and liver targeting effect, and prepared GA-BC-PTX oral loading micelles can effectively inhibit the growth of hepatic tumor cells HepG2, providing new ideas for targeted therapy of liver cancer.

bacterial cellulose; glycyrrhetinic acid; amphiphilic self-assembly micelles; liver-targeting; oral delivery; paclitaxel

R283.6

A

0253 - 2670(2022)20 - 6451 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.017

2022-04-17

黑龍江省自然科學基金重點項目（ZD2022C001）；黑龍江頭雁創(chuàng)新團隊項目和111計劃（B20088）

耿宇婷（1994—），女，碩士研究生，研究方向為林源活性物質生態(tài)利用。E-mail: 1071122169@qq.com

趙修華（1979—），男，博士，教授，研究方向為植物高值化利用。E-mail: xiuhuazhao@nefu.edu.cn

[責任編輯 鄭禮勝]