• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    重組羧肽酶G2的原核表達(dá)、純化及活性分析

    2016-10-13 13:20:55李樹剛王勇張偉辛渝但國平柴新娟龔會(huì)英于廷和
    生物技術(shù)通報(bào) 2016年3期
    關(guān)鍵詞:酶切位點(diǎn)原核質(zhì)粒

    李樹剛王勇張偉辛渝但國平柴新娟龔會(huì)英于廷和

    (1. 重慶科潤生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司,重慶 401121;2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,重慶 400010)

    重組羧肽酶G2的原核表達(dá)、純化及活性分析

    李樹剛1王勇1張偉1辛渝1但國平1柴新娟1龔會(huì)英1于廷和2

    (1. 重慶科潤生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司,重慶 401121;2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,重慶 400010)

    在原核表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)羧肽酶G2(Carboxypeptidase G2,CPG2)的表達(dá),并對CPG2進(jìn)行了純化和活性測定。通過PCR擴(kuò)增得到編碼CPG2的基因片段,利用基因重組技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-CPG2,在Escherichia coli中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),菌體經(jīng)超聲破碎后利用金屬螯合親和柱和陰離子交換層析柱對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化。目的蛋白能夠以可溶形式表達(dá),SDS-PAGE和Western blotting檢測有特異的蛋白表達(dá)條帶。純化的CPG2有降解氨甲喋吟(MTX)活性,酶活力達(dá)到400 U/mg。

    羧肽酶G2;原核表達(dá);純化;氨甲喋吟

    羧肽酶G2(carboxypeptidase G2,CPG2)是羧肽酶G家族成員之一,最初是從假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株RS-16中分離獲得[1]。羧肽酶G可水解葉酸及其衍生物的C端谷氨酸殘基[2-4]。CPG2在物理特性與動(dòng)力學(xué)特征上與羧肽酶Gl(CPGl)類似,但其對MTX的親和力要高于CPGl。

    CPG2全序列為415個(gè)氨基酸,其中包含一個(gè)25個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列和390個(gè)氨基酸的成熟蛋白序列。CPG2活性分子為同源二聚體,分子量83 kD-84 kD,催化活性需Zn2+。最初CPG2的制備是RS-16發(fā)酵而來,表達(dá)量僅為200-300 U/L,且CPG2表達(dá)量低于菌體總蛋白的0.1%,不能滿足研發(fā)的需要[5,6]。因此,用基因工程的方法生產(chǎn)重組羧肽酶G2是另一選擇。

    CPG2分子無糖基化和二硫鍵,用原核系統(tǒng)表達(dá)是首選。近年CPG2基因已用基因工程的方法表達(dá)重組CPG2[7,8]。在原核系統(tǒng)中表達(dá)量最高可占菌體總蛋白的20%[7,9,10]。CPG2必須以二聚體形式存在才具有完全的生物學(xué)活性[11]。所以,在大腸桿菌中以可溶形式表達(dá)CPG2并能夠自發(fā)形成二聚體,是大腸桿菌表達(dá)CPG2必須考慮的因素。

    為了進(jìn)一步提高CPG2的表達(dá)水平,獲得有活性的目的蛋白,滿足研發(fā)的需要,實(shí)驗(yàn)通過基因工程的方法在大腸桿菌中高效表達(dá)CPG2蛋白,并對其酶學(xué)活性進(jìn)行初步研究,旨在為CPG2的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株和載體 Escherichia coli DH5α和BL21(DE3)、表達(dá)載體pET-30a為本公司保存。

    1.1.2 工具酶、引物和試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和Taq酶等購自大連TaKaRa生物工程有限公司;PCR引物由上海Sangon公司合成;PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA marker、蛋白質(zhì)marker、YNB、生物素、酵母粉、蛋白胨、卡那霉素、EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit、鼠抗His單克隆抗體(一抗)、羊抗鼠HRP-IgG(二抗)、牛血清白蛋白(BSA)購自上海Sangon公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 引物及基因合成 根據(jù)GenBank登錄的CPG2基因序列(登錄號(hào):M12599)進(jìn)行基因合成(上海生工完成)。設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增CPG2 cDNA的特異性上下游引物,上游引物CPG2-F中引入Bgl II酶切位點(diǎn),下游引物CPG2-R引入NotⅠ酶切位點(diǎn),引物由上海Sangon合成(表1)。

    表1 擴(kuò)增目的基因CPG2的PCR引物

    1.2.2 pET-30a-CPG2/BL21(DE3)原核表達(dá)菌株的構(gòu)建和鑒定 以人工合成的CPG2為模板,CPG2-F和CPG2-R為引物,PCR擴(kuò)增該序列,引入Bgl II酶切位點(diǎn)、腸激酶切割位點(diǎn)(DDDDK)和Not I酶切位點(diǎn)。1%瓊脂糖凝膠電泳后,切膠純化回收。將純化的目的基因片段與pET-30a Bgl II和NotⅠ酶切回收后,16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定,證明目的基因片段已正確插入pET-30a載體;質(zhì)粒經(jīng)上海Sangon測序,測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-30a-CPG2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)。

    1.2.3 CPG2在E.coli BL21(DE3)中的重組表達(dá)挑取工程菌pET-30a-CPG2/BL21(DE3)接種到20 mL LB(Kan 50 μg/mL)液體培養(yǎng)基中,37℃,250 r/min,培養(yǎng)過夜。次日,按1%的比例接種母液到200 mL LB(Kan 50 μg/mL)液體培養(yǎng)基,37℃,250 r/min培養(yǎng),OD600達(dá)到0.6后,加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L,30℃繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)4 h。將搖瓶置于冰上5 min,5 000×g,4℃,離心5 min收集菌體。

    1.2.4 CPG2蛋白純化 發(fā)酵液菌體按1∶5(W/W)懸浮于裂解液(20 mmol/L Tirs-HCl,0.2 mmol/L Zn2+,pH8.0)中,超聲破壁,8 000 r/min離心5 min收集上清;破菌液上清上樣于經(jīng)0.2 mol/L NiSO4處理并以20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)平衡的Ni2+Chelating Sepharose Fast Flow 鰲合層析介質(zhì),分別以50 mmol/L和100 mmol/L咪唑(含20 mmol/L Tris-HCl,pH8.0)洗脫,目的蛋白集中于100 mmol/L咪唑洗脫部分;收集的目的蛋白以截留分子量l0 kD離心超濾管超濾脫鹽,置換緩沖為25 mmol/L Tris-HCl(含0.2 mmol/L Zn2+,pH8.0),lowry測定蛋白濃度,按每1 mg蛋白加入0.5 U腸激酶(50 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L CaCl2,0.1% Tween-20,pH8.0)在4℃條件下酶切融合蛋白約16 h;酶切目的蛋白上樣于25 mmol/L Tirs-HCl(pH8.5),0.2 mmol/L Zn2+平衡的Q-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare),用25 mmol/L,Tris-HCl(pH8.5)緩沖液再?zèng)_洗5-6個(gè)柱床體積后,用50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)洗脫雜蛋白,再以0.1 mol/L Tris-HCl,pH7.5,0.2 mmol/L Zn2+一次性洗脫目的蛋白,收集洗脫蛋白峰。SDSPAGE檢測分子量約為42 kD,純度大于95%。

    1.2.5 免疫印跡分析 純化的帶有His標(biāo)簽的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉2 h,滴加鼠抗 His一抗(1∶300)(上海生工),4℃孵育過夜,TBST 洗膜3次,再滴加HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體(1∶1 000)(上海生工),37℃孵育2 h,TBST和PBS各洗膜3次,用濾紙吸干膜表面。利用DAB試劑盒進(jìn)行顯色。

    1.2.6 生物活性分析 取2.82 mL 0.l mol/L Tris-HCl,pH7.3,0.2 mmol/L ZnCl2,加入180 μL 1 mmol/L氨甲蝶吟(MTX,中國藥品生物制品檢定所)。用蒸餾水調(diào)零??焖偌尤?0 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品(適當(dāng)稀釋,含0.03-0.06 U羧肽酶),混勻,倒入比色杯中于320 nm處測其吸光值,間隔15 s檢測一次。記錄吸光值變化。

    1.2.7 羧肽酶G2酶學(xué)性質(zhì)的研究 (1)最適酶活反應(yīng)溫度:實(shí)驗(yàn)在pH7. 5,反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)分別測定4℃、16℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃及75℃時(shí)的酶活。(2)最適酶活反應(yīng)pH:測定羧肽酶G2酶液在不同pH值的緩沖液中酶活力,確定pH值對羧肽酶G2酶活力的影響。溫度為37℃,反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí),分別測定pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0時(shí)的酶活性,以確定最佳反應(yīng)pH值。

    2 結(jié)果

    2.1 表達(dá)載體pET-30a-CPG2的構(gòu)建與鑒定

    以人工合成的CPG2基因序列為模板,PCR法擴(kuò)增該序列,并引入Bgl II和NotⅠ酶切位點(diǎn)及腸激酶酶切位點(diǎn),回收 DNA 片段長度約1 200 bp。將Bgl II/NotⅠ酶切的PCR產(chǎn)物插入pET-30a,成功構(gòu)建pET-30a-CPG2原核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR、質(zhì)粒酶切圖譜(圖1-A)及測序結(jié)果顯示pET-30a-CPG2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-CPG2和BL21(DE3)陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定

    2.2 重組融合蛋白CPG2的表達(dá)

    將pET-30a-CPG2表達(dá)載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E. coli BL21(DE3)宿主菌,涂布LB平板,經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增出1 200 bp片段的菌落為陽性克?。▓D1-A),雙酶切重組質(zhì)粒表明能獲得陽性目的片段(圖1-B)。將pET-30a-CPG2/BL21(DE3)經(jīng)37℃培養(yǎng)的菌液OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí),加入終濃度為0.4 mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG),30℃誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),收集菌體,并進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果(圖2)顯示,與誘導(dǎo)前相比,IPTG 誘導(dǎo)之后在43 kD附近有一條明顯的蛋白條帶,與融合蛋白理論分子量相當(dāng)。菌體經(jīng)超聲波破碎后離心,分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果(圖2)表明,CPG2以可溶的形式表達(dá)。

    圖2 CPG2蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE檢測

    2.3 CPG2重組蛋白的純化與鑒定

    菌體裂解后的上清,經(jīng)過組氨酸親和層析和陰離子交換層析,并經(jīng)Sephadex G-25凝膠過濾層析脫鹽、過濾除菌后就得到CPG2蛋白原液。通過該純化工藝,可以獲得純度大于95%的CPG2蛋白。純化過程中CPG2蛋白產(chǎn)物的純度分析(圖3-A),目的蛋白分子量約為42 kD。Western blotting結(jié)果(圖3-B)表明,CPG2融合蛋白可與鼠抗His發(fā)生特異性反應(yīng)。

    圖3 融合蛋白CPG2的純化結(jié)果(A)及Western blotting 檢測(B)

    2.4 CPG2重組蛋白的活性測定

    用酶動(dòng)力學(xué)方法對CPG2的活性進(jìn)行了測定,反應(yīng)體系中最終加入酶量0.1-1.0 U,檢測MTX降解率,以計(jì)算酶活性。定義37℃條件下1 min內(nèi)降解1 μmol MTX所需要的酶量為1個(gè)活性單位(U)。經(jīng)檢測,CPG2原液比活性為400 U/mg。隨著CPG2濃度的上升,MTX的裂解率也隨之上升,兩者成呈劑量依賴關(guān)系(圖4)。

    圖4 CPG2劑量-反應(yīng)曲線

    2.5 CPG2酶學(xué)性質(zhì)的測定

    2.5.1 最適反應(yīng)溫度 最適酶活反應(yīng)溫度在pH7.5的條件下、用UV法測定4℃、16℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃下的CPG2的酶活性,通過3次平行試驗(yàn),取平均值,繪制曲線如圖5。酶的最適溫度為37℃,在溫度為30℃-40℃范圍內(nèi),酶活性保持在80%-100%,當(dāng)溫度高于55℃時(shí),酶活性急劇下降至60%,到60℃以后,酶活性急劇下降接近為0。

    圖5 溫度對羧肽酶G2活性的影響

    2.5.2 最適酶活反應(yīng)pH 在最適溫度37℃下用UV法分別測定pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0的緩沖體系下酶活性,通過3次平行試驗(yàn),取平均值,繪制pH曲線,酶活情況由圖6可見。

    3 討論

    本研究將CPG2連接至原核表達(dá)載體pET-30a上,采用 IPTG誘導(dǎo)CPG2融合蛋白的表達(dá)。pET-30a原核表達(dá)載體具有兩個(gè)顯著特點(diǎn):一是含有T7啟動(dòng)子,可被宿主細(xì)胞提供的T7 RNA 聚合酶識(shí)別,T7 RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)錄效率比大腸桿菌 RNA 聚合酶高5倍,能夠高效轉(zhuǎn)錄 mRNA,實(shí)現(xiàn)融合蛋白的高表達(dá);二是載體上攜帶His·Tag和S·Tag,誘導(dǎo)表達(dá)的 43 kD標(biāo)簽蛋白對目的蛋白的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性影響很小,His·Tag為蛋白純化提供了親和位點(diǎn),而且兩者之間有腸激酶酶切位點(diǎn),便于純化后將標(biāo)簽蛋白切除[12-15]。

    圖6 pH對羧肽酶G2活性的影響

    在蛋白純化過程中,首先采用 Ni2+柱進(jìn)行親和層析,之后的SDS-PAGE分析出現(xiàn)43 kD的蛋白條帶。重組蛋白的理論等電點(diǎn)pI為6.5,所用緩沖液pH8.0,選擇Q柱進(jìn)行陰離子交換層析,最終獲得目的蛋白的純度大于95%。

    羧肽酶G2可水解MTX成無毒的非活性代謝物2,4-二甲基-N10-甲基蝶吟酸(DAMPA)和谷氨酸,兩者可以通過肝臟代謝提供一個(gè)非腎的MTX清除通道,減輕腎臟毒性[16,17]。目前,臨床上MTX高劑量化療所致的毒副作用,通常采用亞葉酸鈣進(jìn)行解救。亞葉酸鈣與MTX競爭進(jìn)入細(xì)胞、靶組織(骨髓、胃腸道上皮),阻止MTX的作用,補(bǔ)償DNA合成代謝途徑,從而達(dá)到緩解HD-MTX引發(fā)的不良反應(yīng)。MTX濃度升高時(shí)需要更高濃度的亞葉酸鈣,但大劑量亞葉酸鈣同樣可解救腫瘤細(xì)胞,降低抗腫瘤效果。通過水化和堿化尿液增強(qiáng)MTX的水溶性來降低腎毒性,可將毒性影響范圍降低到1.5%,但仍會(huì)發(fā)生因清除延遲而致全身毒性。CPG2是目前被證明用于MTX大劑量治療的特異性解救藥,其可特異迅速裂解MTX,且不透過血-腦屏障(BBB)和細(xì)胞膜,因而不會(huì)抵消細(xì)胞內(nèi)MTX的作用。MTX裂解產(chǎn)物可在肝代謝,因此CPG2治療實(shí)際上間接提供了一種肝解毒途徑[18]。

    CPG2還被用于抗體導(dǎo)向酶-前藥療法(ADEPT)[19-21]。ADEPT是利用抗體作為載體攜帶前藥的專一性活化酶,選擇性地結(jié)合于腫瘤部位,使前藥可以區(qū)域特異性地在腫瘤組織內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性細(xì)胞毒分子,起到專一殺傷腫瘤的作用[22,23]。高純度的CPG2為上述研究的深入進(jìn)行提供了可能性。

    4 結(jié)論

    成功構(gòu)建了CPG2原核表達(dá)體系,并純化獲得了純度較高的蛋白,初步證明其具有預(yù)期的生物學(xué)活性。下一步將重點(diǎn)圍繞CPG2蛋白的體內(nèi)外活性開展深入研究。

    [1]Levy CC, Goldman P. The enzymatic hydrolysis of methotrexate and folic acid[J]. J Biol Chem, 1967, 242(12):2933-2938.

    [2] Chabner BA, Bertino JR. Activation and inhibition of carboxypeptidase G 1 by divalent cations[J]. Biochim Biophys Acta, 1972,276(1):234-240.

    [3] Goldman JM, Dawson AA. Combination therapy for advanced resistant Hodgkin's disease[J]. Lancet, 1975, 2(7947):1224-1227.

    [4]McGuire JJ, Bertino JR. Enzymatic synthesis and function of folylpolyglutamates[J]. Mol Cell Biochem, 1981, 38(1):19-48.

    [5]Sherwood D, Snodgrass DR, O'Brien AD. Shiga-like toxin production from Escherichia coli associated with calf diarrhoea[J]. Vet Rec, 1985, 116(8):217-218.

    [6] Niculescu-Duvaz D, Niculescu-Duvaz I, Friedlos F, et al. Self-immolative nitrogen mustards prodrugs cleavable by carboxypeptidase G2(CPG2)showing large cytotoxicity differentials in GDEPT[J]. J Med Chem, 2003, 46(9):1690-1705.

    [7] Minton NP, Atkinson T, Sherwood RF. Molecular cloning of the Pseudomonas carboxypeptidase G2 gene and its expression in Escherichia coli and Pseudomonas putida[J]. J Bacteriol, 1983,156(3):1222-1227.

    [8]Minton NP, Atkinson T, Bruton CJ, et al. The complete nucleotide sequence of the Pseudomonas gene coding for carboxypeptidaseG2[J]. Gene, 1984, 31(1-3):31-38.

    [9]Chambers JC1, Kenan D, Martin BJ, et al. Genomic structure and amino acid sequence domains of the human La autoantigen[J]. J Biol Chem, 1988, 263(34):18043-18051.

    [10]Lancaster EK1, Evans RA, Kos S, et al. Measurement of bone in the os calcis:a clinical evaluation[J]. J Bone Miner Res, 1989, 4(4):507-514.

    [11]高閃電, ?;菔|, 獨(dú)軍政, 等. 一種高效、穩(wěn)定的可溶性原核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2009, 24(6):46-49.

    [12]Mergulhāo FJ, Summers DK, Monteiro GA. Recombinant protein secretion in Escherichia coli[J]. Biotechnol Adv, 2005(3):177-202.

    [13]李永進(jìn), 陳媛媛, 畢利軍. 融合標(biāo)簽技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2006, 22(4):523-527.

    [14]姜媛媛, 劉銘瑤, 任桂萍, 等. 高效可溶性重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26(1):121-129.

    [15]肖飛, 晁耐霞, 曾慶堂, 等. GCF2基因片段原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J]. 廣西醫(yī)學(xué), 2011, 5:513-515.

    [16] Patterson DM, Lee SM. Glucarpidase following high-dose methotrexate:update on development[J]. Expert Opin Biol Ther, 2010, 10(1):105-111.

    [17]Donehower RC, Hane KR, Drake JC, et al. Presence of 2, 4-diamino-N10-methylpteroic acid after high dose methotrexate[J]. Clin Pharmacol Ther, 1979, 26:63-72.

    [18] Widemann BC, Sung E, Anderson L, et al. Pharmacokinetics and metabolism of the methotrexate metabolite 2, 4-diamino-N10-methylpteroic acid[J]. J Pharm Exper Ther, 2000, 294:894-901.

    [19] 朱莉, 王馳. 抗腫瘤前藥在腫瘤靶向治療中的新進(jìn)展[J]. 中國新藥雜志, 2007, 16(17):1345-1348.

    [20] 周思群, 王耐勤. 抗體導(dǎo)向酶-前藥療法在腫瘤治療研究中的應(yīng)用[J]. 中國藥學(xué)雜志, 1994, 29(8):451-453.

    [21] 張丹妮. 靶向抗腫瘤前藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013(5):88-91.

    [22] Bagshawe KD. The first bagshawe lecture. towards generating cytotoxic agents at cancer sites[J]. Br J Cancer, 1989, 60(3):275-281.

    [23] 王智, 武國軍, 劉智廣, 等. 抗體導(dǎo)向酶-前藥療法的研究和應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2000, 7(1):73-75.

    (責(zé)任編輯 李楠)

    Prokaryotic Expression,Purification and Activity Analysis of Recombinant Carboxypeptidase G2

    LI Shu-gang1WANG Yong1ZHANG Wei1XIN Yu1DAN Guo-ping1CHAI Xin-juan1GONG Hui-ying1YU Ting-he2
    (1. Chongqing Kerun Biopharm R&D Co.,Ltd.,Chongqing 401121;2. The Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010)

    This work is to express carboxypeptidase G2(CPG2)in prokaryotic expression system,purify it and detect its activity in vitro. The gene fragment encoding CPG2 was amplified by PCR,and the prokaryotic expressed plasmid pET-30a-CPG2 was constructed by gene recombinant technology,then it was transformed into Escherichia coli BL21(DE3)for the expression with induction. The target protein from grounded cells was purified by metals chelating affinity chromatogram and anion-exchange chromatography. Majority of the fusion protein was expressed in soluble form,and its specificity was confirmed via SDS-PAGE and Western blotting. The preliminary experimental result showed that the recombinant protein degraded MTX,and the specific activity reached 400 U/mg.

    CPG2;prokaryotic expression;purification;MTX

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.029

    2015-07-02

    李樹剛,男,博士生導(dǎo)師,研究方向:生物醫(yī)學(xué)工程;E-mail:kerunlsg@126.com

    猜你喜歡
    酶切位點(diǎn)原核質(zhì)粒
    基于兩種質(zhì)譜技術(shù)檢測蛋白酶酶切位點(diǎn)的方法
    環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)在載體構(gòu)建中的應(yīng)用
    2019新型冠狀病毒S蛋白可能存在Furin蛋白酶切位點(diǎn)
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    結(jié)核分枝桿菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表達(dá)、純化及ELISPOT檢測方法的建立與應(yīng)用
    癌癥標(biāo)記蛋白 AGR2的原核表達(dá)及純化
    牛分支桿菌HBHA基因的克隆及原核表達(dá)
    酶切型穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段為內(nèi)標(biāo)用于藥物代謝酶的絕對定量分析
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    av免费在线观看网站| а√天堂www在线а√下载| 亚洲成人久久性| 人人澡人人妻人| 正在播放国产对白刺激| 制服诱惑二区| a级毛片在线看网站| 免费高清在线观看日韩| 婷婷六月久久综合丁香| 韩国精品一区二区三区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 可以在线观看毛片的网站| 日本免费a在线| 国产精品二区激情视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| av电影中文网址| 91老司机精品| bbb黄色大片| 久久九九热精品免费| 夜夜爽天天搞| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 美女免费视频网站| 村上凉子中文字幕在线| 男人舔女人的私密视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 欧美久久黑人一区二区| 久久伊人香网站| av片东京热男人的天堂| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲无线在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 日本成人三级电影网站| 99国产精品99久久久久| 我的亚洲天堂| 精品久久久久久成人av| 最近最新免费中文字幕在线| 国产黄a三级三级三级人| 午夜福利一区二区在线看| 国产精品久久久久久精品电影 | 一级作爱视频免费观看| 久久性视频一级片| videosex国产| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 99在线视频只有这里精品首页| 嫩草影院精品99| 悠悠久久av| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 怎么达到女性高潮| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲精品在线美女| 午夜福利18| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品精品国产色婷婷| 免费看十八禁软件| 一本一本综合久久| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产主播在线观看一区二区| 午夜免费成人在线视频| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲中文av在线| 亚洲精品中文字幕一二三四区| a级毛片在线看网站| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 最新美女视频免费是黄的| 国产成人精品久久二区二区免费| 黄色成人免费大全| 国产精品影院久久| 免费高清视频大片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一本久久中文字幕| 午夜久久久在线观看| 一级毛片高清免费大全| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | а√天堂www在线а√下载| 国产v大片淫在线免费观看| 免费观看精品视频网站| 成人一区二区视频在线观看| 国产亚洲精品av在线| 久久精品91蜜桃| 国产成人系列免费观看| 亚洲人成77777在线视频| 高清毛片免费观看视频网站| 国产区一区二久久| 一区二区三区国产精品乱码| 老汉色∧v一级毛片| 一区二区三区高清视频在线| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美zozozo另类| 国产极品粉嫩免费观看在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲自拍偷在线| 长腿黑丝高跟| 日本a在线网址| 欧美色视频一区免费| 日本三级黄在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲成人久久性| 国产高清视频在线播放一区| 欧美黑人精品巨大| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| av福利片在线| 99久久综合精品五月天人人| 久久国产亚洲av麻豆专区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲国产精品999在线| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产一区二区激情短视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 午夜成年电影在线免费观看| 国产激情久久老熟女| 精品久久久久久成人av| 国产成人啪精品午夜网站| 婷婷丁香在线五月| 欧美中文综合在线视频| 三级毛片av免费| 一边摸一边抽搐一进一小说| 两个人视频免费观看高清| 最近最新中文字幕大全免费视频| 淫秽高清视频在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 久久中文字幕一级| 亚洲无线在线观看| 色综合站精品国产| 久久中文看片网| 日韩精品免费视频一区二区三区| 在线永久观看黄色视频| 999久久久国产精品视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 午夜两性在线视频| 日本熟妇午夜| 免费在线观看日本一区| 国产单亲对白刺激| e午夜精品久久久久久久| 久久久国产成人免费| 国产精品 国内视频| 亚洲人成77777在线视频| 日韩欧美三级三区| 成人三级黄色视频| 亚洲精品一区av在线观看| 黄色 视频免费看| 久久国产精品影院| 亚洲专区国产一区二区| 又紧又爽又黄一区二区| 国产野战对白在线观看| 国产三级黄色录像| 女警被强在线播放| 观看免费一级毛片| 免费在线观看影片大全网站| 88av欧美| 国产成人影院久久av| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美日本视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 91av网站免费观看| www国产在线视频色| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲九九香蕉| 成年免费大片在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 日本免费一区二区三区高清不卡| 成人av一区二区三区在线看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲片人在线观看| 日韩欧美三级三区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 少妇的丰满在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 久久久久久久久中文| 国产精品野战在线观看| 久久青草综合色| 一级毛片精品| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲精品在线观看二区| 视频区欧美日本亚洲| 欧美在线一区亚洲| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 日韩欧美在线二视频| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲欧美激情综合另类| 精品一区二区三区四区五区乱码| aaaaa片日本免费| xxxwww97欧美| 亚洲免费av在线视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美在线一区亚洲| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品久久久久久精品电影 | 91大片在线观看| 欧美色视频一区免费| 久久久久精品国产欧美久久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久草成人影院| 国产真实乱freesex| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久精品影院6| 亚洲专区字幕在线| www日本在线高清视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 免费无遮挡裸体视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 午夜激情福利司机影院| 在线观看午夜福利视频| 中国美女看黄片| 桃红色精品国产亚洲av| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品久久视频播放| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产一区二区在线av高清观看| 一夜夜www| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 一本综合久久免费| av免费在线观看网站| 欧美中文综合在线视频| 国产区一区二久久| 亚洲黑人精品在线| 极品教师在线免费播放| 精品国产乱码久久久久久男人| 露出奶头的视频| 久久久久久久精品吃奶| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲国产精品999在线| 免费观看人在逋| 青草久久国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品影院久久| 欧美在线一区亚洲| 日韩欧美国产在线观看| 曰老女人黄片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美性猛交黑人性爽| 性色av乱码一区二区三区2| 99久久精品国产亚洲精品| 中文字幕久久专区| 亚洲自拍偷在线| 满18在线观看网站| 成人国语在线视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 岛国视频午夜一区免费看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 男女那种视频在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 夜夜爽天天搞| 精品日产1卡2卡| 精品福利观看| 免费av毛片视频| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲欧美激情综合另类| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 精品福利观看| 自线自在国产av| 91成人精品电影| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 午夜成年电影在线免费观看| 12—13女人毛片做爰片一| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产精品 欧美亚洲| 精品福利观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 长腿黑丝高跟| 国产成人影院久久av| 黄色a级毛片大全视频| 国产1区2区3区精品| 99精品在免费线老司机午夜| 国产一区二区三区视频了| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲一区高清亚洲精品| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲专区中文字幕在线| 久久精品人妻少妇| 999久久久国产精品视频| 欧美又色又爽又黄视频| 国产成人精品无人区| 9191精品国产免费久久| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 精品电影一区二区在线| 欧美乱妇无乱码| 一本综合久久免费| 精品乱码久久久久久99久播| av福利片在线| 女性被躁到高潮视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美大码av| 国产三级在线视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久久国产成人精品二区| 脱女人内裤的视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久久国产欧美日韩av| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲在线自拍视频| 亚洲精品在线观看二区| 天堂√8在线中文| 日韩欧美国产一区二区入口| 岛国在线观看网站| 99国产精品一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲成人久久性| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 午夜老司机福利片| 12—13女人毛片做爰片一| 免费高清在线观看日韩| 亚洲成国产人片在线观看| 看黄色毛片网站| 中文亚洲av片在线观看爽| 日本五十路高清| 国产精品二区激情视频| 最近最新免费中文字幕在线| 狂野欧美激情性xxxx| 人人妻人人看人人澡| 国产成人欧美| 91av网站免费观看| 在线观看舔阴道视频| 国产真人三级小视频在线观看| or卡值多少钱| 美女 人体艺术 gogo| 一区二区三区国产精品乱码| 老司机靠b影院| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 最近在线观看免费完整版| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲国产欧美网| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久久久大精品| 午夜激情福利司机影院| 怎么达到女性高潮| 男女午夜视频在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 色哟哟哟哟哟哟| 一本一本综合久久| 国产视频一区二区在线看| 男女视频在线观看网站免费 | 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 熟女电影av网| 少妇被粗大的猛进出69影院| 一区福利在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 波多野结衣高清作品| 欧美黑人巨大hd| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 一级毛片精品| 国产成人系列免费观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 狂野欧美激情性xxxx| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 超碰成人久久| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲在线自拍视频| 手机成人av网站| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲男人天堂网一区| 青草久久国产| 中文字幕最新亚洲高清| 男人舔奶头视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品在线美女| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲五月婷婷丁香| 国产片内射在线| 妹子高潮喷水视频| 亚洲美女黄片视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 天堂动漫精品| 久9热在线精品视频| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 少妇的丰满在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 久久久久久久久久黄片| 69av精品久久久久久| 无人区码免费观看不卡| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产成人影院久久av| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲真实伦在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 黄片播放在线免费| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 日本 欧美在线| 黑人操中国人逼视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 观看免费一级毛片| 丰满的人妻完整版| 看免费av毛片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 91麻豆av在线| 久热爱精品视频在线9| 久久久精品欧美日韩精品| 美女 人体艺术 gogo| 欧美大码av| 91在线观看av| www.自偷自拍.com| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 一边摸一边抽搐一进一小说| 可以在线观看的亚洲视频| 国产成人av激情在线播放| 久久狼人影院| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 一个人免费在线观看的高清视频| 99久久精品国产亚洲精品| 看免费av毛片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| av欧美777| 国产男靠女视频免费网站| 欧美日韩乱码在线| xxx96com| 嫩草影视91久久| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲在线自拍视频| 波多野结衣高清无吗| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 淫妇啪啪啪对白视频| 免费看a级黄色片| 亚洲av第一区精品v没综合| 正在播放国产对白刺激| 亚洲 国产 在线| 色播亚洲综合网| 午夜久久久在线观看| 国产精品免费视频内射| 韩国精品一区二区三区| 日本免费a在线| www.精华液| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 美女高潮到喷水免费观看| 一本精品99久久精品77| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久香蕉激情| 麻豆av在线久日| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品人妻1区二区| 亚洲黑人精品在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 一级a爱片免费观看的视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 又大又爽又粗| av电影中文网址| 久热这里只有精品99| 一级作爱视频免费观看| 色在线成人网| 两人在一起打扑克的视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲成人精品中文字幕电影| www.www免费av| 国产精品亚洲一级av第二区| a在线观看视频网站| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 在线永久观看黄色视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产一区二区三区视频了| 黄色女人牲交| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美又色又爽又黄视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 日本五十路高清| 国产成人av教育| 神马国产精品三级电影在线观看 | 18禁黄网站禁片免费观看直播| 俄罗斯特黄特色一大片| bbb黄色大片| 国产熟女xx| 国产亚洲精品第一综合不卡| 90打野战视频偷拍视频| 国产成人欧美在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久久水蜜桃国产精品网| 精品国产乱子伦一区二区三区| 成人免费观看视频高清| 色播在线永久视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 757午夜福利合集在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 黄片播放在线免费| 欧美av亚洲av综合av国产av| 成人手机av| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 大型黄色视频在线免费观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久精品人妻少妇| 久久精品成人免费网站| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲激情在线av| svipshipincom国产片| 草草在线视频免费看| 免费在线观看日本一区| 男女之事视频高清在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 日本a在线网址| 欧美性长视频在线观看| 天堂√8在线中文| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产一区二区三区视频了| 一区二区日韩欧美中文字幕| 最近最新免费中文字幕在线| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久香蕉国产精品| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久狼人影院| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 午夜福利高清视频| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美一级a爱片免费观看看 | 午夜福利在线在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久 成人 亚洲| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲国产精品成人综合色| 91在线观看av| 女性生殖器流出的白浆| 日本在线视频免费播放| 亚洲国产精品sss在线观看| 免费看十八禁软件| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产又爽黄色视频| 两人在一起打扑克的视频| 黄色成人免费大全| 国产精品久久视频播放| 9191精品国产免费久久| 国产精品日韩av在线免费观看| 天堂影院成人在线观看| 国产在线观看jvid| 亚洲av电影不卡..在线观看| avwww免费| 中文在线观看免费www的网站 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品免费视频内射| 午夜激情福利司机影院| 他把我摸到了高潮在线观看| 91在线观看av| 精华霜和精华液先用哪个| 午夜激情福利司机影院| 午夜福利高清视频| 午夜激情福利司机影院| 国产99白浆流出| 青草久久国产| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品久久久久久精品电影 | 老司机在亚洲福利影院| 国产黄色小视频在线观看| 日日夜夜操网爽| 一个人免费在线观看的高清视频| 可以在线观看毛片的网站| 日韩三级视频一区二区三区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 精品国产美女av久久久久小说| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产精品久久视频播放| 无遮挡黄片免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| 51午夜福利影视在线观看| ponron亚洲| 久久午夜亚洲精品久久| 神马国产精品三级电影在线观看 | 黄频高清免费视频| 国产高清videossex| 亚洲激情在线av| √禁漫天堂资源中文www| avwww免费| 美女扒开内裤让男人捅视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美成人免费av一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲免费av在线视频| av天堂在线播放| 两个人看的免费小视频| 欧美精品亚洲一区二区| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久这里只有精品19| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精品av久久久久免费| 中文字幕最新亚洲高清| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 首页视频小说图片口味搜索|