• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    重組羧肽酶G2的原核表達(dá)、純化及活性分析

    2016-10-13 13:20:55李樹剛王勇張偉辛渝但國平柴新娟龔會(huì)英于廷和
    生物技術(shù)通報(bào) 2016年3期
    關(guān)鍵詞:酶切位點(diǎn)原核質(zhì)粒

    李樹剛王勇張偉辛渝但國平柴新娟龔會(huì)英于廷和

    (1. 重慶科潤生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司,重慶 401121;2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,重慶 400010)

    重組羧肽酶G2的原核表達(dá)、純化及活性分析

    李樹剛1王勇1張偉1辛渝1但國平1柴新娟1龔會(huì)英1于廷和2

    (1. 重慶科潤生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司,重慶 401121;2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,重慶 400010)

    在原核表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)羧肽酶G2(Carboxypeptidase G2,CPG2)的表達(dá),并對CPG2進(jìn)行了純化和活性測定。通過PCR擴(kuò)增得到編碼CPG2的基因片段,利用基因重組技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-CPG2,在Escherichia coli中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),菌體經(jīng)超聲破碎后利用金屬螯合親和柱和陰離子交換層析柱對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化。目的蛋白能夠以可溶形式表達(dá),SDS-PAGE和Western blotting檢測有特異的蛋白表達(dá)條帶。純化的CPG2有降解氨甲喋吟(MTX)活性,酶活力達(dá)到400 U/mg。

    羧肽酶G2;原核表達(dá);純化;氨甲喋吟

    羧肽酶G2(carboxypeptidase G2,CPG2)是羧肽酶G家族成員之一,最初是從假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株RS-16中分離獲得[1]。羧肽酶G可水解葉酸及其衍生物的C端谷氨酸殘基[2-4]。CPG2在物理特性與動(dòng)力學(xué)特征上與羧肽酶Gl(CPGl)類似,但其對MTX的親和力要高于CPGl。

    CPG2全序列為415個(gè)氨基酸,其中包含一個(gè)25個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列和390個(gè)氨基酸的成熟蛋白序列。CPG2活性分子為同源二聚體,分子量83 kD-84 kD,催化活性需Zn2+。最初CPG2的制備是RS-16發(fā)酵而來,表達(dá)量僅為200-300 U/L,且CPG2表達(dá)量低于菌體總蛋白的0.1%,不能滿足研發(fā)的需要[5,6]。因此,用基因工程的方法生產(chǎn)重組羧肽酶G2是另一選擇。

    CPG2分子無糖基化和二硫鍵,用原核系統(tǒng)表達(dá)是首選。近年CPG2基因已用基因工程的方法表達(dá)重組CPG2[7,8]。在原核系統(tǒng)中表達(dá)量最高可占菌體總蛋白的20%[7,9,10]。CPG2必須以二聚體形式存在才具有完全的生物學(xué)活性[11]。所以,在大腸桿菌中以可溶形式表達(dá)CPG2并能夠自發(fā)形成二聚體,是大腸桿菌表達(dá)CPG2必須考慮的因素。

    為了進(jìn)一步提高CPG2的表達(dá)水平,獲得有活性的目的蛋白,滿足研發(fā)的需要,實(shí)驗(yàn)通過基因工程的方法在大腸桿菌中高效表達(dá)CPG2蛋白,并對其酶學(xué)活性進(jìn)行初步研究,旨在為CPG2的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株和載體 Escherichia coli DH5α和BL21(DE3)、表達(dá)載體pET-30a為本公司保存。

    1.1.2 工具酶、引物和試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和Taq酶等購自大連TaKaRa生物工程有限公司;PCR引物由上海Sangon公司合成;PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA marker、蛋白質(zhì)marker、YNB、生物素、酵母粉、蛋白胨、卡那霉素、EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit、鼠抗His單克隆抗體(一抗)、羊抗鼠HRP-IgG(二抗)、牛血清白蛋白(BSA)購自上海Sangon公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 引物及基因合成 根據(jù)GenBank登錄的CPG2基因序列(登錄號(hào):M12599)進(jìn)行基因合成(上海生工完成)。設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增CPG2 cDNA的特異性上下游引物,上游引物CPG2-F中引入Bgl II酶切位點(diǎn),下游引物CPG2-R引入NotⅠ酶切位點(diǎn),引物由上海Sangon合成(表1)。

    表1 擴(kuò)增目的基因CPG2的PCR引物

    1.2.2 pET-30a-CPG2/BL21(DE3)原核表達(dá)菌株的構(gòu)建和鑒定 以人工合成的CPG2為模板,CPG2-F和CPG2-R為引物,PCR擴(kuò)增該序列,引入Bgl II酶切位點(diǎn)、腸激酶切割位點(diǎn)(DDDDK)和Not I酶切位點(diǎn)。1%瓊脂糖凝膠電泳后,切膠純化回收。將純化的目的基因片段與pET-30a Bgl II和NotⅠ酶切回收后,16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定,證明目的基因片段已正確插入pET-30a載體;質(zhì)粒經(jīng)上海Sangon測序,測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-30a-CPG2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)。

    1.2.3 CPG2在E.coli BL21(DE3)中的重組表達(dá)挑取工程菌pET-30a-CPG2/BL21(DE3)接種到20 mL LB(Kan 50 μg/mL)液體培養(yǎng)基中,37℃,250 r/min,培養(yǎng)過夜。次日,按1%的比例接種母液到200 mL LB(Kan 50 μg/mL)液體培養(yǎng)基,37℃,250 r/min培養(yǎng),OD600達(dá)到0.6后,加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L,30℃繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)4 h。將搖瓶置于冰上5 min,5 000×g,4℃,離心5 min收集菌體。

    1.2.4 CPG2蛋白純化 發(fā)酵液菌體按1∶5(W/W)懸浮于裂解液(20 mmol/L Tirs-HCl,0.2 mmol/L Zn2+,pH8.0)中,超聲破壁,8 000 r/min離心5 min收集上清;破菌液上清上樣于經(jīng)0.2 mol/L NiSO4處理并以20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)平衡的Ni2+Chelating Sepharose Fast Flow 鰲合層析介質(zhì),分別以50 mmol/L和100 mmol/L咪唑(含20 mmol/L Tris-HCl,pH8.0)洗脫,目的蛋白集中于100 mmol/L咪唑洗脫部分;收集的目的蛋白以截留分子量l0 kD離心超濾管超濾脫鹽,置換緩沖為25 mmol/L Tris-HCl(含0.2 mmol/L Zn2+,pH8.0),lowry測定蛋白濃度,按每1 mg蛋白加入0.5 U腸激酶(50 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L CaCl2,0.1% Tween-20,pH8.0)在4℃條件下酶切融合蛋白約16 h;酶切目的蛋白上樣于25 mmol/L Tirs-HCl(pH8.5),0.2 mmol/L Zn2+平衡的Q-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare),用25 mmol/L,Tris-HCl(pH8.5)緩沖液再?zèng)_洗5-6個(gè)柱床體積后,用50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)洗脫雜蛋白,再以0.1 mol/L Tris-HCl,pH7.5,0.2 mmol/L Zn2+一次性洗脫目的蛋白,收集洗脫蛋白峰。SDSPAGE檢測分子量約為42 kD,純度大于95%。

    1.2.5 免疫印跡分析 純化的帶有His標(biāo)簽的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉2 h,滴加鼠抗 His一抗(1∶300)(上海生工),4℃孵育過夜,TBST 洗膜3次,再滴加HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體(1∶1 000)(上海生工),37℃孵育2 h,TBST和PBS各洗膜3次,用濾紙吸干膜表面。利用DAB試劑盒進(jìn)行顯色。

    1.2.6 生物活性分析 取2.82 mL 0.l mol/L Tris-HCl,pH7.3,0.2 mmol/L ZnCl2,加入180 μL 1 mmol/L氨甲蝶吟(MTX,中國藥品生物制品檢定所)。用蒸餾水調(diào)零??焖偌尤?0 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品(適當(dāng)稀釋,含0.03-0.06 U羧肽酶),混勻,倒入比色杯中于320 nm處測其吸光值,間隔15 s檢測一次。記錄吸光值變化。

    1.2.7 羧肽酶G2酶學(xué)性質(zhì)的研究 (1)最適酶活反應(yīng)溫度:實(shí)驗(yàn)在pH7. 5,反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)分別測定4℃、16℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃及75℃時(shí)的酶活。(2)最適酶活反應(yīng)pH:測定羧肽酶G2酶液在不同pH值的緩沖液中酶活力,確定pH值對羧肽酶G2酶活力的影響。溫度為37℃,反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí),分別測定pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0時(shí)的酶活性,以確定最佳反應(yīng)pH值。

    2 結(jié)果

    2.1 表達(dá)載體pET-30a-CPG2的構(gòu)建與鑒定

    以人工合成的CPG2基因序列為模板,PCR法擴(kuò)增該序列,并引入Bgl II和NotⅠ酶切位點(diǎn)及腸激酶酶切位點(diǎn),回收 DNA 片段長度約1 200 bp。將Bgl II/NotⅠ酶切的PCR產(chǎn)物插入pET-30a,成功構(gòu)建pET-30a-CPG2原核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR、質(zhì)粒酶切圖譜(圖1-A)及測序結(jié)果顯示pET-30a-CPG2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-CPG2和BL21(DE3)陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定

    2.2 重組融合蛋白CPG2的表達(dá)

    將pET-30a-CPG2表達(dá)載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E. coli BL21(DE3)宿主菌,涂布LB平板,經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增出1 200 bp片段的菌落為陽性克?。▓D1-A),雙酶切重組質(zhì)粒表明能獲得陽性目的片段(圖1-B)。將pET-30a-CPG2/BL21(DE3)經(jīng)37℃培養(yǎng)的菌液OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí),加入終濃度為0.4 mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG),30℃誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),收集菌體,并進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果(圖2)顯示,與誘導(dǎo)前相比,IPTG 誘導(dǎo)之后在43 kD附近有一條明顯的蛋白條帶,與融合蛋白理論分子量相當(dāng)。菌體經(jīng)超聲波破碎后離心,分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果(圖2)表明,CPG2以可溶的形式表達(dá)。

    圖2 CPG2蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE檢測

    2.3 CPG2重組蛋白的純化與鑒定

    菌體裂解后的上清,經(jīng)過組氨酸親和層析和陰離子交換層析,并經(jīng)Sephadex G-25凝膠過濾層析脫鹽、過濾除菌后就得到CPG2蛋白原液。通過該純化工藝,可以獲得純度大于95%的CPG2蛋白。純化過程中CPG2蛋白產(chǎn)物的純度分析(圖3-A),目的蛋白分子量約為42 kD。Western blotting結(jié)果(圖3-B)表明,CPG2融合蛋白可與鼠抗His發(fā)生特異性反應(yīng)。

    圖3 融合蛋白CPG2的純化結(jié)果(A)及Western blotting 檢測(B)

    2.4 CPG2重組蛋白的活性測定

    用酶動(dòng)力學(xué)方法對CPG2的活性進(jìn)行了測定,反應(yīng)體系中最終加入酶量0.1-1.0 U,檢測MTX降解率,以計(jì)算酶活性。定義37℃條件下1 min內(nèi)降解1 μmol MTX所需要的酶量為1個(gè)活性單位(U)。經(jīng)檢測,CPG2原液比活性為400 U/mg。隨著CPG2濃度的上升,MTX的裂解率也隨之上升,兩者成呈劑量依賴關(guān)系(圖4)。

    圖4 CPG2劑量-反應(yīng)曲線

    2.5 CPG2酶學(xué)性質(zhì)的測定

    2.5.1 最適反應(yīng)溫度 最適酶活反應(yīng)溫度在pH7.5的條件下、用UV法測定4℃、16℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃下的CPG2的酶活性,通過3次平行試驗(yàn),取平均值,繪制曲線如圖5。酶的最適溫度為37℃,在溫度為30℃-40℃范圍內(nèi),酶活性保持在80%-100%,當(dāng)溫度高于55℃時(shí),酶活性急劇下降至60%,到60℃以后,酶活性急劇下降接近為0。

    圖5 溫度對羧肽酶G2活性的影響

    2.5.2 最適酶活反應(yīng)pH 在最適溫度37℃下用UV法分別測定pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0的緩沖體系下酶活性,通過3次平行試驗(yàn),取平均值,繪制pH曲線,酶活情況由圖6可見。

    3 討論

    本研究將CPG2連接至原核表達(dá)載體pET-30a上,采用 IPTG誘導(dǎo)CPG2融合蛋白的表達(dá)。pET-30a原核表達(dá)載體具有兩個(gè)顯著特點(diǎn):一是含有T7啟動(dòng)子,可被宿主細(xì)胞提供的T7 RNA 聚合酶識(shí)別,T7 RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)錄效率比大腸桿菌 RNA 聚合酶高5倍,能夠高效轉(zhuǎn)錄 mRNA,實(shí)現(xiàn)融合蛋白的高表達(dá);二是載體上攜帶His·Tag和S·Tag,誘導(dǎo)表達(dá)的 43 kD標(biāo)簽蛋白對目的蛋白的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性影響很小,His·Tag為蛋白純化提供了親和位點(diǎn),而且兩者之間有腸激酶酶切位點(diǎn),便于純化后將標(biāo)簽蛋白切除[12-15]。

    圖6 pH對羧肽酶G2活性的影響

    在蛋白純化過程中,首先采用 Ni2+柱進(jìn)行親和層析,之后的SDS-PAGE分析出現(xiàn)43 kD的蛋白條帶。重組蛋白的理論等電點(diǎn)pI為6.5,所用緩沖液pH8.0,選擇Q柱進(jìn)行陰離子交換層析,最終獲得目的蛋白的純度大于95%。

    羧肽酶G2可水解MTX成無毒的非活性代謝物2,4-二甲基-N10-甲基蝶吟酸(DAMPA)和谷氨酸,兩者可以通過肝臟代謝提供一個(gè)非腎的MTX清除通道,減輕腎臟毒性[16,17]。目前,臨床上MTX高劑量化療所致的毒副作用,通常采用亞葉酸鈣進(jìn)行解救。亞葉酸鈣與MTX競爭進(jìn)入細(xì)胞、靶組織(骨髓、胃腸道上皮),阻止MTX的作用,補(bǔ)償DNA合成代謝途徑,從而達(dá)到緩解HD-MTX引發(fā)的不良反應(yīng)。MTX濃度升高時(shí)需要更高濃度的亞葉酸鈣,但大劑量亞葉酸鈣同樣可解救腫瘤細(xì)胞,降低抗腫瘤效果。通過水化和堿化尿液增強(qiáng)MTX的水溶性來降低腎毒性,可將毒性影響范圍降低到1.5%,但仍會(huì)發(fā)生因清除延遲而致全身毒性。CPG2是目前被證明用于MTX大劑量治療的特異性解救藥,其可特異迅速裂解MTX,且不透過血-腦屏障(BBB)和細(xì)胞膜,因而不會(huì)抵消細(xì)胞內(nèi)MTX的作用。MTX裂解產(chǎn)物可在肝代謝,因此CPG2治療實(shí)際上間接提供了一種肝解毒途徑[18]。

    CPG2還被用于抗體導(dǎo)向酶-前藥療法(ADEPT)[19-21]。ADEPT是利用抗體作為載體攜帶前藥的專一性活化酶,選擇性地結(jié)合于腫瘤部位,使前藥可以區(qū)域特異性地在腫瘤組織內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性細(xì)胞毒分子,起到專一殺傷腫瘤的作用[22,23]。高純度的CPG2為上述研究的深入進(jìn)行提供了可能性。

    4 結(jié)論

    成功構(gòu)建了CPG2原核表達(dá)體系,并純化獲得了純度較高的蛋白,初步證明其具有預(yù)期的生物學(xué)活性。下一步將重點(diǎn)圍繞CPG2蛋白的體內(nèi)外活性開展深入研究。

    [1]Levy CC, Goldman P. The enzymatic hydrolysis of methotrexate and folic acid[J]. J Biol Chem, 1967, 242(12):2933-2938.

    [2] Chabner BA, Bertino JR. Activation and inhibition of carboxypeptidase G 1 by divalent cations[J]. Biochim Biophys Acta, 1972,276(1):234-240.

    [3] Goldman JM, Dawson AA. Combination therapy for advanced resistant Hodgkin's disease[J]. Lancet, 1975, 2(7947):1224-1227.

    [4]McGuire JJ, Bertino JR. Enzymatic synthesis and function of folylpolyglutamates[J]. Mol Cell Biochem, 1981, 38(1):19-48.

    [5]Sherwood D, Snodgrass DR, O'Brien AD. Shiga-like toxin production from Escherichia coli associated with calf diarrhoea[J]. Vet Rec, 1985, 116(8):217-218.

    [6] Niculescu-Duvaz D, Niculescu-Duvaz I, Friedlos F, et al. Self-immolative nitrogen mustards prodrugs cleavable by carboxypeptidase G2(CPG2)showing large cytotoxicity differentials in GDEPT[J]. J Med Chem, 2003, 46(9):1690-1705.

    [7] Minton NP, Atkinson T, Sherwood RF. Molecular cloning of the Pseudomonas carboxypeptidase G2 gene and its expression in Escherichia coli and Pseudomonas putida[J]. J Bacteriol, 1983,156(3):1222-1227.

    [8]Minton NP, Atkinson T, Bruton CJ, et al. The complete nucleotide sequence of the Pseudomonas gene coding for carboxypeptidaseG2[J]. Gene, 1984, 31(1-3):31-38.

    [9]Chambers JC1, Kenan D, Martin BJ, et al. Genomic structure and amino acid sequence domains of the human La autoantigen[J]. J Biol Chem, 1988, 263(34):18043-18051.

    [10]Lancaster EK1, Evans RA, Kos S, et al. Measurement of bone in the os calcis:a clinical evaluation[J]. J Bone Miner Res, 1989, 4(4):507-514.

    [11]高閃電, ?;菔|, 獨(dú)軍政, 等. 一種高效、穩(wěn)定的可溶性原核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2009, 24(6):46-49.

    [12]Mergulhāo FJ, Summers DK, Monteiro GA. Recombinant protein secretion in Escherichia coli[J]. Biotechnol Adv, 2005(3):177-202.

    [13]李永進(jìn), 陳媛媛, 畢利軍. 融合標(biāo)簽技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2006, 22(4):523-527.

    [14]姜媛媛, 劉銘瑤, 任桂萍, 等. 高效可溶性重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26(1):121-129.

    [15]肖飛, 晁耐霞, 曾慶堂, 等. GCF2基因片段原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J]. 廣西醫(yī)學(xué), 2011, 5:513-515.

    [16] Patterson DM, Lee SM. Glucarpidase following high-dose methotrexate:update on development[J]. Expert Opin Biol Ther, 2010, 10(1):105-111.

    [17]Donehower RC, Hane KR, Drake JC, et al. Presence of 2, 4-diamino-N10-methylpteroic acid after high dose methotrexate[J]. Clin Pharmacol Ther, 1979, 26:63-72.

    [18] Widemann BC, Sung E, Anderson L, et al. Pharmacokinetics and metabolism of the methotrexate metabolite 2, 4-diamino-N10-methylpteroic acid[J]. J Pharm Exper Ther, 2000, 294:894-901.

    [19] 朱莉, 王馳. 抗腫瘤前藥在腫瘤靶向治療中的新進(jìn)展[J]. 中國新藥雜志, 2007, 16(17):1345-1348.

    [20] 周思群, 王耐勤. 抗體導(dǎo)向酶-前藥療法在腫瘤治療研究中的應(yīng)用[J]. 中國藥學(xué)雜志, 1994, 29(8):451-453.

    [21] 張丹妮. 靶向抗腫瘤前藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013(5):88-91.

    [22] Bagshawe KD. The first bagshawe lecture. towards generating cytotoxic agents at cancer sites[J]. Br J Cancer, 1989, 60(3):275-281.

    [23] 王智, 武國軍, 劉智廣, 等. 抗體導(dǎo)向酶-前藥療法的研究和應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2000, 7(1):73-75.

    (責(zé)任編輯 李楠)

    Prokaryotic Expression,Purification and Activity Analysis of Recombinant Carboxypeptidase G2

    LI Shu-gang1WANG Yong1ZHANG Wei1XIN Yu1DAN Guo-ping1CHAI Xin-juan1GONG Hui-ying1YU Ting-he2
    (1. Chongqing Kerun Biopharm R&D Co.,Ltd.,Chongqing 401121;2. The Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010)

    This work is to express carboxypeptidase G2(CPG2)in prokaryotic expression system,purify it and detect its activity in vitro. The gene fragment encoding CPG2 was amplified by PCR,and the prokaryotic expressed plasmid pET-30a-CPG2 was constructed by gene recombinant technology,then it was transformed into Escherichia coli BL21(DE3)for the expression with induction. The target protein from grounded cells was purified by metals chelating affinity chromatogram and anion-exchange chromatography. Majority of the fusion protein was expressed in soluble form,and its specificity was confirmed via SDS-PAGE and Western blotting. The preliminary experimental result showed that the recombinant protein degraded MTX,and the specific activity reached 400 U/mg.

    CPG2;prokaryotic expression;purification;MTX

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.029

    2015-07-02

    李樹剛,男,博士生導(dǎo)師,研究方向:生物醫(yī)學(xué)工程;E-mail:kerunlsg@126.com

    猜你喜歡
    酶切位點(diǎn)原核質(zhì)粒
    基于兩種質(zhì)譜技術(shù)檢測蛋白酶酶切位點(diǎn)的方法
    環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)在載體構(gòu)建中的應(yīng)用
    2019新型冠狀病毒S蛋白可能存在Furin蛋白酶切位點(diǎn)
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    結(jié)核分枝桿菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表達(dá)、純化及ELISPOT檢測方法的建立與應(yīng)用
    癌癥標(biāo)記蛋白 AGR2的原核表達(dá)及純化
    牛分支桿菌HBHA基因的克隆及原核表達(dá)
    酶切型穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段為內(nèi)標(biāo)用于藥物代謝酶的絕對定量分析
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    黄色女人牲交| 亚洲avbb在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产三级在线视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 最近在线观看免费完整版| 成人鲁丝片一二三区免费| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲中文日韩欧美视频| 身体一侧抽搐| 久久香蕉国产精品| 欧美日韩一级在线毛片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 99久久成人亚洲精品观看| 国产一区二区在线av高清观看| www日本在线高清视频| 亚洲国产欧美网| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲avbb在线观看| 制服人妻中文乱码| 国产成人a区在线观看| 人人妻人人看人人澡| 久久久久免费精品人妻一区二区| 女警被强在线播放| 日韩欧美免费精品| 俺也久久电影网| 很黄的视频免费| 美女高潮的动态| 色哟哟哟哟哟哟| 看黄色毛片网站| 免费看日本二区| 深爱激情五月婷婷| 三级国产精品欧美在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲精品亚洲一区二区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| a在线观看视频网站| 国产精品 欧美亚洲| 欧美+日韩+精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久久成人免费电影| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 91麻豆av在线| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲精品一区av在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 51国产日韩欧美| 中文字幕久久专区| 久久久久久九九精品二区国产| 丰满人妻一区二区三区视频av | 国模一区二区三区四区视频| 九色国产91popny在线| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美午夜高清在线| 午夜福利视频1000在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 国产成人福利小说| 亚洲成a人片在线一区二区| 一区二区三区国产精品乱码| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美乱色亚洲激情| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日本a在线网址| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美+日韩+精品| 亚洲国产精品999在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品99久久久久久久久| www日本黄色视频网| 一个人免费在线观看电影| 最新在线观看一区二区三区| 一个人看视频在线观看www免费 | 欧美一区二区亚洲| 综合色av麻豆| 美女免费视频网站| www.色视频.com| 长腿黑丝高跟| 久久这里只有精品中国| 少妇高潮的动态图| 国产成人啪精品午夜网站| 国产探花在线观看一区二区| 一本综合久久免费| 日本成人三级电影网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美在线黄色| 舔av片在线| tocl精华| 在线观看日韩欧美| 亚洲成人久久爱视频| e午夜精品久久久久久久| 99久久综合精品五月天人人| 国产综合懂色| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 1000部很黄的大片| 亚洲精品亚洲一区二区| av天堂在线播放| 一区福利在线观看| 国产成人福利小说| 青草久久国产| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲色图av天堂| 亚洲专区中文字幕在线| 免费看a级黄色片| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 精品国产三级普通话版| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 偷拍熟女少妇极品色| www日本黄色视频网| 国产精品一区二区三区四区久久| 久久久久久大精品| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲精品在线美女| 亚洲一区高清亚洲精品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产成人aa在线观看| 日韩有码中文字幕| 精品日产1卡2卡| 免费观看精品视频网站| 麻豆成人av在线观看| 波多野结衣高清无吗| 国内揄拍国产精品人妻在线| a级毛片a级免费在线| 毛片女人毛片| 精品日产1卡2卡| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美区成人在线视频| 国产真人三级小视频在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美黑人巨大hd| 夜夜夜夜夜久久久久| 午夜久久久久精精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 悠悠久久av| 午夜a级毛片| 日本a在线网址| 两人在一起打扑克的视频| 久久人妻av系列| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产野战对白在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 久久精品91无色码中文字幕| 久久草成人影院| 亚洲一区二区三区不卡视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品久久久人人做人人爽| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 高清在线国产一区| 手机成人av网站| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲av成人av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 99久久精品一区二区三区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产精品一及| 亚洲av熟女| 成人av在线播放网站| 99久久精品国产亚洲精品| www.熟女人妻精品国产| 国产欧美日韩精品一区二区| 香蕉久久夜色| 精品电影一区二区在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 成人特级av手机在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 一级作爱视频免费观看| 亚洲成av人片免费观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产探花在线观看一区二区| 又紧又爽又黄一区二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 91九色精品人成在线观看| 日本黄大片高清| 国产精品av视频在线免费观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 精品欧美国产一区二区三| 日本黄色片子视频| 九色成人免费人妻av| 在线天堂最新版资源| 亚洲国产精品sss在线观看| 露出奶头的视频| 一本久久中文字幕| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产爱豆传媒在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 男女床上黄色一级片免费看| 母亲3免费完整高清在线观看| 禁无遮挡网站| 美女高潮的动态| 男女那种视频在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 伊人久久大香线蕉亚洲五| www.色视频.com| 天美传媒精品一区二区| 女警被强在线播放| 国产在视频线在精品| 国产精品久久久久久久电影 | 天美传媒精品一区二区| 激情在线观看视频在线高清| 又紧又爽又黄一区二区| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久久久久久久久黄片| 岛国在线免费视频观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产黄a三级三级三级人| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲av五月六月丁香网| 最近视频中文字幕2019在线8| 精品久久久久久成人av| 日本五十路高清| 黄片大片在线免费观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲不卡免费看| 国产高清三级在线| 18+在线观看网站| 中文亚洲av片在线观看爽| 在线观看一区二区三区| 日韩欧美免费精品| 色视频www国产| 亚洲欧美日韩东京热| 国产av不卡久久| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品影院久久| 欧美成人一区二区免费高清观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久成人免费电影| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品国内亚洲2022精品成人| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 青草久久国产| 日本成人三级电影网站| 久久久久久久精品吃奶| 中文资源天堂在线| 床上黄色一级片| 高清在线国产一区| 色噜噜av男人的天堂激情| 午夜激情欧美在线| 国产高清视频在线播放一区| 一区二区三区免费毛片| 国产探花极品一区二区| 极品教师在线免费播放| av专区在线播放| 免费av毛片视频| 少妇的丰满在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 18美女黄网站色大片免费观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 99久国产av精品| 在线天堂最新版资源| 日韩欧美免费精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 午夜影院日韩av| 毛片女人毛片| 内射极品少妇av片p| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久久久九九精品影院| 一个人看视频在线观看www免费 | 欧美成人一区二区免费高清观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 草草在线视频免费看| av视频在线观看入口| 九色国产91popny在线| 嫩草影视91久久| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 此物有八面人人有两片| 十八禁网站免费在线| 两个人的视频大全免费| 亚洲美女黄片视频| 九九热线精品视视频播放| 欧美乱妇无乱码| 观看免费一级毛片| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 亚洲国产高清在线一区二区三| 一二三四社区在线视频社区8| 91麻豆av在线| 91字幕亚洲| 老鸭窝网址在线观看| 久久精品国产综合久久久| 精品国产三级普通话版| 国产单亲对白刺激| 无遮挡黄片免费观看| 黄片大片在线免费观看| 午夜两性在线视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 免费高清视频大片| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产男靠女视频免费网站| 日韩亚洲欧美综合| 久久伊人香网站| 亚洲精品一区av在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 久久香蕉精品热| 嫩草影院精品99| 午夜福利成人在线免费观看| av在线蜜桃| 最近最新免费中文字幕在线| 在线播放国产精品三级| 欧美又色又爽又黄视频| 日韩亚洲欧美综合| 免费在线观看影片大全网站| 久久久久国内视频| 人人妻人人看人人澡| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲国产精品成人综合色| 老司机福利观看| 网址你懂的国产日韩在线| 深夜精品福利| 俺也久久电影网| 亚洲在线自拍视频| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日韩亚洲欧美综合| 国产乱人伦免费视频| 国产高清有码在线观看视频| 香蕉久久夜色| 国产伦人伦偷精品视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 中文在线观看免费www的网站| 精品久久久久久,| 麻豆成人午夜福利视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 嫩草影院入口| 成年版毛片免费区| 我要搜黄色片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲,欧美精品.| 精品久久久久久久久久久久久| 热99在线观看视频| 老司机福利观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产97色在线日韩免费| 亚洲精品在线观看二区| 麻豆成人午夜福利视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 嫁个100分男人电影在线观看| 特级一级黄色大片| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 观看免费一级毛片| 免费电影在线观看免费观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲精品在线观看二区| 国产日本99.免费观看| 久久精品91蜜桃| 美女cb高潮喷水在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 欧美激情在线99| 亚洲无线观看免费| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 桃红色精品国产亚洲av| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 91久久精品电影网| 五月玫瑰六月丁香| 1024手机看黄色片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 日韩有码中文字幕| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 在线a可以看的网站| 亚洲,欧美精品.| 国产精华一区二区三区| 99精品在免费线老司机午夜| av天堂中文字幕网| 精品国产美女av久久久久小说| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | av专区在线播放| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美在线黄色| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 丰满的人妻完整版| 午夜福利在线观看吧| 窝窝影院91人妻| 婷婷六月久久综合丁香| 午夜精品在线福利| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲,欧美精品.| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲精品成人久久久久久| 狂野欧美激情性xxxx| 国产真实伦视频高清在线观看 | 五月伊人婷婷丁香| 中出人妻视频一区二区| 午夜a级毛片| 欧美丝袜亚洲另类 | 韩国av一区二区三区四区| 亚洲av美国av| 日本一本二区三区精品| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品电影一区二区在线| 天天躁日日操中文字幕| 国产 一区 欧美 日韩| 日韩人妻高清精品专区| 午夜福利在线观看吧| 窝窝影院91人妻| 午夜免费观看网址| 久久九九热精品免费| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产极品精品免费视频能看的| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品一区二区免费欧美| 又粗又爽又猛毛片免费看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 热99re8久久精品国产| 老司机在亚洲福利影院| 88av欧美| 校园春色视频在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 男女之事视频高清在线观看| 搞女人的毛片| 嫩草影院入口| 久久国产精品影院| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲无线观看免费| 免费人成视频x8x8入口观看| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲五月婷婷丁香| 日本黄色视频三级网站网址| 国产美女午夜福利| 国产黄色小视频在线观看| 国产69精品久久久久777片| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 观看美女的网站| 日日夜夜操网爽| 亚洲美女视频黄频| 熟女人妻精品中文字幕| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品一区二区免费欧美| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 美女cb高潮喷水在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 长腿黑丝高跟| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲av熟女| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 老司机在亚洲福利影院| 久久久久九九精品影院| 免费在线观看影片大全网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 九九在线视频观看精品| a在线观看视频网站| 国产极品精品免费视频能看的| 在线免费观看不下载黄p国产 | 亚洲在线自拍视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 午夜亚洲福利在线播放| 激情在线观看视频在线高清| 99国产精品一区二区蜜桃av| 免费无遮挡裸体视频| 丝袜美腿在线中文| 白带黄色成豆腐渣| 99精品久久久久人妻精品| 动漫黄色视频在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 99久国产av精品| 在线视频色国产色| 观看免费一级毛片| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲最大成人中文| 美女cb高潮喷水在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 免费看a级黄色片| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产成年人精品一区二区| 91九色精品人成在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久性视频一级片| 午夜福利18| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 日日夜夜操网爽| 69人妻影院| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 午夜老司机福利剧场| 成人特级黄色片久久久久久久| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产视频内射| 男女下面进入的视频免费午夜| 九色国产91popny在线| 亚洲精品色激情综合| 一本综合久久免费| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 欧美在线一区亚洲| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产日本99.免费观看| 国产真人三级小视频在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产激情欧美一区二区| 深夜精品福利| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产精品av视频在线免费观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 全区人妻精品视频| 色视频www国产| 人人妻人人澡欧美一区二区| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 又黄又爽又免费观看的视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 成人国产一区最新在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| www.999成人在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 又黄又爽又免费观看的视频| 在线观看日韩欧美| 精品久久久久久,| 精品一区二区三区av网在线观看| 黄片小视频在线播放| 天堂网av新在线| 国产精品一区二区三区四区久久| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美黄色淫秽网站| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 可以在线观看的亚洲视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲 国产 在线| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久草成人影院| 国产一区二区在线观看日韩 | 日本黄大片高清| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲色图av天堂| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品国产美女av久久久久小说| 国产熟女xx| 国产亚洲av嫩草精品影院| 丁香欧美五月| 成人一区二区视频在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 不卡一级毛片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 观看美女的网站| 久久国产精品影院| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲午夜理论影院| 精品免费久久久久久久清纯| 午夜福利高清视频| 91麻豆av在线| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲av成人精品一区久久| 精品免费久久久久久久清纯| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 中出人妻视频一区二区| 国产成人福利小说| 一本综合久久免费| 叶爱在线成人免费视频播放| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日韩欧美精品v在线| 有码 亚洲区| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久性视频一级片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 丁香欧美五月| 91麻豆精品激情在线观看国产| 最近最新免费中文字幕在线| 日本三级黄在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 天天添夜夜摸| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 97超视频在线观看视频| 首页视频小说图片口味搜索| 在线观看66精品国产|