利用分子標(biāo)記技術(shù)改良粳稻不育系的柱頭外露率

蔡之軍李金軍周德銀富昊偉

（1. 浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（所），嘉興 314016；2. 江蘇省興化市農(nóng)業(yè)委員會，興化 225700）

利用分子標(biāo)記技術(shù)改良粳稻不育系的柱頭外露率

蔡之軍1李金軍1周德銀2富昊偉1

（1. 浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（所），嘉興 314016；2. 江蘇省興化市農(nóng)業(yè)委員會，興化 225700）

提高粳稻不育系的柱頭外露率是提高雜交粳稻制種產(chǎn)量最有效途徑。通過雜交、回交等常規(guī)手段將秈稻中控制柱頭外露率的QTLs（qPES3、qPES9及qPES12）導(dǎo)入粳稻，通過系譜選育和分子檢測技術(shù)試圖選育高柱頭外露率粳稻不育系，旨在探索利用分子標(biāo)記技術(shù)改良粳稻不育系柱頭外露率的可行性。研究結(jié)果表明，試驗中獲得的2個粳稻不育系為攜帶qPES3+qPES12的雙聚體，其柱頭外露率及異交結(jié)實率表型值顯示：調(diào)控秈稻高柱頭外露率QTLs能夠在粳稻背景中表達(dá)，但存在基因型差異；分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)是改良粳稻不育系柱頭外露率的有效手段。

粳稻不育系；柱頭外露；分子標(biāo)記

在20世紀(jì)80年代我國雜交粳稻出現(xiàn)了迅速發(fā)展，但其種植面積所占粳稻總面積的比例僅3%左右，遠(yuǎn)小于雜交秈稻所占的70%［1］。近年來，雖然出于國家糧食安全的需要，國家及科研單位加大力度研究和推廣，但雜交粳稻的發(fā)展速度仍然緩慢，究其原因雜交粳稻的低制種產(chǎn)量嚴(yán)重影響了其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展［2］。

粳稻不育系的異交結(jié)實率低是制約雜交粳稻制種產(chǎn)量的主要因素。田大成等［3］研究認(rèn)為，柱頭外露穎花與非外露穎花異交能力存在巨大差異，前者結(jié)實率比后者一般高3-4倍，依靠柱頭外露穎花開花當(dāng)天及以后接受花粉受精結(jié)實是異交結(jié)實的重要途徑，開花當(dāng)天異交結(jié)實一般不到總粒數(shù)的50%，而開花第2天后一般可占50%。李慶榮［4］認(rèn)為柱頭外露穎花的結(jié)實率占制種異交結(jié)實的 70%-80%，是構(gòu)成制種產(chǎn)量的主體。楊保漢等［5］研究認(rèn)為，在自然條件下，不育系柱頭外露率每提高1%，結(jié)實率可提高0.74%-0.92%，每公頃可增產(chǎn)47-68 kg。林建榮等［6］研究表明保持系柱頭外露與不育系柱頭外露存在著極著的遺傳關(guān)系。由浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的晚粳稻嘉58，其對應(yīng)的BT型不育系嘉58A，不育性穩(wěn)定、不育度高，綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良，具有良好的配合力，但柱頭外露低（約為1.0%），利用嘉58A配制的雜交粳稻（組合）皆因制種產(chǎn)量低而影響在生產(chǎn)上的應(yīng)用。本研究試圖將控制水稻柱頭外露率的QTL導(dǎo)入嘉58A，探索利用分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行人工創(chuàng)制高柱頭外露率粳稻不育系的技術(shù)可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

以天津市農(nóng)科院提供的高柱頭外露率育種材料T60B（來自50S，秈型，柱頭總外露率73%）為父本，浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（所）三系粳稻保持系嘉58B（柱頭總外露約為1.0%）為母本進(jìn)行雜交和回交，嘉隆17B和嘉隆43B是嘉58B高柱頭外露率基因?qū)胂?。試驗在浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（所）試驗農(nóng)場進(jìn)行，群體及系圃均采用單本植，插植規(guī)格為23.0 cm×16.7 cm，水肥管理及病蟲害防治按一般生產(chǎn)用田。

1.2 方法

1.2.1 考察柱頭外露率 2014年6月，種植嘉隆17A、B系，嘉隆43A、B系和嘉58A、B系鑒定圃（各1 000株），待不育系穗楊花期隨機(jī)選取100個單株的主莖穗，通過目測調(diào)查每穗的總穎花數(shù)、單邊柱頭外露穎花數(shù)和雙邊柱頭外露穎花數(shù)，計算單邊柱頭外露率和雙邊柱頭外露率及總外露率。

1.2.2 分子標(biāo)記檢測 50S攜帶的柱頭外露的QTLs連鎖標(biāo)記為SSR標(biāo)記。檢測目標(biāo)QTL的水稻DNA采用趙國珍等［7］提法提取，PCR反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL，滅菌水20 μL和混合物16 μL。其中混合物為：滅菌水8.0 μL，dNTP 2.8 μL，Buffer 4.0 μL，左右引物各0.5 μL，Taq酶0.2 μL。PCR擴(kuò)增程序為：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，35個循環(huán)；72℃ 4 min；25℃ 1 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 考察異交結(jié)實率 2014年6月至10月在浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（所）農(nóng)場，用花時中等偏早的秈粳交恢復(fù)系HR511為父本，嘉隆43A、嘉隆17A和嘉58A為母本，進(jìn)行大田小區(qū)制種。根據(jù)不育系的始播歷期合理安排播種期。試驗中父本HR511安排在6月13日播種，母本安排在6月6日播種，使父母本均能在9月3日左右始穗。父母本行比為2∶4，行距23.0 cm，株距16.7 cm，單本植，每個不育系制種小區(qū)面積約為30 m2，2次重復(fù)。父母本楊花后，每個小區(qū)從不育系中間2行選取整齊一致的穗子20個進(jìn)行掛牌，選其中10個穗，午后觀察柱頭外露情況，并對柱頭單雙外露的穎花用油筆做好記號，每天分2個時段（10：30-11：00，11：30-12：00）進(jìn)行人工輔助趕粉，直到父本的穎花開完為止齊穗后25 d，同時選取非標(biāo)記穗10個，調(diào)查籽粒的柱頭外露粒的柱頭夾持及結(jié)實情況。采用DPS軟件對調(diào)查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.4 考察外露柱頭的結(jié)實率 采用延遲授粉法，使父本開花時隔離，標(biāo)記每天開的母本穎花（100粒），去除閉穎粒和未開花粒，然后在同一天使標(biāo)記的穎花接受父本花粉，閉穎后開花標(biāo)記粒的柱頭外露情況，用柱頭外露粒結(jié)實率作為衡量柱頭活性的大小。分別于開花后0、1、2、3、4、5、6和7 d授粉計算柱頭外露粒結(jié)實率，計算公式為：某天外露柱頭結(jié)實率（%）=柱頭外露粒結(jié)實粒數(shù)/柱頭外露粒數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 柱頭外露QTL分子檢測及表型

利用分子檢測能夠?qū)⒄{(diào)控柱頭外露的QTL（圖1和表1）導(dǎo)入粳稻品系中（表2，部分導(dǎo)入系）。本試驗中qPES3、qPES12連鎖標(biāo)記PSM377、RM270在T60B和嘉58B多態(tài)性顯著（圖2），導(dǎo)入系嘉隆11A、嘉隆13A導(dǎo)入了qPES3+qPES9，嘉隆17A、嘉隆43A和嘉隆47A入了qPES3+qPES12，嘉隆51A、嘉隆53A導(dǎo)入了qPES9+qPES12，嘉隆56、嘉隆62A導(dǎo)qPES3+qPES9+qPES12；嘉隆17B和嘉隆43B早實現(xiàn)綜合農(nóng)藝性狀的穩(wěn)定，株型特征親嘉58B，其不育系為嘉隆17A和嘉隆43A，經(jīng)多代分子檢測顯示嘉隆17B、嘉隆43B均攜帶qPES3和qPES12位點（圖3）。表2中列出的9個系表型值，有5系的柱頭外露率超過60.0%，2系在40.0%-50.0%，2系在30.0%-40.0%，較嘉58A均表現(xiàn)極顯著提高，且柱頭外露率（qPES3+qPES9+qPES12）＞柱頭外露率（qPES3 +qPES12或qPES3 +qPES9）。

圖1 幾個粳稻不育系的柱頭外露表現(xiàn)

表1 50S控制柱頭外露率的QTL定位［8］

圖2 PSM377和RM270在親本間多態(tài)性分析

圖3 柱頭外露QTL（qPES3和qPES12）的分子標(biāo)記檢測

2.2 柱頭外露粳稻不育系的異交結(jié)實率

本研究調(diào)查了嘉隆17A、嘉隆43A和嘉58A三個不育系的楊花期外露柱頭籽粒和柱頭發(fā)生夾持籽粒的結(jié)實情況。結(jié)果（表3和圖4）表明，嘉隆17A的柱頭單邊外露籽粒結(jié)實率為71.22%，柱頭雙邊外露籽粒為73.37%，占總結(jié)實粒的比率分別為64.01%和28.65%，二者對總結(jié)實率的貢獻(xiàn)率超過82.0%，嘉隆43A的柱頭單雙邊外露籽粒結(jié)實率分別為67.53%和62.69%，占其總結(jié)實粒比例53.75%和28.72%，對總結(jié)實粒的貢獻(xiàn)率超過81.0%。

表3同時表明，嘉隆17A單雙邊柱頭夾持率為99.65%和97.0%，嘉隆43A分別為99.0%和97.8%，單柱頭的夾持率略高于雙柱頭的夾持率，嘉58A柱頭不發(fā)生夾持現(xiàn)象，嘉隆17A單雙邊柱頭夾持粒結(jié)實率分別達(dá)75.16%和72.94%，占總結(jié)實粒的比超過85.0%，嘉隆43A表現(xiàn)類似規(guī)律；研究還表明嘉隆17A和嘉隆43A的夾持粒結(jié)實率均略高于其外露粒結(jié)實粒。

2.3 花后外露柱頭活性的動態(tài)變化

圖5顯示，3個粳稻不育系的楊花當(dāng)天（花后0 d）柱頭活性最強(qiáng)，均接近80.0%的結(jié)實率，其中柱頭外露不育系嘉隆17A和嘉隆43A的柱頭略高于柱頭非外露不育系嘉58A，在花后1-6 d，嘉58A花后1 d后柱頭活性激劇下降，花后2 d后柱頭基本沒有活性，與嘉58A相比，嘉隆17A和嘉隆43A的柱頭在花后1.5-5 d仍有較高的授粉結(jié)實能力，柱頭活力下降幅度較平緩。其中花后1-5 d嘉隆43A柱頭活性高于嘉隆17A，這可能與嘉隆43A雙柱頭外露率高于嘉隆17A，表3中嘉隆17A和嘉隆43A的雙柱頭外露籽粒結(jié)實率均高于其對應(yīng)的單柱頭外露籽粒的結(jié)實率，進(jìn)一步驗證上述結(jié)論。

表2 柱頭外露QTLs部分導(dǎo)入系的A/B系柱頭外露表現(xiàn)

表3 不育系柱頭外露粒和夾持粒的結(jié)實情況

圖4 幾個粳稻不育系柱頭夾持情況

圖5 幾個粳稻不育系外露柱頭籽?；ê蠡钚詣討B(tài)

3 討論

李晨等利用栽培稻和野生稻的BC1群體，將2個控制水稻柱頭外露的QTL分別定位于第5染色體R2289-CT1553間和第8染色體的G1149-R1963間，且認(rèn)為在5號和8號染色體的QTL貢獻(xiàn)率達(dá)到10.9%和11.4%［9］；Miyata等［10］在第3條染色體的C53358-AL607101間定位了1個控制柱頭外露率QTL，并利用分子標(biāo)記進(jìn)行前景選擇和背景選擇，獲得含有IR24柱頭外露率主效基因的新品系，證明可以利用分子標(biāo)記輔助選擇柱頭外露主效QTL。鄧應(yīng)德等［11］利用秈粳交宜糯5號/優(yōu)B F2群體在第2、5和8染色體上定位到控制柱頭外露率的QTL。尹成［12］和沈圣泉等［13］在考慮到基因互作和GE互作的前提下，檢查出位于6號染色體貢獻(xiàn)率達(dá)到19.1%的主效QTL，雖然以上研究發(fā)現(xiàn)的水稻柱頭外露的QTL貢獻(xiàn)率都達(dá)到10%以上，但是對其應(yīng)用限制，還主要是對QTL的緊密連鎖的分子標(biāo)記發(fā)掘不夠，不能高效精確實現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇。筆者試圖利用T60B攜帶控制柱頭外露的QTL連鎖標(biāo)記，將qPES3、qPES12成功導(dǎo)入粳稻背景中并獲得qPES3+qPES12的穩(wěn)定表達(dá)粳稻不育系，研究結(jié)果再次證明利用分子標(biāo)記可以有效輔助人工創(chuàng)制高柱頭外露率的粳稻不育系。本研究中的兩個不育系柱頭外露表現(xiàn)差異明顯，可能與人工選擇背景有關(guān)，即qPES3、qPES12表達(dá)存在基因型差異，與其保持系相比，不育系的柱頭外露率顯著高于對應(yīng)保持系，這可能因為在粳稻背景下控制柱頭外露QTL也存在不育胞質(zhì)效應(yīng)，與秈稻中報道一致。

秈稻不育系的柱頭外露穎花在開花當(dāng)天及其后的3 d內(nèi)都具有較強(qiáng)的受精能力，有花粉供給時柱頭外露率在60%以上，則結(jié)實率一般不低于60%，活性柱頭率98%以上，柱頭活性強(qiáng)的不育系能夠有效利用父本的非及時花粉提高不育系結(jié)實率［14］。筆者研究了粳稻不育系的楊花后柱頭活力的動態(tài)變化，結(jié)果表明，粳稻不育系的柱頭活性在開花當(dāng)天均表現(xiàn)較強(qiáng)，活性柱頭率80%左右，不育系間差異不顯著，但花后1-7 d，柱頭外露不育系的柱頭在花后1-5 d表現(xiàn)較強(qiáng)的接受花粉結(jié)實的能力，無柱頭外露不育系的花后2 d柱頭活性急劇下降、3 d后基本不具備活性，與柱頭外露的秈稻不育系相比，柱頭外露的粳稻不育系活性柱頭率表現(xiàn)較低，但柱頭的活性持續(xù)時間較長。本研究比較了粳稻不育系外露柱頭的夾持情況，結(jié)果認(rèn)為柱頭外露粒95%以上柱頭發(fā)生了夾持現(xiàn)象，粳稻不育系楊花閉穎時柱頭外露粒和籽粒蠟熟黃熟期柱頭夾持粒表現(xiàn)趨勢一致，在育種實踐中可通過考察籽粒的柱頭夾持率來選擇柱頭外露性狀的目的。

4 結(jié)論

本研究通過分子標(biāo)記與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，有效改良了粳稻不育系的柱頭外露率，來自秈稻的QTLs能夠在粳稻中穩(wěn)定表達(dá)。研究結(jié)果證實了分子標(biāo)記技術(shù)在選擇水稻QTLs的可能性和有效性，同時表明要提高粳稻的異交特性仍然要通過利用秈稻的有利性狀來實現(xiàn)。

［1］荊彥輝， 張子軍， 周曉玲， 等. 水稻柱頭外露基因的遺傳及應(yīng)用思考［J］. 農(nóng)業(yè)科技通訊， 2009（8）：40-42.

［2］龍俐華， 舒琨. 提高雜交稻異交率的研究［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2000， 26（3）：167-170.

［3］田大成， 黃三奎， 段永國， 等. 水稻不育系花時和受粉時間與異交結(jié)實率的關(guān)系［J］. 雜交水稻， 2004， 19（3）：50-54.

［4］李慶榮. 柱頭外露率的環(huán)境變異及其在異交結(jié)實中的作用［J］.種子科技， 1995（2）：32-33.

［5］楊保漢. 不育系柱頭外露率及其結(jié)實率研究［J］. 雜交水稻，1997， 12（1）：13-15.

［6］林建榮， 吳明國， 宋昕蔚. 三系粳稻不育系開花習(xí)性與異交結(jié)實率的關(guān)系［J］. 雜交水稻， 2006， 21（5）：69-72.

［7］趙國珍， 賈育林， 嚴(yán)宗卜. 一種高效便捷的水稻DNA提取法及其應(yīng)用［J］. 中國水稻科學(xué)， 2012， 26（4）：495-499.

［8］馮玲玲， 荊彥輝， 黃成， 等. 水稻柱頭外露率的QTL分析［J］.北方水稻， 2010， 40（3）：20-22.

［9］李晨， 孫傳清， 穆平， 等. 栽培稻與普通野生稻兩個重要分類性狀花藥長度和柱頭外露率的QTL分析［J］. 遺傳學(xué)報， 2001，28（8）：746-751.

［10］Miyata M， Yamamoto T， Komori T， Nitta N. Marker-assisted selection and evaluation of the QTL for stigma exsertion under japonica rice genetic background［J］. Theor Appl Genet， 2007，114（3）：539-548.

［11］鄧應(yīng)德， 應(yīng)杰政， 石媛媛， 等. 控制水稻柱頭外露率的數(shù)量性狀基因座初步分析［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2010， 36（4）：373- 376.

［12］尹成， 李平波， 高冠軍， 等. 水稻柱頭外露率QTL定位［J］.分子植物育種， 2014， 12（1）：43-49.

［13］沈圣泉， 莊杰云， 包勁松， 等. 水稻柱頭外露率QTLs定位及其互作分析［J］. 生物數(shù)學(xué)學(xué)報， 2006， 21（4）：610-614.

［14］李楠. 水稻不育系外露柱頭存活率測定及提高措施［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 52（3）：514-517.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Improving the Percentage of Exerted Stigma in CMS Lines of Japonica Hybrid Rice by Molecular Marker-assisted Selection

CAI Zhi-jun1LI Jin-jun1ZHOU De-yin2FU Hao-wei1
（1. Jiaxing Academy of Agricultural Science Research of Zhejiang Province，Jiaxing 314016；2. Agricultural Commission of Xinghua City in Jiangsu Province，Xinghua 225700）

It is the most effective way to improve the yield of seed production of Japonica hybrid rice by enhancing the percentage of exerted stigma in its CMS lines. In this research，QTLs（qPES3，qPES9，qPES12），regulating the percentage of exerted stigma in indica rice，were transmitted into CMS lines of Japonica hybrid rice through crossing and backcrossing，aiming at selecting the CMS lines of Japonica hybrid rice with high percentage of exerted stigma by pedigree breeding and molecular detection technique，i.e.，exploring the feasibility of improving the percentage of exerted stigma in CMS lines of Japonica hybrid rice by molecular marker technique. The research results showed that Jialong17A and Jialong43A，two CMS lines developed in this study，carried both qPES3and qPES12. The phenotypic values of percentage of exerted stigma and outcrossing rate indicated that QTLs expressed in Japonica rice，but displaying difference in various genetic background. Conclusively，molecular marker-assisted selection（MAS）is an efficient method to improve the percentage of exerted stigma in CMS lines of Japonica hybrid rice.

CMS lines of Japonica hybrid rice；percentage of exerted stigma；molecular marker-assisted selection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.009

2015-10-06

浙江省重大項目（2010C1202），嘉興市重點項目（2012AZ1004），嘉興市中科專項（SQ2012010412）

蔡之軍，男，碩士，農(nóng)藝師，研究方向：雜交粳稻育種；E-mail：czj982002@126.com

李金軍，男，研究員，研究方向：常規(guī)、雜交粳稻新品種選育；E-mail：lijinjunjx@163.com