一株凡納濱對(duì)蝦源鰻弧菌群體感應(yīng)信號(hào)分子的檢測(cè)

潘玉榮 張彩麗 朱素芹 孫秀嬌 曾名湧

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266003）

一株凡納濱對(duì)蝦源鰻弧菌群體感應(yīng)信號(hào)分子的檢測(cè)

潘玉榮 張彩麗 朱素芹 孫秀嬌 曾名湧

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266003）

旨在檢測(cè)從凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)選取的一株鰻弧菌的群體感應(yīng)信號(hào)分子。利用報(bào)告菌株結(jié)合薄層層析法鑒定鰻弧菌（Vibrio anguillarum，VA）分泌的高絲氨酸內(nèi)酯類（AHLs）信號(hào)分子，利用哈維氏弧菌V. harveyi JMH597 和 V. harveyi JAF375作為報(bào)告菌株分別檢測(cè)了VA分泌的AI-2和CAI-1信號(hào)分子活性與細(xì)菌密度的關(guān)系。結(jié)果表明，VA能分泌3種類型的信號(hào)分子：AHLs信號(hào)分子、AI-2信號(hào)分子和CAI-1信號(hào)分子，其中分泌的AHLs有N-3-羥基-己?；?高絲氨酸內(nèi)酯（3-OH-C6-HSL）、N-3-辛酰基-高絲氨酸內(nèi)酯（C8-HSL）和N-3-氧代-辛?；?高絲氨酸內(nèi)酯（3-oxo-C8-HSL）。VA分泌的AHLs、AI-2和CAI-1均具有密度依賴性。

鰻弧菌；群體感應(yīng)；AHLs信號(hào)分子；AI-2 類信號(hào)分子；CAI-1 類信號(hào)分子

群體感應(yīng)［1］（Quorum sensing，QS）是指細(xì)菌能自發(fā)產(chǎn)生、釋放一些特定的信號(hào)分子，細(xì)菌通過(guò)感知其濃度變化來(lái)調(diào)節(jié)群體行為的現(xiàn)象。這種特定的信號(hào)分子又稱為自身誘導(dǎo)物（autoinducer，AI），隨細(xì)菌密度的增加而增加，當(dāng)自誘導(dǎo)物濃度達(dá)到一定閾值時(shí)能啟動(dòng)細(xì)菌中特定基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)菌的生物行為，如毒素、抗生素和胞外酶的產(chǎn)生，群集運(yùn)動(dòng)，生物膜形成和生物發(fā)光等［2］。QS系統(tǒng)由自誘導(dǎo)物分泌蛋白，感受蛋白及下游調(diào)控蛋白組成。目前已報(bào)道的信號(hào)分子主要有：革蘭氏陰性菌（G-），一般利用酰基高絲氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子（Acyl-homoserine lactones，AHLs）；革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），一般利用寡肽類信號(hào)分子（Autoinducing peptides，AIPs）；還有一類是存在于G+菌與 G-菌中作為種間交流的信號(hào)分子——呋喃酰硼酸二酯（Autoinducer-2，AI-2）［3］。

鰻弧菌為有鞭毛的革蘭氏陰性細(xì)菌，無(wú)莢膜，不形成芽孢，能運(yùn)動(dòng)，具有典型的弧菌屬細(xì)菌特征。當(dāng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物在不良環(huán)境條件下遭遇不利刺激或受傷時(shí)，會(huì)誘發(fā)疾病的產(chǎn)生。鰻弧菌引起的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病在世界范圍內(nèi)流行，可感染魚蝦貝等。隨著研究的深入，已發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)系統(tǒng)與微生物致病性有著密切的聯(lián)系，群體感應(yīng)系統(tǒng)不僅調(diào)控病原菌致病初期階段的侵襲定殖以及毒力基因的表達(dá)，還調(diào)控其耐藥性的產(chǎn)生，這就為人們提供了一種病原菌防控新思路——從干擾密度感應(yīng)系統(tǒng)入手預(yù)防和治療微生物疾病。因此，研究水產(chǎn)品中鰻弧菌群體感應(yīng)可以為水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的防治以及開發(fā)鰻弧菌病防治藥物提供理論指導(dǎo)。

本研究從凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)選取一株鰻弧菌VA，利用群體感應(yīng)報(bào)告菌株紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）A136（pCF218）（pCF372），以及哈維氏弧菌V. harveyi JMH597和V. harveyi JAF375，檢測(cè)和研究其群體感應(yīng)信號(hào)分子類型及其與細(xì)菌密度間的關(guān)系，旨為今后通過(guò)鰻弧菌群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控其致病性提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 本研究中使用的菌株質(zhì)粒如表1所示。所有菌株均保存于30% 甘油中，置于 -20℃下凍藏。使用前，將儲(chǔ)存的菌液按 1∶100 的比例接種于對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基過(guò)夜活化。其中哈維氏弧菌使用AB培養(yǎng)基，根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens，A136）和紫色桿菌（Chromobacterium violaceum，CV026）使用LB培養(yǎng)基，其中CV026 可檢測(cè)碳鏈長(zhǎng)度從C4-C8的AHLs，而A136可檢測(cè)碳鏈長(zhǎng)度為C4-C14和3-oxo-C4-3-oxo-C12的AHLs。CV026 和 A136 本身均不產(chǎn)生 AHLs，當(dāng)存在外源 AHLs 時(shí)，紫色桿菌 CV026 將產(chǎn)生紫色桿菌素；A136表達(dá) lacZ基因，分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色。鰻弧菌使用 2216E培養(yǎng)基，A136體系需加入終濃度50 mg/L壯觀霉素和終濃度4.5 mg/L 四環(huán)素；CV026體系需加入終濃度20 mg/L卡那霉素。所有菌株的培養(yǎng)條件均為溫度30℃、搖速160 r/min。細(xì)菌生長(zhǎng)密度用OD600表示。

表1 供試菌株和特征

1.1.2 主要試劑和儀器 壯觀霉素、四環(huán)素、卡那霉素、AHLs標(biāo)準(zhǔn)品（C6-HSL、C8-HSL、N-3-oxo-C6-HSL、N-3-oxo-C8-HSL）等均購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）；X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）購(gòu)自Solarbio公司；RP-C18 F254s反相薄層板購(gòu)自德國(guó)Merck公司；菌株的熒光強(qiáng)度用熒光酶標(biāo)儀（Bio-tek，Vermont，USA）測(cè)定。

1.1.3 培養(yǎng)基 AB培養(yǎng)基配方：0.3 mol/L NaCl，0.05 mol/L MgSO4，0.2%酪蛋白氨基酸，用1 mol/L KOH調(diào)至pH為7，121℃滅菌30 min備用。100 mL母液加入2 mL 50%無(wú)菌甘油，1 mL 1 mol/L無(wú)菌PBS（pH=7），1 mL 0.1 mol/L滅菌L-精氨酸。

1.2 群體感應(yīng)AHLs信號(hào)分子的檢測(cè)

1.2.1 粗提液的制備 將VA接種在2216E液體培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，取100 mL菌液，離心取上清，用含 0.5%甲酸的乙酸乙酯萃取3次，混合有機(jī)相，旋蒸至干，溶于二甲亞砜，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 平板劃線法檢測(cè)AHLs 按照文獻(xiàn)［10］的方法，采用平行劃線法，以報(bào)告菌株本身作陰性對(duì)照，C6-HSL作為A136陽(yáng)性對(duì)照，紫色桿菌31532作為CV026陽(yáng)性對(duì)照。30℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察顏色變化。

1.2.3 TLC-biosensor檢測(cè)AHLs 根據(jù)文獻(xiàn)［11］將1 μL AHLs提取物與信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品分別點(diǎn)樣于C18反相薄層層析板上，以甲醇/水（3∶2，體積比）為展開劑展開，無(wú)菌風(fēng)吹干。將A136報(bào)告菌株菌液與含0.7%瓊脂的LB混合均勻，低于42℃鋪于TLC板上，凝固。30℃ 密閉容器中培養(yǎng)24-48 h，觀察顏色變化。AHLs經(jīng)薄層層析展開后，A136會(huì)在AHLs存在的區(qū)域水解X-gal呈現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。根據(jù)斑點(diǎn)位置以及形狀，分析AHLs的類型。

1.2.4 鰻弧菌AI-2類信號(hào)分子的檢測(cè) AI-2型信號(hào)分子的檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)［11］，V. harveyi JMH597培養(yǎng)過(guò)夜至OD600約為1.0，用新鮮的AB培養(yǎng)基按1∶3 000比例稀釋菌液，28℃孵育2 h。在96孔黑色酶標(biāo)板中加入20 μL不同時(shí)間段VA無(wú)菌上清液和180 μL JMH597的稀釋液，每個(gè)樣品重復(fù)4次，28℃靜止培養(yǎng)3 h，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)其于460 nm波長(zhǎng)處的熒光值，每隔15 min測(cè)一次，直至AB培養(yǎng)基對(duì)照到達(dá)最低。其中以0 h無(wú)菌上清和BB152的無(wú)菌上清液分別為空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，AB培養(yǎng)基作對(duì)照菌株的空白對(duì)照。AI-2信號(hào)分子相對(duì)強(qiáng)度（%）=（樣品上清的熒光值/陽(yáng)性對(duì)照的熒光值）×100%，以陽(yáng)性對(duì)照的熒光值作為100%。

1.2.5 鰻弧菌CAI-1類信號(hào)分子的檢測(cè) CAI-1類信號(hào)分子的檢測(cè)條件參考文獻(xiàn)［12］略做改動(dòng)，活化好的V. harveyi JAF375培養(yǎng)過(guò)夜達(dá)到OD600約為1.0，按1∶10 000的比例稀釋到新鮮AB培養(yǎng)基。在96孔酶標(biāo)板中加入100 μL不同時(shí)間段的鰻弧菌VA無(wú)菌上清液和100 μL稀釋后的報(bào)告菌液，30℃培養(yǎng)4 h。用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)其460 nm處熒光值，每隔15 min測(cè)一次，直到AB培養(yǎng)基值達(dá)到最小。其中E. coli DH5α和V. harveyi BB120培養(yǎng)于LB肉湯制備的無(wú)菌上清液分別為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，2216E液體培養(yǎng)基和LB肉湯分別作為待檢菌株和對(duì)照菌株的空白對(duì)照。CAI-1信號(hào)分子相對(duì)強(qiáng)度（%）=（樣品上清的熒光值/陽(yáng)性對(duì)照的熒光值）×100%，以陽(yáng)性對(duì)照的熒光值100%。

2 結(jié)果

2.1 鰻弧菌VA 的AHLs信號(hào)分子的檢測(cè)

2.1.1 平板劃線法 A136能檢測(cè)較寬范圍內(nèi)的AHLs且具有高靈敏性，CV026只能檢測(cè)短鏈AHLs，且需要較高的閾值。利用報(bào)告菌株檢測(cè)VA產(chǎn)生AHLs的結(jié)果（圖1）顯示，VA能誘導(dǎo)A136啟動(dòng)lac Z基因分泌β-半乳糖苷酶水解X-gal使平板變藍(lán)，表明鰻弧菌VA能夠分泌AHLs類信號(hào)分子，但VA不能誘導(dǎo)報(bào)告菌株CV026產(chǎn)生紫色色素，可能由于其產(chǎn)生的信號(hào)分子為長(zhǎng)鏈AHLs或者產(chǎn)生的AHLs濃度未達(dá)到CV026的檢測(cè)限。VA自身變藍(lán)是由于VA自身能夠分泌β-半乳糖苷酶水解X-gal變藍(lán)。

圖1 利用根癌農(nóng)桿菌A136和紫色桿菌CV026檢測(cè)VA信號(hào)分子

2.2.2 薄層層析法檢測(cè)AHLs類型 利用C18反相薄層層析法對(duì)VA產(chǎn)生的AHLs種類進(jìn)一步研究。結(jié)果（圖2）顯示，VA的AHLs粗提液可以產(chǎn)生3個(gè)藍(lán)斑，其中兩個(gè)分別與標(biāo)準(zhǔn)品C8-HSL、O-C8-HSL相一致，因?qū)嶒?yàn)室所存標(biāo)準(zhǔn)品種類有限，另一個(gè)沒(méi)有匹配，從遷移值來(lái)看，其比O-C6-HSL大，推測(cè)其為極性更大的OH-C6-HSL。

VA不同生長(zhǎng)階段AHLs活性的檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，AHLs信號(hào)分子活性先升高后降低，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期（培養(yǎng)時(shí)間為18 h）達(dá)到最大值。檢測(cè)VA培養(yǎng)液pH值發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液的pH一直保持上升趨勢(shì)，初始pH值為6.83（3 h，OD600約0.10），最后pH值達(dá)到8.92（30 h，OD600約1.0），由于AHLs在堿性條件下容易發(fā)生降解，推測(cè)進(jìn)入穩(wěn)定期后VA的AHLs活性的下降，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)液pH的不斷升高導(dǎo)致AHLs降解。

圖2 TLC檢測(cè)VA信號(hào)分子的種類

圖3 報(bào)告平板法檢測(cè)VA不同時(shí)間分泌AHLs活性（A）和 AHLs所誘導(dǎo)變色直徑與細(xì)菌密度間關(guān)系（B）

2.2 鰻弧菌VA的 AI-2信號(hào)分子活性隨生長(zhǎng)變化規(guī)律

VA的AI-2信號(hào)分子活性隨其生長(zhǎng)的變化規(guī)律如圖4所示。該菌的AI-2類信號(hào)分子的活性隨著生長(zhǎng)密度的增加先升高后降低，與空白培養(yǎng)基對(duì)照相比，VA在對(duì)數(shù)前期（6 h，OD600≈0.15）就表現(xiàn)出明顯AI-2活性，隨后AI-2迅速積累，到對(duì)數(shù)中期（12 h，OD600≈0.6）時(shí)達(dá)到最高（約為峰值的83%），隨后有所下降，到30 h時(shí)其活性仍約為最高值的37%。該結(jié)果表明VA分泌的AI-2信號(hào)分子活性具有一定的生長(zhǎng)密度依賴性。

圖4 鰻弧菌VA不同生長(zhǎng)階段的AI-2活性

2.3 鰻弧菌VA的CAI-1信號(hào)活性變化規(guī)律

CAI-1的檢測(cè)主要根據(jù)環(huán)境中存在的CAI-1會(huì)誘導(dǎo)報(bào)告菌株JAF375發(fā)光，熒光強(qiáng)度的大小反應(yīng)CAI-1含量的多少。圖5顯示，3 h時(shí)（OD600約0.1）即顯示很高的熒光強(qiáng)度，隨后處于波動(dòng)狀態(tài)。由于該檢測(cè)體系中報(bào)告菌株與VA無(wú)菌上清的比例為1∶1，12 h前發(fā)光強(qiáng)度較強(qiáng)源于VA無(wú)菌上清中培養(yǎng)基含有的豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)了報(bào)告菌株的生長(zhǎng)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成一定干擾。12 h后，VA與體系中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)處于平衡狀態(tài)，熒光強(qiáng)度的變化主要為CAI-1引起，結(jié)果顯示，VA的CAI-1信號(hào)分子活性先升高后降低，最高活性出現(xiàn)在24 h（OD600≈0.9），約為陽(yáng)性對(duì)照的60%，表明VA能夠產(chǎn)生CAI-1信號(hào)分子。體系中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)檢測(cè)過(guò)程存在一定干擾，Defoird［13］探索了更改報(bào)告菌株和無(wú)菌上清的比例來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，發(fā)現(xiàn)只有在比例1∶1時(shí)較合適。

圖5 鰻弧菌VA不同生長(zhǎng)階段的CAI-1活性

3 討論

弧菌病是養(yǎng)殖及野生海水魚的重要疾病之一，已成為世界流行的一種細(xì)菌性病害，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的影響和巨大經(jīng)濟(jì)損失［14］。已報(bào)道的鰻弧菌毒力因子有pJM1鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、脂多糖、生物膜胞外酶等［15］。大量的研究表明，細(xì)菌的毒力因子受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，因此，對(duì)致病菌群體感應(yīng)信號(hào)分子的檢測(cè)和分析是研究其群體感應(yīng)系統(tǒng)的基礎(chǔ)。

目前，以AHLs介導(dǎo)的革蘭氏陰性菌的群感應(yīng)機(jī)制（LuxI/LuxR）已被廣泛研究。鰻弧菌中具有與群體感應(yīng)系統(tǒng)LuxI/R 同源的VanI/R調(diào)控系統(tǒng)［16］。不同生長(zhǎng)環(huán)境下以及不同血清型的鰻弧菌分泌信號(hào)分子的類型有所差異，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了從冷藏的腐敗凡納濱對(duì)蝦中分離的一株 VA 的群體感應(yīng)AHLs信號(hào)分子，根據(jù)Rasmussen等［17］報(bào)道鰻弧菌通常情況下不產(chǎn)生C4-HSL和C6-HSL，但是能夠產(chǎn)生OH-C6-HSL，因此推測(cè)沒(méi)有匹配的藍(lán)斑為OH-C6-HSL。結(jié)果表明該菌能分泌3種AHLs，即OH-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL和C8-HSL。對(duì)VA的AHLs的動(dòng)力學(xué)研究表明，對(duì)數(shù)末期之前，菌體濃度與AHLs分泌量呈正相關(guān)，而在穩(wěn)定期以后，隨著細(xì)菌的衰亡及環(huán)境的變化，AHLs處于下降趨勢(shì)，AHLs在一定范圍內(nèi)具有密度依賴性。

AI-2類信號(hào)分子是目前已知的唯一一種在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌中都存在的群體感應(yīng)信號(hào)分子，被認(rèn)為是種間交流的信號(hào)分子。VA的AI-2信號(hào)分子在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期迅速積累，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期達(dá)到最高活性水平，進(jìn)入穩(wěn)定期后開始有所降低，但仍保持較高的活性水平。已有研究報(bào)道哈維氏弧菌明膠酶和卵磷脂酶的產(chǎn)生受AI-2正調(diào)控［18］，我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)VA具有較強(qiáng)的蛋白酶、明膠酶和卵磷脂酶分泌能力，在VA中，AI-2對(duì)胞外酶的調(diào)控關(guān)系需要進(jìn)一步的研究，這也為開發(fā)新的AI-2型群體感應(yīng)抑制劑提供了理論指導(dǎo)。

CAI-1類信號(hào)分子分布范圍并不廣泛，目前僅在弧菌屬中發(fā)現(xiàn)有CAI-1類信號(hào)分子，它被認(rèn)為是弧菌種間交流的一種信號(hào)分子［12］。Milton等［19］報(bào)道，大部分鰻弧菌能夠產(chǎn)生CAI-1信號(hào)分子，但是，目前的研究發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌的CAI-1類信號(hào)分子能夠影響線蟲的趨化運(yùn)動(dòng)，有利于線蟲避免有害因素［20］。這糾正了以往人們認(rèn)為CAI-1信號(hào)分子僅限于弧菌種間交流的認(rèn)識(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)鰻弧菌能夠產(chǎn)生CAI-1信號(hào)分子，進(jìn)入穩(wěn)定期后出現(xiàn)密度依賴性，相對(duì)于AI-2，VA分泌CAI-1能力較低。細(xì)菌的生理行為和過(guò)程是受多種QS系統(tǒng)調(diào)控的，QS系統(tǒng)的調(diào)控是通過(guò)細(xì)菌分泌的信號(hào)分子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。鰻弧菌VA產(chǎn)生的信號(hào)分子對(duì)其代謝的調(diào)控還需要進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究鰻弧菌致病性與群體感應(yīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，也為開發(fā)新的群體感應(yīng)抑制劑提供了理論指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本研究鑒定了腐敗凡納濱對(duì)蝦中鰻弧菌VA分泌的群體感應(yīng)信號(hào)分子類型，即AHLs、AI-2和CAI-1。其中AHLs信號(hào)分子有C8-HSL、O-C8-HSL和OH-C6-HSL。以上3種類型的群體感應(yīng)信號(hào)分子均具有密度依賴性。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Detection of Quorum Sensing Signal Molecules in Vibrio anguillarum Isolated From Litopenaeus vannamei

PAN Yu-rong ZHANG Cai-li ZHU Su-qin SUN Xiu-jiao ZENG Ming-yong
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003）

The aim of the present study was to detect and analyze quorum sensing of Vibrio anguillarum（VA）isolated from spoiled Litopenaeus vannamei. AHLs activities of VA were detected by reporter strains（Chromobacterium violaceum CV026 and Agrobacterium tumefaciens A136）combined with TLC method. Report strains V. harveyi JMH597 and V. harveyi JAF375 were used to detect the activity of AI-2 and CAI-1. The result indicated that AHLs（3-OH-C6-HSL， C8-HSL and 3-oxo-C8-HSL）、AI-2 and CAI-1 were secreted by VA andthe activity of the signal molecules were density-dependent.

Vibrio anguillarum；Quorum sensing；AHLs；AI-2；CAI-1

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.023

2015-03-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31071613）

潘玉榮，女，碩士研究生，研究方向：群體感應(yīng)抑制劑；E-mail：944193302@qq.com

曾名湧，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：水產(chǎn)品高值化利用；E-mail：mingyz@ouc.edu.cn