馬尾松毛蟲質(zhì)型多角體病毒非結(jié)構(gòu)蛋白p44在Bac-to-Bac系統(tǒng)中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位

彭晗王洪秀王金昌關(guān)麗梅靳亮萬翠香

（1. 南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，南昌 330077；2. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，南昌 330200；3. 江西省科學(xué)院微生物研究所，南昌 330029）

馬尾松毛蟲質(zhì)型多角體病毒非結(jié)構(gòu)蛋白p44在Bac-to-Bac系統(tǒng)中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位

彭晗1王洪秀2王金昌3關(guān)麗梅3靳亮3萬翠香1

（1. 南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，南昌 330077；2. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，南昌 330200；3. 江西省科學(xué)院微生物研究所，南昌 330029）

為探尋馬尾松毛蟲質(zhì)型多角體病毒（DpCPV 1）p44蛋白的功能，構(gòu)建了DpCPV 1基因組S8片段的原核表達(dá)體系，表達(dá)純化蛋白后免疫家兔制備了多克隆抗體。利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了3種重組的桿狀病毒質(zhì)粒（Bacmid-p44、Bacmid-p44-eGFP和Bacmid-eGFP）。轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9進(jìn)行表達(dá)，通過Western blot檢測(cè)和蛋白的亞細(xì)胞定位觀察。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Bacmid-S8在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)實(shí)際蛋白的大小為35 kD，比在原核系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白（44 kD）略??；利用激光共聚焦顯微鏡觀察p44-eGFP的融合蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，融合p44的綠色熒光蛋白（eGFP）主要聚集在細(xì)胞質(zhì)中，而未融合的eGFP則分布于整個(gè)細(xì)胞，說明 DpCPV 1的p44蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。

馬尾松毛蟲質(zhì)型多角體病毒；多克隆抗體；真核表達(dá)；細(xì)胞定位

昆蟲質(zhì)型多角體病毒（cypovirus，CPV）屬于呼腸孤病毒科，質(zhì)型多角體病毒屬。根據(jù)病毒基因組dsRNA片段在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠中電泳圖譜的差異，目前CPV已被分為20個(gè)電泳型［1，2］。馬尾松毛蟲質(zhì)型多角體病毒（dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis Virus 1，DpCPV 1）屬于1型，該病毒基因組S8片段編碼一個(gè)由390個(gè)氨基酸組成、分子量為43.78 kD的非結(jié)構(gòu)蛋白（p44），是我國(guó)的特有種類，于1973年首次分離得到［3］。

隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)與信息處理等新技術(shù)的運(yùn)用與發(fā)展，包括X射線晶體衍射、低溫電鏡與三維重構(gòu)技術(shù)，質(zhì)型多角體病毒結(jié)構(gòu)學(xué)研究方面已取得突破性進(jìn)展［4］。Yu等［5］利用低溫電子顯微鏡技術(shù)在分辨率上研究了衣殼蛋白的三維結(jié)構(gòu)，在與基因組直接作用的區(qū)域中觀察到螺旋與β發(fā)卡結(jié)構(gòu)之間的構(gòu)象改變，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了特有的加帽結(jié)構(gòu)和釋放通道。Cheng等［6］通過低溫電子顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)，CPV的五聚體塔狀蛋白的酶區(qū)域是拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)高度保守并且有5個(gè)連接著鳥苷酰基轉(zhuǎn)移酶和甲基轉(zhuǎn)移酶區(qū)域的獨(dú)特的通道；通過氨基酸序列推理，LPP是由S7片段編碼P50蛋白修飾后得到的。Yang等［7］研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)CPV病毒粒子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，衣殼蛋白VP1A、VP1B和塔狀蛋白VP3構(gòu)象發(fā)生變化，衣殼空間擴(kuò)大和塔狀蛋白周圍通道的加寬，使得基因組RNA從緊湊的病毒粒子衣殼更加靈活的轉(zhuǎn)錄和輸出。

相對(duì)CPV結(jié)構(gòu)蛋白的深入研究，CPV非結(jié)構(gòu)蛋白的研究相對(duì)緩慢。文力［8］、張萬菊［9］等對(duì)DpCPV 1基因組中的第9片段（S9）的編碼序列進(jìn)行了cDNA克隆和序列測(cè)定，并對(duì)NS5蛋白的表達(dá)和功能進(jìn)行了初步分析。汪洋等［10］研究發(fā)現(xiàn)由DpCPV基因組第9片段編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5蛋白在感染昆蟲細(xì)胞時(shí)，定位在昆蟲細(xì)胞的細(xì)胞膜上。段兵［11］和胡建芳等［12］對(duì)馬尾松毛蟲CPV基因組第8片段進(jìn)行序列分析和原核表達(dá)。凝膠遷移阻抑分析（EMSA）顯示，由CPV基因組第8片段編碼的p44蛋白具有序列非特異性的ssRNA結(jié)合活性，不與dsRNA、ssDNA、dsDNA結(jié)合；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)p44氨基酸序列116-197 aa之間的區(qū)域（富含谷氨酸區(qū)域）為單一的RNA結(jié)合區(qū)域［13］。

目前，質(zhì)型多角體病毒S8片段編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白p44蛋白的真核表達(dá)和昆蟲細(xì)胞上定位研究還未見報(bào)道。本研究利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建重組Bacmid-S8-eGFP和Bacmid-S8，將DpCPV 1 S8片段和綠色熒光蛋白基因（eGFP）以C端融合的方式在昆蟲Sf9細(xì)胞中進(jìn)行融合表達(dá)及細(xì)胞定位，旨在為下一步非結(jié)構(gòu)蛋白p44在CPV復(fù)制過程中的功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系、菌種及質(zhì)粒 草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）細(xì)胞系Sf9由中國(guó)科學(xué)院武漢病毒所昆蟲病毒基因工程學(xué)科組提供，于27℃培養(yǎng)，生長(zhǎng)培養(yǎng)基為Grace's昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基（10%胎牛血清）。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21和DH10B菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存；載體pMD18-T vector系統(tǒng)、T4 DNA Ligase及其buffer購自寶生物工程（大連）有限公司，載體pET-28a、pFastBacDual、pFastBacDual-eGFP（GFP片段插入在PstⅠ和HindⅢ酶切為點(diǎn)之間）和DpCPV 1基因序列S8片段為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 DM2000 DNA Marker 購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA MarkerⅢ購自東盛生物科技有限公司產(chǎn)；預(yù)染蛋白Marker購自南京生興生物技術(shù)公司；異丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）購自武漢貝特生物公司；Ni-NTA His.BindTMResins購自Novagen公司；其余藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純以上。轉(zhuǎn)染試劑lipofectin 購自Invitrogen公司（美國(guó)）；熒光染料 Hoechst 33258 購自 Biosharp公司（美國(guó)）；PVDF膜購自Millipore公司（美國(guó)）；PCR純化試劑盒購自Promega公司（上海）；質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司（上海）。

1.1.3 引物合成 根據(jù)DpCPV 1基因組S8片段的核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物；除通用引物M13F 和M13R（Cat. No. N530-02，Invitrogen公司，美國(guó)）外，其余引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物列表，見表1。

1.2 方法

1.2.1 以實(shí)驗(yàn)室保存的DpCPV病毒基因組S8為模板，以pTS8F、pTS8R為引物，利用兩步法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增［14］。PCR擴(kuò)增的片段通過相應(yīng)的酶切位點(diǎn)酶切，連接到原核表達(dá)載體pET-28a（pET28a-S8）。將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21，1 mmol/L的IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。收集菌體，經(jīng)超聲破碎后離心，獲得包涵體蛋白。用8 mol/L的尿素溶液溶解包涵體蛋白，然后通過Ni-NTA樹脂柱進(jìn)行蛋白純化。將收集的洗脫流出液裝入透析袋，對(duì)含適量甘油的0.01 mol/L PBS pH8.0透析48 h，每4-8 h更換一次PBS溶液。然后，將上述透析袋包埋在聚乙二醇粉末中，對(duì)蛋白溶液進(jìn)行濃縮。并為下一步制備抗體做準(zhǔn)備。

表1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所需引物列表

1.2.2 抗體制備 純化的目的蛋白常規(guī)方法（淋巴加皮下注射）免疫家兔，制備抗血清。實(shí)驗(yàn)兔、鼠飼養(yǎng)，抗原注射及最終采血均委托武漢愛博泰克生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2.3 重組Bacmid病毒的構(gòu)建及PCR檢測(cè) 以pFS8-1F、pFS8-1R和pFS8-2F、pFS8-2R為引物，以pET28a-S8載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將上述膠回收的S8片段分別連接到pFastBacDual和pFastBacDual-eGFP載體上。依照質(zhì)粒提取試劑盒說明書中介紹的方法，分別提取質(zhì)粒。酶切鑒定陽性克隆子，分別命名為pFastBac-S8和pFastBac-S8-eGFP。

將pFastBac-S8、pFastBac-S8-GFP和pFastBac-Dual空載體（用作對(duì)照）分別轉(zhuǎn)座到含有AcBacmid和helper質(zhì)粒的DH10B感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LA培養(yǎng)基平板［含50 μg/mL卡那霉素（kanamycin，Kana），7 μg/mL慶大霉素（gentamicin，Gm），10 μg/mL四環(huán)素（tetracycline，Tetra），100 μg/mL 5溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β-D-galactoside，X-gal）和40 μg/mL異丙-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（thiogalactopyranoside，IPTG）］，于37℃培養(yǎng)24-48 h。檢查平板上的藍(lán)白斑，白斑即重組Bacmid的菌落。挑取白色單菌落，接種于5 mL LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)14 h。取出3 mL于10 000×g 離心10 min，抽提重組Bacmid質(zhì)粒。抽提Bacmid質(zhì)粒的具體方法參考Bac-to-Bac?Baculovirus Expression Systems手冊(cè)的3.5節(jié)。

以上述提取的重組Bacmid為模板，以通用引物M13F和M13R以及目的片段上兩端的引物（表1）進(jìn)行PCR檢測(cè)。鑒定正確的重組Bacmid分別命名為Bacmid-p44、Bacmid-p44-eGFP和Bacmid-Dual，于4℃冰箱中保存。

1.2.4 重組病毒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞 Sf9在35 mm的培養(yǎng)皿中接種5×105的Sf9 細(xì)胞，27℃培養(yǎng)過夜。在生物安全柜中棄去上層培養(yǎng)基，加入2 mL無血清的培養(yǎng)基室溫放置1 h。取5 μg重組Bacmid質(zhì)粒以及6 μL脂質(zhì)體（Invitrogen，美國(guó)），分別用無血清培養(yǎng)基稀釋至100 μL，將兩者混合。靜置15-40 min 后，向脂質(zhì)體和DNA的混合液中加入800 μL培養(yǎng)基，混勻，移入35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6 h。移去轉(zhuǎn)染液，添加2 mL含10%血清的培養(yǎng)基，混勻，培養(yǎng)72 h后倒置熒光顯微鏡下觀察是否有熒光信號(hào)。離心回收上清，即為P1病毒貯液，4℃避光保存。

按照2×106個(gè)細(xì)胞/孔的量將Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)入35 mm的培養(yǎng)皿中，貼壁生長(zhǎng)至少1 h。每孔加入適量的上述P1病毒貯液，27℃濕盒孵育72 h。500×g離心5 min取上清，即為P2病毒貯液。重復(fù)上述方法擴(kuò)增P3病毒貯液，用于重組Bacmid的高效表達(dá)。

1.2.5 Western blot 檢測(cè) 取P3病毒貯液感染Sf9細(xì)胞，72 h后將細(xì)胞吹起，500×g離心5 min，取適量細(xì)胞沉淀，加50 μL的SDS-PAGE上樣buffer，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，以p44蛋白多克隆抗體為一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔的血清（武漢博士德生物工程有限公司）為二抗，用Western blot法檢測(cè)p44蛋白的表達(dá)。

1.2.6 p44的亞細(xì)胞定位 用P2病毒貯液感染貼壁生長(zhǎng)24 h的Sf9細(xì)胞（覆蓋玻底培養(yǎng)皿50%），27℃培養(yǎng)24 h，移除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，pH7.4）將細(xì)胞洗1遍，加入4%多聚甲醛（北京賽馳生物科技有限公司）（過濾除菌）室溫靜置固定15 min，再用PBS（pH7.4）將細(xì)胞洗1遍；加入透化液［0.25% TritonX-100（上海索萊寶生物科技有限公司）］，室溫靜置10 min；用PBS（pH7.4）洗滌細(xì)胞，加熒光染料hoechst 33258染核5-10 min，然后用PBS洗3遍，再加入1 mL PBS。激光共聚焦顯微鏡（TCS SP2，Leica，德國(guó)）觀察綠色熒光分布情況。

1.2.7 序列統(tǒng)計(jì)分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將DpCPV 1基因組S8片段，放入NCBI上進(jìn)行Blast序列比對(duì)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。根據(jù)已經(jīng)公開的CPV的S8片段進(jìn)行比對(duì)，利用Mega4.0分析軟件進(jìn)行聚類分析，并采用軟件 ClustalW和PHYLIP3.67的鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其核酸和氨基酸序列比對(duì)的bootstrapping數(shù)值分別為0.01和0.2。

2 結(jié)果

2.1 DpCPV 1基因組S8片段和其編碼非結(jié)構(gòu)蛋白p44的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析，DpCPV 1 基因組S8片段與舞毒蛾質(zhì)型多角體病毒（LdCPV 1）基因組S8片段具有最高的序列同源性（99%），與另外兩株DPCPV（AY211092.1和AF389469.1）序列同源性均為98%；分別與3株家蠶質(zhì)型多角體病毒（BmCPV 1）Strain H、Strain I和Strain suzhou 對(duì)應(yīng)片段的同源性為84%、83%和81%（圖1）。

圖1 DpCPV1基因組S8片段的核酸系統(tǒng)發(fā)育樹

DpCPV 1 S8片段編碼非結(jié)構(gòu)蛋白p44的系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示：p44蛋白與LdCPV 1、BmCPV 1 strain H和冬尺蠖蛾質(zhì)型多角體病毒（ObCPV 18）的相應(yīng)非結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列同源性分別為99%、85%和 35%。另外，我們檢測(cè)到了p44蛋白與3株鞘脂菌屬（Sphingobium）細(xì)菌的氨基脫氧分枝酸裂解酶（aminodeoxychorismate lyase）有27%的氨基酸序列同源性（圖2）。

圖2 DpCPV 1非結(jié)構(gòu)蛋白p44的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 DpCPV S8片段的分子克隆和抗體制備

以pTS8F和pTS8R為正反向引物，以DpCPV 1基因組S8片段為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段大小約為1 170 bp（圖3-A）。將S8連接至pET28a載體上，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。用BamHⅠ和Hind III雙酶切驗(yàn)證正確后（圖3-B），命名為pET28a-S8。經(jīng)測(cè)序，將鑒定正確的克隆質(zhì)粒pET28a-S8轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，加IPTG誘導(dǎo)后離心收集菌體，進(jìn)行SDSPAGE分析。結(jié)果（圖4）顯示，檢測(cè)到插入的S8片段的載體有相應(yīng)蛋白的表達(dá)，蛋白大小約為51 kD。因插入的S8片段后面攜帶了一個(gè)His純化標(biāo)簽（大小約7 kD），所以實(shí)際插入S8片段表達(dá)的蛋白大小為44 kD，與p44蛋白大小相符。

圖3 S8原核表達(dá)載體的構(gòu)建

圖4 SDS-PAGE檢測(cè)p44誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

通過His純化標(biāo)簽經(jīng)Ni-NTA純化樹脂純化包涵體的目的蛋白后，所得純化蛋白免疫家兔，制備p44蛋白的多克隆抗體 anti-p44。

2.3 重組病毒載體構(gòu)建

將S8片段克隆至pFastBac-eGFP和pFastBac-Dual質(zhì)粒上，構(gòu)建載體。用XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切驗(yàn)證后，分別命名為pFast-S8和pFast-S8-eGFP（圖5）。分別將pFast-S8、pFast-S8-eGFP和pFastBacDual（空載對(duì)照）轉(zhuǎn)座到DH10B感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后提取并鑒定正確的Bacmid DNA（圖6）。

圖5 酶切驗(yàn)證pFast-S8

圖6 Bac-S8的PCR驗(yàn)證

2.4 p44的真核表達(dá)的Western blot 檢測(cè)

用構(gòu)建的重組Bacmid-S8病毒轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況（圖7-A）。然后以anti-p44為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔血清抗體為二抗，經(jīng)Western blot檢測(cè)DpCPV 1 S8編碼蛋白p44在昆蟲細(xì)胞Sf9內(nèi)表達(dá)情況。結(jié)果（圖7-B）顯示，Bacmid-S8感染的Sf9細(xì)胞（第1泳道）在35 kD處有明顯條帶，而空白的Sf9細(xì)胞（第3泳道）和經(jīng)Bacmid-S7感染的Sf9細(xì)胞（第2泳道）作為陰性對(duì)照，未檢測(cè)出條帶。第1泳道檢測(cè)到的條帶是p44蛋白的真核表達(dá)蛋白，大小為35 kD，但是比原核表達(dá)的p44蛋白小了9 kD。

圖7 p44蛋白的真核表達(dá)SDS-PAGE（A）及Western blot（B）檢測(cè)

2.5 非結(jié)構(gòu)蛋白p44蛋白的亞細(xì)胞定位

用P3代病毒感染昆蟲細(xì)胞Sf9后24 h，用激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果表明，昆蟲細(xì)胞Sf9被桿狀病毒感染后，細(xì)胞核明顯增大，經(jīng)熒光染料 Hoechst 33258染洗后，紫色部位為細(xì)胞核。融合了p44的eGFP的蛋白則主要聚集在細(xì)胞質(zhì)中（圖8-A），而未融合p44的EGFP均勻地分布于整個(gè)細(xì)胞中（圖8-B），說明S8片段編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白p44主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。

圖8 融合了EGFP的p44在昆蟲細(xì)胞中的定位

3 討論

本研究通過克隆 DpCPV 1基因組S8片段到原核表達(dá)載體BL21內(nèi)，原核表達(dá)p44蛋白。經(jīng)SDSPAGE電泳檢測(cè)到誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白大小約51 kD，這是因?yàn)樵跇?gòu)建表達(dá)S8片段的后面添加了一個(gè)His純化標(biāo)簽，純化標(biāo)簽的蛋白大小約7 kD，因此DpCPV 1基因組S8片段原核表達(dá)蛋白的大小約44 kD，與p44的蛋白大小相符。將DpCPV 1 S8片段原核表達(dá)蛋白免疫家兔，制備了p44的多克隆抗體。Western blot結(jié)果顯示DpCPV 1 S8片段編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白p44實(shí)際大小為44 kD，與推測(cè)的蛋白分子量大小結(jié)果一致。

采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將DpCPV 1基因組 S8片段單獨(dú)插入以及S8片段與綠色熒光蛋白基因（egfp）以C端融合的方式插入苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（Autographa californica multiple nucleocapsid NPV，AcMNPV）基因組中，獲得重組的桿狀病毒質(zhì)粒（Bac-S8和Bac-S8-eGFP），轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9后進(jìn)行Western blot檢測(cè)和蛋白的亞細(xì)胞定位的觀察。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Bac-S8在昆蟲細(xì)胞Sf9中獲得高效表達(dá)，但表達(dá)的p44蛋白的大小為35 kD，比原核表達(dá)的p44蛋白（44 kD）略小。推測(cè)DpCPV 1 S8片段表達(dá)的蛋白p44在昆蟲細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了切割修飾，這種蛋白切割現(xiàn)象此前也在DpCPV 1的其它片段表達(dá)的蛋白中發(fā)現(xiàn)過。如Jin等［15］將DpCPV 1感染甜菜夜蛾幼蟲，取中腸樣品經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DpCPV 1 S7片段編碼的蛋白p50在感染的第3天表達(dá)的蛋白大小為50 kD，在感染的第5天發(fā)現(xiàn)該蛋白發(fā)生切割修飾，修飾后的蛋白大小為31 kD，上述數(shù)據(jù)證實(shí)了DpCPV S7片段在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白發(fā)生了切割。因此，我們推測(cè)p44蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了降解或者被昆蟲細(xì)胞的某些酶切割或修飾。

用激光共聚焦顯微鏡觀察Bac-S8-eGFP的融合蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，融合p44的綠色熒光蛋白（eGFP）主要聚集在細(xì)胞質(zhì)中，沒有融合eGFP的分布于整個(gè)細(xì)胞，說明 DpCPV 1的非結(jié)構(gòu)蛋白p44定位于細(xì)胞質(zhì)中。類似的情況也發(fā)生在DpCPV 1 S7片段編碼的結(jié)構(gòu)蛋白p50，Jin等［15］研究發(fā)現(xiàn)p50-eGFP同樣定位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。而DpCPV 1的S9片段編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5，免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NS5蛋白定位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜上并且跨膜結(jié)構(gòu)域位于蛋白質(zhì)N端的57-71 aa［16］。相關(guān)蛋白的定位研究發(fā)現(xiàn)，為研究病毒的生命周期具有重要作用。

4 結(jié)論

本研究利用Bac-to-Bac系統(tǒng)首次對(duì)DpCPV 1 S8片段進(jìn)行了真核表達(dá)和昆蟲細(xì)胞的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)S8片段能夠定位到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Expression of Dendrolimus puntatus Cytoplasmic Polyhedrosis Virus（DpCPV1）Non-structural Protein p44 in Bac-to-Bac System and Localization in Infected Cells

PENG Han1WANG Hong-xiu2WANG Jin-chang3GUAN Li-mei3JIN Liang3WAN Cui-xiang1
（1. School of Life Sciences and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330077；2. Institute of Agricultural Applied Microbiology，Jiangxi Agricultural Academy of Sciences，Nanchang 330200；3. Institute of Microbiology，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330029）

In order to study the function of the Dendrolimus puntatus cytoplasmic polyhedrosis virus（DpCPV1）protein p44，PCR primers were designed according to the sequence of genome segment S8，the prokaryotic expression vector for genome segment 8 of DpCPV1 was constructed，and the polyclonal antibodies were prepared by immunizing rabbits with the purified expressed protein. Three recombinant plasmids（Bacmid-p44，Bacmid-p44-eGFP and Bacmid-eGFP）were constructed using Bac-to-Bac Baculovirus expression system.，and they were transfected into insect cell Sf9 for the expression. The detection and subcellular localization of the protein were determined by Western blot. The results from Western blot showed that the actual expressed protein of Bacmid-S8 in Sf9 was 35 kD，smaller than the one（44 kD）expressed in the prokaryotic expression vector. The subcellular localization of fusion protein of p44-eGFP was determined by laser scanning confocal microscope，and the fused green fluorescent protein（eGFP）of p44 concentrated in the cytoplasm of the cells，while infused eGFP distributed throughout the whole cell，indicating that p44 protein of DpCPV1 was localized mainly in the cytoplasm of the cell. This work was the first study of having the eukaryotic expression of DpCPV1 S8 and subcellular location of it in insect cells，

Dendrolimus puntatus cytoplasmic polyhedrosis virus；polyclonal antibody；eukaryotic expression；cellular localization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.020

2015-05-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260031），江西省科技重大專項(xiàng)基金項(xiàng)目（2014ACF60002），中科院開放基金項(xiàng)目（2014AEM003）

彭晗，女，碩士，研究方向：昆蟲病毒學(xué)；E-mail：penghan0830@163.com；王洪秀為本文并列第一作者

靳亮，男，博士，研究方向：昆蟲病毒學(xué)；E-mail：Jinliang079@163.com萬翠香，女，博士，副教授，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)；E-mail：cuixiangwan@ncu.edu.cn