人C反應(yīng)蛋白在不同原核表達(dá)載體及菌株中的表達(dá)及免疫反應(yīng)性分析

李江峰 矯麗媛 趙曉妮 王繼華 才蕾

（廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510660）

人C反應(yīng)蛋白在不同原核表達(dá)載體及菌株中的表達(dá)及免疫反應(yīng)性分析

李江峰 矯麗媛 趙曉妮 王繼華 才蕾

（廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510660）

構(gòu)建人C反應(yīng)蛋白（CRP）原核表達(dá)載體，并分別將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli BL21（DE3）和Rosetta gami 2（DE3）pLysS中，誘導(dǎo)CRP重組蛋白的表達(dá)；主要運(yùn)用了基因工程，親和層析及透析復(fù)性等方法。成功構(gòu)建了CRP原核表達(dá)載體及菌株。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，得到了不同的重組CRP蛋白。結(jié)果表明，相同表達(dá)載體在不同的表達(dá)菌株中的表達(dá)情況有一定差別，分別在大腸桿菌及Rosetta gami2（DE3）pLysS中表達(dá)并得到了重組CRP的包涵體，對復(fù)性后的CRP重組蛋白進(jìn)行Westen blotting及ELISA檢測，結(jié)果表明原核表達(dá)的重組CRP蛋白的免疫反應(yīng)性很低，CRP蛋白發(fā)揮免疫活性需要以五聚體形式存在。

C反應(yīng)蛋白；原核表達(dá)；包涵體；復(fù)性

1930年，Tillett和Francis首次在急性大葉性肺炎患者的血清中發(fā)現(xiàn)了一種能夠在Ca2+存在時(shí)與肺炎球菌細(xì)胞壁中的C-多糖發(fā)生特異性沉淀反應(yīng)的物質(zhì)，1941年，Avery等測知它是一種蛋白質(zhì)，故稱其為C反應(yīng)蛋白（CRP）。之后，人們在非感染性疾病和感染性疾病患者的急性期血清中都測到了CRP，其中CRP是急性期蛋白中變化最為顯著的一種。CRP在正常人血清中其含量極微，在組織受到損傷、炎癥、感染或腫瘤破壞時(shí)CRP可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)急劇上升，CRP因此被廣泛應(yīng)用于臨床疾病的早期預(yù)判及鑒別診斷［1］。

人源CRP蛋白為同源五聚體結(jié)構(gòu)，每個(gè)單體都具有224個(gè)氨基酸，由信號肽酶切除掉位于N端的18個(gè)氨基酸后成為成熟形式，成熟的人源五聚體CRP分子量約為125 kD［2，3］。CRP在臨床疾病的診斷及預(yù)防中具有重要的作用，近年來有關(guān)人CRP蛋白臨床研究已成為熱點(diǎn)，重組人CRP蛋白的研究也有報(bào)道［4，5］。本研究基于CRP的臨床應(yīng)用價(jià)值，利用多種表達(dá)載體及菌株，對重組人CRP蛋白（rhCRP）的原核表達(dá)及免疫學(xué)性能進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：E.coli DH5α，BL21（DE3）及Rosetta gami2（DE3）pLysS；原核表達(dá)載體：pET28a（5 369 bp，His-tag），pET32a（5 900 bp，Trx-Histags），pET41a（5 933 bp，GST-His-tags），pCold1（4 407 bp，His-tag）；限制性內(nèi)切酶BamH I，Hind III（TaKaRa），人源CRP蛋白（Fitzgerald）；Ni-NTA樹脂（GE）；捕獲抗體為鼠源CRP單克隆抗體mAb1及mAb2，檢測抗體抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠CRP單克隆抗體。

1.2 方法

1.2.1 CRP原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 利用核酸序列分析軟件（DNAstar）對crp基因進(jìn)行核苷酸序列的優(yōu)化，并去掉信號肽序列，使其易于在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)［6］，在優(yōu)化后的crp序列兩端加上合適的限制性酶切位點(diǎn)（BamH I，Hind III），并合成無信號肽的crp（618 bp）核苷酸序列，將其插入到原核表達(dá)載體pET28a、pET32a、pET41a及pCold1中。CRP核酸序列在3'端帶有終止密碼子，因此沒有選取Nco I作為5'端的酶切位點(diǎn)，以保留5'端的His標(biāo)簽，為了構(gòu)建的方便，其余載體也都用BamH I和Hind III作為酶切位點(diǎn)。為了消除蛋白質(zhì)標(biāo)簽對復(fù)性后rhCRP活性的影響，本研究對pCold1重組表達(dá)載體進(jìn)行了進(jìn)一步的改造，得到無His-tag（命名為nh）的重組表達(dá)載體pCold-crp（nh），使得rhCRP（與人源CRP相比僅在N端多出兩個(gè)氨基酸，即BamH I酶切位點(diǎn)編碼的甘氨酸和絲氨酸）分子量大小接近于人體內(nèi)成熟形式的CRP單體。將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli DH5α中，抗性篩選得到陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

1.2.2 CRP在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定為陽性的重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliBL21（DE3）和Rosetta gami2（DE3）pLysS中；在不同的溫度（攜帶有pCold1重組表達(dá)載體的菌株于20℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)［7］，其他的菌株于20-37℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)）及IPTG濃度（0.25 mmol/L，0.5 mmol/L）下對各表達(dá)菌株進(jìn)行培養(yǎng)及誘導(dǎo)，分析CRP重組蛋白在各個(gè)菌株之中的表達(dá)情況。其中，載體pET28a、pET32a、pET41a及pCold1對應(yīng)的重組蛋白形式分別為：His-CRP（約27 kD），Trx-His-CRP（約40 kD），GSTHis-CRP（約48 kD）和His-CRP（約27 kD），Trx、GST及His標(biāo)簽均位于重組蛋白的N端。

1.2.3 rhCRP的純化及復(fù)性 對各重組表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體，超聲破碎后得到各rhCRP的包涵體。對包涵體進(jìn)行洗滌，用8 mol/L尿素進(jìn)行溶解，利用親和層析的原理，通過Ni柱對CRP重組蛋白進(jìn)行純化。選擇合適的透析復(fù)性液對純化后的rhCRP進(jìn)行透析復(fù)性，復(fù)性的過程均在低溫下進(jìn)行（2-8℃）［8，9］。

1.2.4 對復(fù)性后的rhCRP進(jìn)行免疫反應(yīng)性檢測 選用鼠源單克隆抗體及HRP標(biāo)記的二抗（羊抗鼠），并分別用Western blotting和ELISA等免疫學(xué)方法對復(fù)性后的重組CRP蛋白及天然狀態(tài)的人源CRP蛋白進(jìn)行體外免疫反應(yīng)性檢測。比較免疫反應(yīng)的結(jié)果，分析重組和天然CRP蛋白在免疫學(xué)活性方面的區(qū)別。

2 結(jié)果

2.1 CRP原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

利用基因工程方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入克隆菌株DH5α中，經(jīng)LB抗性板篩選，挑取并培養(yǎng)陽性DH5α重組菌株，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定（圖1）。由圖1可知，利用基因工程方法成功得到重組原核表達(dá)載體pCold1-crp、pET28a-crp、pET32a-crp和pET41a-crp。將這些表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliBL21（DE3）及Rosetta gami2（DE3）pLysS中，經(jīng)抗性篩選后得到相應(yīng)的重組表達(dá)菌株。

圖1 CRP重組菌株的酶切鑒定結(jié)果

2.2 CRP重組蛋白在各個(gè)原核表達(dá)菌株中的誘導(dǎo)、表達(dá)情況分析

分別攜帶有重組表達(dá)質(zhì)粒pCold1-crp、pET28acrp、pET32a-crp或pET41a-crp的原核表達(dá)菌株BL21（DE3）和Rosetta gami2（DE3）pLysS在經(jīng)過LB培養(yǎng)基及IPTG誘導(dǎo)后，菌體被用來進(jìn)行SDSPAGE分析（圖2-A，2-B）。從SDS-PAGE分析可知，rhCRP蛋白可以在菌株BL21 pCold1-crp，BL21（DE3）pET32a-crp及BL21 pET41a-crp中表達(dá)，而在BL21 pET28a-crp中則沒有明顯可見的表達(dá)；在菌株Rosetta gami 2（DE3）pLysS pCold1-crp和Rosetta gami2（DE3）pLysS pET32a-crp中有明顯的表達(dá)，而在Rosetta gami2（DE3）pLysS pET28a-crp和Rosetta gami2（DE3）pLysS pET-41a-crp中則沒有明顯可見的表達(dá)。并且，菌株BL21（DE3）pCold1-crp和Rosetta gami2（DE3）pLysS pCold1-crp在沒有誘導(dǎo)的情況下（圖2-A），重組CRP蛋白有微量的本底表達(dá)，這一點(diǎn)也通過使用HRP標(biāo)記的6×His標(biāo)簽抗體借助Western blotting檢測方法得到驗(yàn)證（圖2-C）。

圖2 CRP蛋白在不同載體及菌株中表達(dá)情況的SDSPAGE分析

通過降低培養(yǎng)溫度溫度（37℃、25℃、20℃）及IPTG濃度（1、0.5和0.25 mmol/L）等對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)低溫及低誘導(dǎo)劑濃度下，CRP重組蛋白仍以包涵體的形式存在，并且由于低溫條件下菌體生長緩慢，菌體產(chǎn)量減少，菌株BL21（DE3）pET32a-crp及BL21 pET41a-crp中的重組CRP蛋白的表達(dá)量有所降低。

利用相同的方法將重組表達(dá)載體pCold1-crp（nh）轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21（DE3）中，LB板抗性篩選得到陽性克隆菌株BL21（DE3）pCold1-crp（nh），經(jīng)誘導(dǎo)后成功得到無His標(biāo)簽的rhCRP蛋白（圖3-A）。

2.3 CRP重組蛋白的純化、復(fù)性及免疫反應(yīng)性分析

由于重組菌株Rosetta gami2（DE3）pLysS的生長周期要長于BL21（DE3），故選取BL21（DE3）重組表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。收集菌體并進(jìn)行超聲破碎，對得到的包涵體進(jìn)行洗滌（3次或以上），溶解于8 mol/L尿素后用Ni柱進(jìn)行純化。菌株BL21（DE3）pCold1-crp（nh）表達(dá)的重組CRP蛋白由于不具有His標(biāo)簽，故對包涵體進(jìn)行多次洗滌，以便得到純度較高的重組蛋白。用SDS-PAGE對純化后的重組蛋白進(jìn)行了分析（圖3-A）。

圖3 重組CRP蛋白的純化（A）及復(fù)性后的檢測（B）

由圖3-A可知，純化后得到的各種rhCRP蛋白所攜帶的蛋白質(zhì)標(biāo)簽不一樣，表現(xiàn)出不同的分子量大小。對純化后的rhCRP進(jìn)行透析復(fù)性，得到了可溶的rhCRP蛋白。利用人源CRP蛋白（五聚體結(jié)構(gòu)）作為對照，對復(fù)性后的各種重組人CRP蛋白進(jìn)行了非變性PAGE電泳分析（Native-PAGE，圖3-B）和免疫反應(yīng)性分析。Native-PAGE 結(jié)果顯示復(fù)性后的rhCRP形成多聚體結(jié)構(gòu)，其聚集程度遠(yuǎn)高于天然狀態(tài)的CRP五聚體結(jié)構(gòu)。Western blotting結(jié)果（圖4）顯示，CRP單克隆抗體（mAb1及mAb2）均不能同包括天然人源CRP蛋白在內(nèi)的各種CRP重組蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，而ELISA結(jié)果顯示單克隆抗體mAb1及mAb2能夠同人源CRP蛋白發(fā)生較強(qiáng)免疫反應(yīng)，而與復(fù)性后的rhCRP蛋白幾乎沒有免疫反應(yīng)。另外，單克隆抗體能夠同ELISA中未經(jīng)變性處理的人源CRP蛋白發(fā)生結(jié)合，而不能同Western blotting中經(jīng)煮沸變性處理后失去高級結(jié)構(gòu)的目的蛋白（人源CRP）結(jié)合，表明實(shí)驗(yàn)中使用的單克隆抗體所針對的CRP抗原表位是構(gòu)像表位，而不是線性表位。

圖4 使用鼠源單克隆抗體mAb1（A）和mAb2（B）對重組CRP蛋白復(fù)性后的ELISA檢測結(jié)果

3 討論

本研究基于基因工程手段和原核表達(dá)的方法利用大腸桿菌BL21（DE3）和Rosetta gami2（DE3）pLysS成功表達(dá)出重組人CRP蛋白。對表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，重組CRP蛋白在不同的表達(dá)載體和菌株中的表達(dá)情況及表達(dá)量是有差別的［10，11］。其中，在宿主BL21（DE3）中利用pET32a作為表達(dá)載體得到的重組CRP蛋白的表達(dá)量要高于以pCold1和pET41a作為表達(dá)載體的表達(dá)量，這可能是由不同的表達(dá)載體所具有的蛋白質(zhì)標(biāo)簽或啟動子的不同所造成的［12，13］；另外，從分析結(jié)果可知當(dāng)以pET41a作為表達(dá)載體時(shí)，重組CRP蛋白只能在BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)而不能在Rosetta gami2（DE3）pLysS菌株中進(jìn)行表達(dá)，由此可知，在進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)表達(dá)菌株的選取也能影響重組蛋白的表達(dá)［14］。

在對重組CRP蛋白包涵體進(jìn)行透析復(fù)性的過程中，一些有利于蛋白質(zhì)保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，促進(jìn)其正確折疊的試劑被使用，如L-精氨酸、DTT、GSSG、GSH、甘油及一些鹽離子等，這些試劑的使用是影響蛋白質(zhì)折疊和得到可溶性CRP重組蛋白的關(guān)鍵因素之一。另外，合適的pH環(huán)境對于包涵體的復(fù)性也很重要［15，16］。使用鼠源單克隆抗體mAb1和mAb2對復(fù)性后的重組CRP蛋白進(jìn)行的Western blotting檢測結(jié)果表明這兩個(gè)抗體所針對的不是線性表位，對ELISA檢測結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，相對于天然人源CRP蛋白，重組CRP蛋白同樣不具有免疫活性，而人源CRP蛋白則能夠同鼠源單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。由此說明，單克隆抗體mAb1和mAb2針對的是CRP的構(gòu)象表位，而復(fù)性后的CRP重組蛋白不能夠進(jìn)行正確的折疊及形成正確的五聚體結(jié)構(gòu)。非變性PAGE電泳分析結(jié)果也表明，復(fù)性后CRP重組蛋白的聚集程度要高于人源CRP的五聚體結(jié)構(gòu)，并且由菌株BL21（DE3）pET32a-crp分離純化得到的重組CRP蛋白在經(jīng)過復(fù)性后出現(xiàn)不同程度的聚集。透析復(fù)性的結(jié)果說明在體外進(jìn)行類似于CRP蛋白這種多聚體蛋白的復(fù)性具有較高的難度，而其它重組CRP蛋白所具有的蛋白質(zhì)標(biāo)簽也可能在較大程度上影響了CRP五聚體結(jié)構(gòu)的正確形成?？傊?，重組CRP蛋白不具備免疫活性一方面主要和復(fù)性后的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)；另一方面，原核生物不具備真核生物蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾的功能，這也是造重組CRP蛋白活性缺失的一個(gè)重要原因。

4 結(jié)論

成功對人CRP蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)，得到重組CRP蛋白的包涵體，但復(fù)性后的包涵體與天然人源CRP相比不具備五聚體結(jié)構(gòu)，在體外缺失與特定抗體的免疫反應(yīng)性。

［1］Koenig W， Sund M， et al. C-reactive protein， a sensitive marker of inflammation， predicts future risk of coronary heart disease in initially healthy middle-aged men：results from the MONICA（Monitoring Trends and Reterminants in Cardiovascular Disease）Augsburg Cohort Study， 1984 to 1992［J］. Circulation， 1999， 99：237-242.

［2］Szalai AJ， Agrawal A， et al. C-reactive protein［J］. Immunologic Research， 1997， 16（2）：127-136.

［3］Volanakis JE. Human C-reactive protein：expression， structure， and function［J］. Molecular Immunology， 2001， 38：189-197.

［4］高蘭英， 劉增長. 人C-反應(yīng)蛋白重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1 和TF 表達(dá)的影響［J］. 中國生物制品學(xué)志， 2012， 25（11）：1476-1481.

［5］陳騰祥， 李紅梅， 胡水旺， 等. 重組人CRP的表達(dá)純化及其內(nèi)化進(jìn)入HeLa細(xì)胞的觀察［J］. 中國病理生理雜志， 2008， 24（6）：1155-1160.

［6］Burgess-Brown NA， Sharma S， Sobott F， et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli：a multigene study［J］. Protein Expr Purif， 2008， 59（1）：94-102.

［7］Gualerzi GO， Giuliodori AM， Pon CL， et al. Transcriptional and post-transcriptional control of cold-shock genes［J］. J Medic Biol，2003， 3：527-539.

［8］Williamson RA. Refolding of timp-2 from Escherichia coli inclusion bodies［J］. Methods in Molecular Biology， 2010， 622：111-121.

［9］Phan J， Yamout N， et al. Refolding your protein with a little help from REFOLD［M］. Methods Mol Biol， 2011， 752：45-57.

［10］侯鑫， 扈廷茂， 劉俊娥. 在大腸桿菌中表達(dá)有活性的人STK11蛋白［J］. 微生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2007， 47（1）：79-82.

［11］ 吉莉莉， 楊吉成， 等. 不同表達(dá)載體對人白細(xì)胞介素-18原核表達(dá)效率的影響［J］. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2003， 26（1）：4-6.

［12］李紅亮. 不同啟動子對重組畢赤酵母高密度表達(dá)人胰島素前體的影響［D］. 重慶：重慶理工大學(xué)， 2012.

［13］馬超. 新型克隆載體和融合表達(dá)載體的構(gòu)建［D］. 南京：南京師范大學(xué)， 2010.

［14］陳玉林. 不同類型幽門螺桿菌對GES-1細(xì)胞Cx32、Cx43表達(dá)及GJIC功能的影響［D］. 長沙：中南大學(xué)， 2010.

［15］余秀娟， 趙麗艷， 張曉光， 等. 體外蛋白質(zhì)復(fù)性方法及小分子添加劑在復(fù)性過程中的作用［J］. 河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)， 2013，29（2）：9-15.

［16］車婧， 韓金祥， 王世立， 等. 促進(jìn)包涵體蛋白復(fù)性的幾種有效添加劑［J］. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志， 2004， 1（2）：122-125.

（責(zé)任編輯 李楠）

The Expression and Immunoreactive Analysis of Recombinant Human C-reactive Protein in Different Prokaryotic Expression Vectors and Strains

LI Jiang-feng JIAO Li-yuan ZHAO Xiao-ni WANG Ji-hua CAI Lei
（Guangzhou Wondfo Biotech Co.，Ltd，Guangzhou 510660）

The prokaryotic expression vector of human C-reactive protein（CRP）was constructed and transferred into Escherichia coli BL21（DE3）and Rosetta gami2（DE3）pLysS，respectively，and then these recombinant strains were induced for the expression of CRP. Mainly gene engineering，affinity chromatography and dialysis refolding methods were employed. The expression vectors and recombinant strains of human CRP were constructed successfully，and the varied CRPs with different protein tags were acquired by IPTG. In conclusion，expressions of the same vector in different strains differed；it expressed in the E. coli BL21（DE3）and Rosetta gami2（DE3）pLysS respectively，and the inclusion bodies of recombinant CRP were obtained. The results of detecting the refolded recombinant CRP by Western blotting and ELISA revealed that the immunoreactivity of recombinant CRP in the prokaryotic expression vector was low，and CRP may have the immunoreactivity while it is in the pentamer form.

C-reactive protein；prokaryotic expression；inclusion bodies；refolding.

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.026

2015-05-20

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2012BAI19B05）

李江峰，碩士研究生，研發(fā)工程師，研究方向；E-mail：lijiangfeng511@163.com

才蕾，博士，E-mail：leicai@wondfo.com.cn