鐵皮石斛莖段快繁技術(shù)的研究

歐陽凡董文賓付瑜樊成李雨虹

（1. 陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021；2. 陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，西安 710048）

鐵皮石斛莖段快繁技術(shù)的研究

歐陽凡1董文賓1付瑜1樊成2李雨虹1

（1. 陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021；2. 陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，西安 710048）

通過組織培養(yǎng)建立鐵皮石斛快繁體系，為更好利用開發(fā)鐵皮石斛提供原料。以鐵皮石斛莖段為外植體，研究不同種類和濃度配比的激素和天然添加物對組培過程中不定芽的誘導(dǎo)和叢生芽的增殖的影響，篩選出各階段最適培養(yǎng)基。結(jié)果表明，不定芽誘導(dǎo)最適激素配比為NAA 1.0 mg/L + BA 2.0 mg/L，叢生芽增殖最適培養(yǎng)基為NAA 0.5 mg/L + BA 1.0 mg/L +香蕉100 g/L +活性炭100 g/L。以莖段為途徑建立鐵皮石斛快繁體系高效穩(wěn)定的獲得組培苗是可行的。

鐵皮石斛；不定芽；叢生芽；快繁

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo），又名黑節(jié)草，為蘭科石斛屬多年生草本植物，主要分布于浙江、云南及陜西等地。鐵皮石斛具有極高的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值，其新鮮莖或干燥莖均可入藥，民間有“救命仙草”之美譽(yù)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明鐵皮石斛具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力等諸多功效［1］。鐵皮石斛自然條件下不易萌發(fā)，生長極其緩慢［2］，對生長環(huán)境條件要求苛刻。由于長期的過度采集加上生態(tài)環(huán)境的惡化，鐵皮石斛野生資源日趨稀少。為保護(hù)這一珍稀物種，近年來國內(nèi)外廣泛開展鐵皮石斛組織快繁技術(shù)的研究，已確定了通過組織培養(yǎng)培育大量試管苗，發(fā)展鐵皮石斛人工栽培是解決鐵皮石斛資源緊缺問題的有效途徑［3］。

目前鐵皮石斛外植體材料選用最為廣泛的是種子和莖段。以種子作為外植體，操作簡單，增殖系數(shù)高，分化能力較強(qiáng)［4］，但后代性狀不穩(wěn)定易變異。而用莖段為外植體誘導(dǎo)時間短、發(fā)生過程簡單，能較好地保持母本的生物學(xué)性狀和經(jīng)濟(jì)性狀［5］，但增值系數(shù)低、苗存活率低。本研究探討了不同激素和天然添加物對莖段組培過程中叢生芽的誘導(dǎo)和增殖的影響，并篩選出最佳培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛為浙江雁蕩山軟桿矮腳品種，由陜西省略陽縣秦脈生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 滅菌處理 選取長勢良好，均勻，葉片繁茂的鐵皮石斛當(dāng)年生幼嫩莖段，流動自來水沖洗10 min后用濾紙擦凈。在紫外線照射20 min過的超凈工作臺上用剪刀將莖段切成長度為1-1.5 cm的帶節(jié)小莖段，先用75%酒精浸泡1 min，后用0.1%升汞消毒10 min，無菌水沖洗6-7次待用。

1.2.2 不定芽的誘導(dǎo)

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 將消毒好的莖段接種在添加不同濃度6-BA、NAA和蔗糖的不同處理的MS基本培養(yǎng)基上，進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)。每個處理接種外植體6瓶，每瓶接種5個莖段，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)數(shù)和誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率（%）=（誘導(dǎo)出不定芽的外植體數(shù)/總外植體數(shù)）×100%。

1.2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)選出每種因素最優(yōu)濃度，進(jìn)行L9（34）三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)操作處理同上。

1.2.2.3 叢生芽的增殖 在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d后，選取長1-2 cm的不定芽切下，接種到添加不同6-BA和NAA的9種不同處理的MS基本培養(yǎng)基上，進(jìn)行叢生芽增殖。每個處理接不定芽6瓶，每瓶接種4個芽，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后繼代培養(yǎng)，以30 d為一個周期，90 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的繁殖系數(shù)。

繁殖系數(shù)=增殖所得叢生芽的總芽數(shù)/接種長出叢生芽的芽數(shù)

選取長勢均勻一致的叢生芽，接種到附加不同天然添加物的基本培養(yǎng)基，每個處理接種叢生芽2株，每瓶接種10瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)芽的株高、增殖芽數(shù)和增殖葉數(shù)。

1.2.3 培養(yǎng)條件 實(shí)驗(yàn)采用的培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時間為12 h/d。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 運(yùn)用SPSS23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析和顯著性研究。

2 結(jié)果

2.1 單一因素對不定芽誘導(dǎo)的影響

生長調(diào)節(jié)因子植物激素，是植物組織培養(yǎng)中發(fā)揮生物學(xué)效力最強(qiáng)的培養(yǎng)因素，在植物組織培養(yǎng)中最常用的是生長素和細(xì)胞分裂素。本實(shí)驗(yàn)選用了其中最具代表性的NAA和BA來研究。在接種莖段后的7-15 d內(nèi)，不同處理瓶內(nèi)的莖段開始萌發(fā)出細(xì)嫩小芽。空白對照率先萌芽，添加激素的處理組略有遲緩，但后期從芽的數(shù)目和芽的健壯情況來說都明顯優(yōu)于空白組。如圖1所示，隨著BA的加入會先減弱不定芽的誘導(dǎo)，隨著濃度增高又明顯促進(jìn)了芽的誘導(dǎo)，當(dāng)達(dá)到2.0 mg/L后其對芽的誘導(dǎo)開始起到抑制作用。如圖2所示，NAA對不定芽誘導(dǎo)的影響是先增大后減小，在0.6-1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用，在0.8 mg/L到達(dá)最高點(diǎn)。如圖3所示，蔗糖對不定芽誘導(dǎo)率的影響較為平緩，誘導(dǎo)率維持在一定水平內(nèi)波動，可以發(fā)現(xiàn)30 g/L的蔗糖添加量有最大的促生芽作用。

圖1 BA濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

根據(jù)前面單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得出每種因素的最佳濃度，設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，如表1所示。

以NAA、BA、蔗糖綜合作用進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果（表2）表明，3種因素以適當(dāng)比例綜合作用比單獨(dú)使用時不定芽的誘導(dǎo)率要優(yōu)于任何一種激素單獨(dú)處理。處理8（NAA 1.0 mg/L+BA 2.0mg/L+蔗糖26 g/L）達(dá)到了86%的最高誘導(dǎo)率（圖4），處理9次之，相比于單一因素有顯著的綜合促進(jìn)作用。由表3方差分析可知，NAA和BA對不定芽的誘導(dǎo)影響顯著，且BA要重要于NAA，蔗糖對其影響不顯著。綜合單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得出不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基最優(yōu)配方為：NAA 1.0 mg/L+BA 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L。

圖2 NAA濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響

圖3 蔗糖添加量對不定芽誘導(dǎo)的影響

表1 三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖4 不定芽的誘導(dǎo)

表2 三因素三水平正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 三因素三水平正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.3 不同激素配比對叢生芽增殖的影響

針對叢生芽的增殖，設(shè)計(jì)了兩因素三水平的完全隨機(jī)實(shí)驗(yàn)，增殖的叢生芽如圖5所示。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）表明，所進(jìn)行的激素配比都能顯示對芽的增殖有促進(jìn)作用。當(dāng)NAA在較低濃度時BA濃度的變化對叢生芽增殖的影響無明顯區(qū)別，隨著NAA濃度的提高，BA對叢生芽增殖的影響呈現(xiàn)著先增大后減小的趨勢，說明或高過低濃度的BA對芽的增殖有抑制作用。整體來看，NAA對芽增殖的影響隨著濃度增高而逐漸開始抑制。選取合適的濃度對芽的增殖有顯著的促進(jìn)作用，其中處理5（圖5-A）最優(yōu)達(dá)到了4.5倍的繁殖系數(shù)，莖稈粗壯葉片繁茂叢生芽眾多，其次處理1（圖5-B）的繁殖倍數(shù)有3.6，表明此激素配比下也有明顯的促生長作用。綜合來看，得出叢生芽增殖的最優(yōu)激素配比為：NAA 0.5 mg/L +BA 1.0 mg/L。

圖5 叢生芽的增值

表4 兩因素三水平完全隨機(jī)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 不同天然添加物對叢生芽增殖的影響

在鐵皮石斛的組培快繁中，天然添加物的加入往往會對組培苗的生長造成一定的影響。本次實(shí)驗(yàn)中選用了香蕉汁、椰子汁、馬鈴薯汁和活性炭，結(jié)果（表5）顯示，對比空白組，香蕉汁（圖6-a）在株高、增殖芽數(shù)和增殖葉數(shù)都有一定的升高，尤其是葉片數(shù)顯著增多，表明香蕉汁對叢生芽的生長有綜合性多方面的促進(jìn)作用，尤其是促進(jìn)葉的發(fā)育。椰汁與空白對照相比無明顯的差異，可見椰汁的加入對生長無明顯促進(jìn)或抑制作用。馬鈴薯汁的加入有效增加了株高和增殖芽數(shù)，說明馬鈴薯汁能促進(jìn)莖和芽的生長，但對葉的增殖有抑制作用，可能是馬鈴薯所含的活性物質(zhì)影響了葉的增殖機(jī)制?；钚蕴康募尤耄▓D6-B）顯著促進(jìn)了叢生芽各項(xiàng)生長指標(biāo)，可能與吸附代謝廢物改善生長環(huán)境有關(guān)。比較來看，香蕉汁的功能最全面且顯著，活性炭可促進(jìn)叢生芽增殖。從而得出叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為：NAA 0.5 mg/L + BA 1.0 mg/L +香蕉汁100 g/L +活性炭100 g/L。

圖6 不同天然添加物對叢生芽增殖的影響

3 討論

培養(yǎng)基中生長素與細(xì)胞分裂素的濃度及配比對鐵皮石斛組織培養(yǎng)中芽的誘導(dǎo)與分化起著決定性的作用，這在本實(shí)驗(yàn)中有著明顯體現(xiàn)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，單一的NAA或BA在一定濃度內(nèi)對不定芽的誘導(dǎo)有明顯促進(jìn)作用，過高或過低可能起到抑制作用。在NAA和BA交叉配比的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，明顯優(yōu)于單一激素作用，也證明了生長素與細(xì)胞分裂素的協(xié)同調(diào)控作用在組織培養(yǎng)中的重要性。在正交實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)率最高的激素配比組誘導(dǎo)出的芽不一定是最為健壯的，誘導(dǎo)率低的處理組長出的芽可能更為健壯，可能是因?yàn)橥煌庵搀w誘導(dǎo)出的芽越多其吸收的營養(yǎng)物質(zhì)得到分流越多，影響了長勢。要使芽誘導(dǎo)率既高且健壯，可能需研究芽誘導(dǎo)的動力學(xué)過程，檢測指標(biāo)也不應(yīng)是單一的誘導(dǎo)率。另外，進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中所有處理組都直接誘導(dǎo)出了不定芽，并未出現(xiàn)宋順等［6］實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)出原球莖的現(xiàn)象，可能是原球莖的誘導(dǎo)需要更高濃度的BA。

控制細(xì)胞分裂素類和生長素類兩者的濃度，可以控制芽或根的分化，細(xì)胞分裂素/生長素的比值大時有利于芽的形成，比值小時則有利于生根［7］。本實(shí)驗(yàn)也證明了在基本培養(yǎng)基中添加低濃度的NAA、6-BA能促進(jìn)腋芽誘導(dǎo)和增殖，高濃度的NAA、6-BA不利于腋芽的萌發(fā)和分化，選取合適的濃度和配比對組培苗的生長有關(guān)鍵性作用。另外與前人研究出的激素配比［8，9］不同，可能與選用石斛品種和外界環(huán)境控制有關(guān)。

表5 不同天然添加物對叢生芽增殖的影響

天然添加物的加入往往是利用其豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，使組培苗更易能適應(yīng)于培養(yǎng)基環(huán)境，從而達(dá)到快速繁殖的目的。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)香蕉汁對叢生芽有顯著促生長作用，尤其是葉片增殖上。馬鈴薯汁對從生芽增殖效果不明顯，甚至還會抑制葉片生長。這與蔣林等［10］的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，香蕉泥對石斛芽的增殖和生根壯苗效果突出而土豆泥主要用于壯苗?；钚蕴康募尤胗行Т龠M(jìn)了組培苗生長不褐化，可能與吸附了代謝產(chǎn)生的廢物和減弱光照有關(guān)。

4 結(jié)論

以莖段為途徑建立鐵皮石斛快繁體系高效穩(wěn)定的獲得組培苗是可行的。生長素與細(xì)胞分裂素的協(xié)同調(diào)控作用在組織培養(yǎng)中很重要，得到的不定芽誘導(dǎo)最適激素配比為：NAA 1.0 mg/L+BA 2.0 mg/L；叢生芽增殖最適培養(yǎng)基為NAA 0.5 mg/L+BA 1.0 mg/L+香蕉100 g/L+活性炭100 g/L；香蕉汁和活性炭的加入能有效促進(jìn)組培苗生長。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

On the Rapid Propagation Technique of Stem Segments of Dendrobium officinale

OUYANG Fan1DONG Wen-bin1FU Yu1FAN Cheng2LI Yu-hong1
（1. College of Food & Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an 710021；2. Shaanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Xi'an 710048）

A rapid propagation system was established by tissue culture in order to provide raw materials for better use and development of Dendrobium officinale. Using stem segments of D. officinale as explants，effects of the differential kinds and concentrations of plant growth regulators and natural additives on the induction of adventitious shoots growth and proliferation of cluster shoots were studied；and the optimal mediums at different culture stages were selected. Results showed that the optimal hormone ratio for induction of adventitious shoots was NAA 1.0 mg/L and BA 2.0 mg/L，a combination of NAA 0.5 mg/L，BA 2.0 mg/L，banana juice 100 g/L and activated carbon 100 g/L was the optimal medium for the proliferation of cluster shoots. It is feasible to obtain the efficient and stable plantlets by establishing high efficiency and rapid propagation system from stem segments of D. officinale.

Dendrobium officinale；adventitious shoot；cluster shoot；rapid propagation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.010

2015-05-25

歐陽凡，男，碩士研究生，研究方向：保健食品的研究與開發(fā)；E-mail：oouuyyff@163.com

董文賓，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品新材料制備及應(yīng)用；E-mail：452822092@qq.com