抗菌肽高效表達(dá)及生產(chǎn)優(yōu)化研究進(jìn)展

楊平袁奕豪楊曉莉鐘玥廖于鑫高榮

（1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610064；2. 四川大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610064）

抗菌肽高效表達(dá)及生產(chǎn)優(yōu)化研究進(jìn)展

楊平1袁奕豪2楊曉莉1鐘玥1廖于鑫2高榮1

（1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610064；2. 四川大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610064）

抗菌肽是基因編碼、經(jīng)外界誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類多肽。在抗生素引發(fā)“耐藥性”難題的時代，抗菌肽以廣譜殺菌、不易產(chǎn)生耐藥性、抗腫瘤、抗病毒等特點而擁有超越抗生素、造福人類的巨大潛能。然而，天然抗菌肽還需進(jìn)行增強抗菌性和穩(wěn)定性、降低細(xì)胞毒性等改造，并通過工業(yè)化改良實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。因此現(xiàn)從抗菌肽改造設(shè)計、生產(chǎn)應(yīng)用等最新研究做較為詳細(xì)的綜述。

抗菌肽；分子設(shè)計；表達(dá)策略；生產(chǎn)優(yōu)化

抗菌肽因其擁有的廣譜抗菌、不易產(chǎn)生耐藥性、調(diào)節(jié)先天免疫等諸多優(yōu)點而備受關(guān)注。目前市場上已有抗菌肽產(chǎn)品，并且市場效果良好。但是天然的抗菌肽仍然存在許多不足，如天然含量少、生產(chǎn)成本高、毒副作用大和工藝條件復(fù)雜等。因此其作為具潛力的生物制品之一，自發(fā)現(xiàn)以來被不斷改造以改善抑菌活性、表達(dá)產(chǎn)量及溶血性等特性［1-4］?？咕牡膬?yōu)化改進(jìn)一直是研發(fā)階段的主要任務(wù)，也是決定整個生產(chǎn)的重要因素。而迄今為止，研究者對抗菌肽生產(chǎn)及應(yīng)用過程中的改進(jìn)也做了相應(yīng)探討。

1 研發(fā)設(shè)計

研發(fā)階段可從根本上解決抗菌肽產(chǎn)量不高、溶血性和抗原性等問題，提高廣譜抑菌性和表達(dá)產(chǎn)量。通過不斷研發(fā)，人們在抗菌肽分子的設(shè)計、表達(dá)載體和表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化與選擇、計算機模擬預(yù)測等方面取得了一些可喜成果?，F(xiàn)逐一闡述如下。

1.1 抗菌肽分子設(shè)計

1.1.1 氨基酸組成與序列改變 抗菌肽的抑菌、抗癌及增強天然免疫等優(yōu)點主要因為它的螺旋結(jié)構(gòu)、兩親性、陽離子等特點。目前許多分子設(shè)計都是針對其氨基酸組成與序列進(jìn)行改造。這類改造主要有兩種，一是不改變氨基酸的種類而改變其順序；二是對氨基酸的種類進(jìn)行增減從而賦予其新性能。突變可導(dǎo)致氨基酸殘基的移碼、替換、插入或者刪減等，是抗菌肽結(jié)構(gòu)功能研究中的常用方法?？咕慕?jīng)過改造修飾后能有顯著優(yōu)勢變化，如抗菌活性提高、溶血性降低、抗癌能力增強、高表達(dá)量等。明飛平等［5］通過PCR敲除抗菌肽PR39的5'UTR多余核苷酸得到重組質(zhì)粒，再構(gòu)建已刪除8個核苷酸的新型表達(dá)載體pPIC9K-PR39-D-E，產(chǎn)生的抗菌肽具有高表達(dá)量和抑菌活性。劉忠淵等［6］將cecropin-XJ的C末端賴氨酸突變成天冬酰胺，抑菌試驗檢測發(fā)現(xiàn)后者抑菌活性高很多。它們的電荷數(shù)相同、螺旋度與疏水性相似，在此情況下二者的抑菌活力不同，推測應(yīng)該是由于天冬酰胺導(dǎo)致的結(jié)果。

1.1.2 去除多余結(jié)構(gòu)并保留修飾活性部分 天然抗菌肽中不都是保證其活性的必需成分，而較大的肽鏈和蛋白質(zhì)分子會對抗菌肽的穩(wěn)定性、免疫原性等產(chǎn)生影響。因此，去除其多余結(jié)構(gòu)、保持活性部分是重要改良措施之一。van Dijk等［7］將cathelicidin-2截短后，溶血性和毒性均得到明顯改善。Jittikoon等［8］對Cc-CATH3的氨基酸殘基進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其N端的前4個氨基酸殘基對執(zhí)行抗菌肽的功能沒有任何影響，而第5-8個殘基則對抗菌肽活性起到至關(guān)重要的作用。

1.1.3 抗菌肽形態(tài)設(shè)計 不同形狀抗菌肽的抑菌效果、穩(wěn)定性等不同。于嵐嵐等［9］合成線性、環(huán)狀、短鏈多肽發(fā)現(xiàn)，其與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合能力及殺菌活性順序均為長鏈肽＞環(huán)狀肽＞短鏈肽。穩(wěn)定性是環(huán)狀肽＞長鏈肽＞短鏈肽。而穩(wěn)定性往往決定其大規(guī)模生產(chǎn)的可能性，因此環(huán)狀肽對提高抗菌肽產(chǎn)品穩(wěn)定性具有重要作用。超短肽也具有其特性，大部分抗菌肽可與細(xì)胞膜相互作用，而超短肽易將疏水性和正電性共同體現(xiàn)出來，所以抗菌抗病毒能力很強。另外，超短肽分子量較小，所以較易表達(dá)。Ahn等［10］用修飾后的組氨酸合成的超短擬肽具有較高抗菌活性，且對蛋白酶及鹽均有較高穩(wěn)定性。

1.1.4 抗菌肽的協(xié)同作用 抗菌肽具有殺菌抗病毒的強大功能，而這不僅和其自身的性能機制有關(guān)，也受其他物質(zhì)的影響、調(diào)控，這些因素包括多種抗菌肽基因共表達(dá)、抗菌肽與抗生素共作用、抗菌肽基因與其他基因相互作用等。天蠶素抗菌肽B在大腸桿菌中的表達(dá)是高度有害的，但是Yu等［11］將一種天蠶素抗菌肽B突變體和綠色熒光蛋白融合在大腸桿菌中表達(dá)并制備其抗血清，最后得到的融合肽特異性抗血清效價大于1∶25 600。Wang等［12］通過實驗探究發(fā)現(xiàn)抗菌肽PMAP-36和PRW4與抗生素gentamicin之間對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均存在協(xié)同作用，這對臨床藥物的開發(fā)都有著重要意義。

1.2 表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化與選擇

常用的表達(dá)系統(tǒng)分為3類：原核表達(dá)系統(tǒng)、真核表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。這3種表達(dá)系統(tǒng)各有特點，因此在表達(dá)不同抗菌肽時可根據(jù)抗菌肽性質(zhì)與特點選擇適當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)并對其改造修飾。

1.2.1 原核表達(dá)系統(tǒng) 此類常用的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，其具有培養(yǎng)簡單、繁殖迅速等特點，易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。許多真核基因如胰島素基因都可在大腸桿菌中實現(xiàn)高效表達(dá)，但其仍有不具備真核生物蛋白加工系統(tǒng)、表達(dá)量有限等缺陷。對此，不少針對包涵體、雜合肽等內(nèi)容的研究工作正在展開以使大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)不斷優(yōu)化。Wu等［13］研究的雜合蜂毒肽（1-13）-LL37（17-30）（M-L）是將蜂毒肽疏水性N末端（M）與抗菌肽LL37的核心片段（L）相連接，導(dǎo)入E.coli BL21中，在IPTG誘導(dǎo)下獲得約165 mg高表達(dá)量的融合蛋白。隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展，尤其這一發(fā)現(xiàn)——金黃色葡萄球菌帶有抗性標(biāo)志的質(zhì)?？勺鳛榭莶菅挎邨U菌載體，為克服枯草芽孢桿菌只有隱秘性質(zhì)粒的困難奠定了重要基礎(chǔ)，使得枯草芽孢桿菌基因工程的研究迅速發(fā)展。迄今為止，枯草芽孢桿菌已成為最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)之一，大量的原核和真核基因在枯草芽孢桿菌及其近緣種中得到克隆和表達(dá)，有的已應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，取得了不少成果［14-17］。Zobel等［14］在枯草芽孢桿菌中第一個表達(dá)編碼小分子環(huán)狀肽形成的真核生物的非核糖體肽合成酶基因，從而證明了枯草芽孢桿菌是適合異源表達(dá)真核非核糖體合成蛋白的重要表達(dá)系統(tǒng)。

1.2.2 真核表達(dá)系統(tǒng) 此類常用酵母表達(dá)系統(tǒng)，動植物細(xì)胞較其而言，培養(yǎng)條件復(fù)雜、生長較慢，并不宜大規(guī)模生產(chǎn)。目前動植物在抗菌肽的生產(chǎn)表達(dá)上主要有微藻表達(dá)系統(tǒng)和其他轉(zhuǎn)基因動植物。微藻表達(dá)系統(tǒng)具有低成本、少污染、可再生、大生物量等特性，因此其是繼大腸桿菌和酵母菌表達(dá)系統(tǒng)之后較有前景的表達(dá)平臺。Chen等［18］將兔防御素NP-l基因轉(zhuǎn)入小球藻，并且建立了高效的單細(xì)胞真核藻類表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。他們通過體外離體抑菌試驗證明，NP-1基因已穩(wěn)定整合到小球藻基因組中，并進(jìn)行了正確轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。此外，Niu等［19］用Phaeodactylum tricornutum的硝酸還原酶的啟動子和終止子來優(yōu)化Chlorella vulgaris，并以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenic awtyltransferase，CAT）作為報告基因構(gòu)建好載體后，用電穿孔方法轉(zhuǎn)入小球藻中，最后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小球藻不僅能夠在選擇性培養(yǎng)基上生長，而且具有很高的CAT表達(dá)量。目前的實驗來看，通過抗菌肽轉(zhuǎn)基因改造的動植物能抗蟲抗菌且穩(wěn)定性強。Zeitler等［20］設(shè)計了幾種抗菌肽將其插入病毒載體中，再將重組子導(dǎo)入煙草內(nèi)，結(jié)果得到0.025 mg（肽）/ g（受感染葉生物量），且轉(zhuǎn)基因煙草具有較好的生物活性。Li等［21］將CFG、抗菌肽Cecropin基因5'和3'端的片段等融合在同一載體上并將其轉(zhuǎn)入蠶體內(nèi)，得到了具有抗菌效果的轉(zhuǎn)基因蠶繭。由此可見，轉(zhuǎn)抗菌肽基因動植物不僅對抗菌肽和轉(zhuǎn)基因的基礎(chǔ)研究有著重要意義，而且也將使煙草、絲綢等行業(yè)具有巨大的商業(yè)潛力。

酵母表達(dá)系統(tǒng)有很多優(yōu)勢，如表達(dá)調(diào)控機理較清楚、可修飾真核生物蛋白質(zhì)、易大規(guī)模發(fā)酵等。常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)有釀酒酵母和畢赤酵母。釀酒酵母的生理過程會導(dǎo)致自身生長受限，從而降低了目的蛋白的產(chǎn)量，所以其在大規(guī)模生產(chǎn)中使用較少。目前最常用的是以甲醇為唯一碳源的畢赤酵母。其具有好氧生長和表達(dá)量高等特點，所以培養(yǎng)成本相對較低，可以支持高密度細(xì)胞培養(yǎng)。金小寶等［22］將分泌型重組表達(dá)質(zhì)粒pPIc9K/Defen8in線性化后轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母GSll5中，并用0.5%的甲醇在28℃條件下誘導(dǎo)。結(jié)果顯示抗茵肽Defensin在畢赤酵母中得到了成功表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物對大腸桿菌E. coli K12D31的生長有抑制作用。隨著發(fā)酵方法的建立，畢赤酵母以其獨特優(yōu)勢和潛力被廣泛應(yīng)用，但仍有不足的地方，如甲醇的去除和過糖基化等。如今科研工作者仍在不斷研究，以使畢赤酵母更適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

1.2.3 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)適用范圍廣且表達(dá)效率高。常用的Bac-To-Bac系統(tǒng)具有周期較短、易純化、能大量重組等優(yōu)點。Li等［23］將EG I基因轉(zhuǎn)入到 Bac-to-Bac/BmNPV突變表達(dá)體系中發(fā)現(xiàn)，所得的蛋白活性和家蠶細(xì)胞中表達(dá)的蛋白相比提高了22.71%，與被未突變的Bac-to-Bac病毒侵染后的家蠶細(xì)胞中的蛋白相比提高了24.71%。與真原核表達(dá)系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作相對簡便，昆蟲細(xì)胞較易培養(yǎng)且成本低，外源基因表達(dá)量高，具有蛋白翻譯后修飾功能。然而桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)也具有一定缺陷。例如，雖然其糖基化位點與哺乳動物細(xì)胞一樣，但寡糖鏈性質(zhì)有所不同，無法產(chǎn)生復(fù)雜糖基側(cè)鏈。因此在使用桿狀病毒載體表達(dá)某些抗原時，無法保持其天然狀態(tài)。另外用該系統(tǒng)表達(dá)的抗菌肽種類較少，這也可能與桿狀病毒宿主范圍狹窄有關(guān)。

1.3 表達(dá)載體的優(yōu)化與選擇

抗菌肽常用的表達(dá)載體有大腸桿菌表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體以及兩者都適合的穿梭表達(dá)載體等，優(yōu)勢各異。其主要的改造研究如下。

1.3.1 宿主菌偏好型密碼子 有時人們使用的載體不一定完全適合表達(dá)系統(tǒng)。如人的載體在大腸桿菌中表達(dá)，就可能因宿主細(xì)胞對密碼子偏好性不同而導(dǎo)致蛋白表達(dá)產(chǎn)量不佳。若構(gòu)建表達(dá)載體時使用宿主菌偏好型密碼子，便可使載體有效表達(dá)出抗菌肽。Ren等［24］根據(jù)已知的抗菌肽基因SMAP-29的氨基酸序列，參照畢赤酵母密碼子偏好性，設(shè)計并合成SMAP-29的成熟基因片段，且在誘導(dǎo)表達(dá)的第2天檢測到了預(yù)期的SMAP-29，并對金黃色葡萄球菌和白色念球菌都有明顯的抑菌效果。

1.3.2 不需要酶切的表達(dá)載體 以往在構(gòu)建融合肽或雜合肽時需對產(chǎn)物進(jìn)行酶切，使抗菌肽得到純化富集，但這些過程會對抗菌肽結(jié)構(gòu)性質(zhì)產(chǎn)生不良影響，使產(chǎn)物產(chǎn)量和質(zhì)量受到損害。近年來，出現(xiàn)了一些不需酶切就可使抗菌肽表達(dá)后自身進(jìn)行剪切或者剪接的載體。利用intein融合表達(dá)抗菌肽只需親和層析及在柱切割，操作簡便，成本低廉。謝永剛［25］構(gòu)建OG2-intein2-CBD融合蛋白重組子，并且通過條件優(yōu)化如降低誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑IPTG濃度，有效提高蛋白的可溶表達(dá)。2A自剪輯技術(shù)的應(yīng)用可將多個抗菌肽融合表達(dá)，然后經(jīng)過自身剪輯使其各自行使功能，有利于抗菌肽協(xié)同表達(dá)和作用［26-28］。

1.3.3 5'非翻譯區(qū)序列改建 5'UTR對蛋白表達(dá)的影響主要表現(xiàn)在mRNA翻譯水平上。如在巴氏德畢赤酵母中表達(dá)時，mRNA 5'非翻譯區(qū)序列應(yīng)與畢赤酵母AOXImRNA 5'非翻譯區(qū)序列一致。Staley等［29］研究發(fā)現(xiàn)AOX 1的5' UTR中存在著復(fù)雜的正面和負(fù)面的順式作用元件，其活性作用不僅僅與其長度有關(guān)，更與其改變的位置有關(guān)。明飛平等［5］在實驗中將抗菌肽重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR敲除5'端多余核苷酸序列后再經(jīng)PCR、酶切構(gòu)建5' UTR已刪除8個核苷酸的新型畢赤酵母表達(dá)載體，使兩者mRNA 5'非翻譯區(qū)序列相同，從而提高了抗菌肽PR39在畢赤酵母中的表達(dá)及其抑菌活性。

1.4 計算機模擬預(yù)測

隨著計算機技術(shù)飛速發(fā)展，很多軟件和計算機方法運用于科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐。越來越多的生物工作者采用計算機方法減輕工作量。

目前，其在兩大方面對抗菌肽的工作有指導(dǎo)作用：一是其豐富而信息量宏大的數(shù)據(jù)庫；二是各種軟件技術(shù)的使用。一些常用的數(shù)據(jù)庫，如表1所示。

表1 各類抗菌肽主要數(shù)據(jù)庫

其能提供氨基酸組成、空間結(jié)構(gòu)等信息，對科研工作有很大的指導(dǎo)作用。各種軟件技術(shù)（如ProtParam、NNPREDICT等）的發(fā)展，利于人們對抗菌肽合成、結(jié)構(gòu)等進(jìn)行較合理的預(yù)測。Lata等［30］新研發(fā)了AntiBP2，旨在為快速增長的抗菌肽研究領(lǐng)域提供一個有效、快速而方便的分類和設(shè)計預(yù)測方法。Avram等［31］用計算機軟件計算黃蜂毒素衍生物的疏水性、氫鍵等參數(shù)，建立了3D-QSAR模型并合成新的衍生物，部分衍生物比母體具有更好的抗菌活性。于嵐嵐等［9］在實驗中將新型抗茵肽的設(shè)計、活性研究及與磷脂相互作用與計算模擬相結(jié)合，得到有較強抑菌活性的抗菌肽?？咕牡倪x擇性和抗菌活性受到多種因素影響，可用計算機輔助手段分析，對抗菌肽進(jìn)行修飾改造，得到大量結(jié)構(gòu)全新的抗菌肽，并得出合理的使用方法和趨勢，設(shè)計出有高選擇性、高抗菌活性、低溶血性的抗菌肽，為化學(xué)和基因工程方法合成抗菌肽提供參考。

2 生產(chǎn)應(yīng)用

抗菌肽經(jīng)過幾十年的研究發(fā)展，已有很多成品出現(xiàn)在市場上，給生產(chǎn)生活帶來新的變化與發(fā)展。而將抗菌肽從上游研發(fā)階段帶入市場的關(guān)鍵就是發(fā)酵生產(chǎn)和分離純化及檢測過程。Li等［16］從物理參數(shù)和金屬無機鹽兩方面探索了提高枯草芽孢桿菌BS501a拮抗代謝反應(yīng)發(fā)酵的優(yōu)化條件。他們通過單因素輪換和正交實驗得到了發(fā)酵最佳物理參數(shù)應(yīng)是初始pH為7.0，培養(yǎng)溫度30℃和發(fā)酵時間48 h，并探索出在金屬無機鹽中硫酸鎂、硫酸錳（尤其是硫酸鎂）對發(fā)酵起著重要的影響。由此可見，一個完整的發(fā)酵過程受到很多方面的影響，而要在諸多因素中選出合適的條件，通常難以通過完整的發(fā)酵過程進(jìn)行探索或驗證。因此，必須借助計算機軟件和數(shù)學(xué)模型對重要參數(shù)進(jìn)行預(yù)測，比較優(yōu)化選擇。其一般步驟，見圖1。

圖1 發(fā)酵過程優(yōu)化選擇步驟

發(fā)酵方式主有固體發(fā)酵和液體發(fā)酵。液體發(fā)酵的主要特點是能夠?qū)崿F(xiàn)高密度發(fā)酵、機械化程度高。固體發(fā)酵主要是在低濕含量的固態(tài)培養(yǎng)基上（aw一般為0.4-0.90），在不腐爛和自然狀態(tài)下進(jìn)行的發(fā)酵過程。其主要有設(shè)備簡單、操作簡便、原料來源廣等特點。選用不同的發(fā)酵方式對最終的發(fā)酵結(jié)果有很大影響。Zhu等［32］通過傅里葉變換紅外光譜、光學(xué)成像技術(shù)、高效液相色譜等技術(shù)分析了Bacillus amyloliquefaciens XZ-173在固態(tài)發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種方式下發(fā)酵的脂肽組成、性質(zhì)以及這兩種條件下的轉(zhuǎn)錄水平差異。他們最終發(fā)現(xiàn)在這兩種發(fā)酵方式下，脂肽的極性和結(jié)構(gòu)沒有太多差異，但是液態(tài)發(fā)酵有較高的氨基酸比例以及較好的乳化和拮抗活性。在固體發(fā)酵條件下，脂肽的合成基因srfAA和sfp有較高積累，并且ituD和lpa-14的轉(zhuǎn)錄水平在很長一段時間內(nèi)不斷升高。由此可見，固體發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵各自有其獨特的優(yōu)勢，需要根據(jù)實際生產(chǎn)的需求不斷探索，選擇合適的發(fā)酵方式。

除了借助計算機軟件和發(fā)酵方式外，菌的培養(yǎng)發(fā)酵設(shè)備也是值得改進(jìn)的重要內(nèi)容。陶德錄等［33］報告了一套在上海實施了生產(chǎn)量達(dá)2 000 t/年抗菌肽的新技術(shù)、新工藝和新設(shè)備，為抗菌肽的規(guī)模化生產(chǎn)探索了一條新途徑。李建華等［34］設(shè)計了一種新型的帶有上下翻蓋的托盤平動固態(tài)發(fā)酵機，他利用Matlab對發(fā)酵罐內(nèi)托盤的3種排列方式下的各種情況進(jìn)行了基于托盤運動不干涉的各機構(gòu)參數(shù)的初步求解和精確求解，對噴霧接種時生物顆粒流體系統(tǒng)的兩相流進(jìn)行了分析，并采用 CFD 計算流體動力學(xué)軟件仿真和實驗驗證的方法對噴頭類型、噴霧參數(shù)等因素對噴霧接種效果的影響進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。最后實驗和仿真結(jié)果表明，用噴霧接種實現(xiàn)純種固態(tài)發(fā)酵過程的自動化、保證接種的均勻性是可行的，渦流扇形霧噴頭 TT1102 在噴霧壓力為 0.3 MPa 時的能量耗散率最低、菌種死亡率最小。這種設(shè)備通過發(fā)酵過程的自動控制，創(chuàng)造良好的生產(chǎn)條件，保證真正意義的純種固態(tài)培養(yǎng)，可以得到生長好且質(zhì)量均勻的產(chǎn)品，同時又便于工業(yè)規(guī)模的放大。

中游發(fā)酵完成之后，下游的分離純化、包裝檢測等目前都是一些較為常規(guī)的技術(shù)，比如產(chǎn)品濃縮時，工業(yè)生產(chǎn)上多采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、噴霧干燥、冷凍濃縮等方法將產(chǎn)品制成結(jié)晶、干粉等形式，便于產(chǎn)品保存和后期檢驗及再加工等操作。鑒定是否為目的抗菌肽常用方法有質(zhì)譜分析、電泳、PCR等，對產(chǎn)品抑菌性質(zhì)進(jìn)行檢測常用的方法是瓊脂孔穴擴散法。當(dāng)然，在產(chǎn)品形式設(shè)計與包裝中也應(yīng)該體現(xiàn)出科學(xué)性?，F(xiàn)在生產(chǎn)生活中已有多種形式的抗菌肽制劑，如粉制劑、噴霧制劑、凝膠制劑等。這些形式都是根據(jù)公司產(chǎn)品特點和市場適應(yīng)性設(shè)計包裝的。而抗菌肽在應(yīng)用時也應(yīng)該探索合適的條件，注意一些影響因素。如Terova等［35］在研究中指出內(nèi)源性抗菌多肽能直接快速殺滅病原體，但其mRNA的表達(dá)量受到急性脅迫壓力的調(diào)控影響。這一發(fā)現(xiàn)將對魚類的健康和成功養(yǎng)殖有著重大意義。Wang 等［36］通過實驗發(fā)現(xiàn)帶鋅甲硫氨酸和抗菌肽具有協(xié)同作用，能夠更好提高斷齡豬仔的免疫力、提高生長性能。Nithya等［37］發(fā)現(xiàn)用來自Bacillus licheniformis Me1的部分純化抗菌肽與LDPE和纖維素材料制成活性薄膜，其在食物的抗菌保鮮方面可有重要作用。

3 展望

在這個亟需倡導(dǎo)綠色環(huán)保的時代，抗生素的使用已經(jīng)無法滿足人們對更高質(zhì)量生產(chǎn)生活的追求?？咕膽?yīng)時而生，自被人類發(fā)現(xiàn)以來展現(xiàn)出來其獨特的眾多優(yōu)勢和潛力，作為抗生素的替代者而備受期待。在這30多年的發(fā)展中，抗菌肽的研發(fā)和生產(chǎn)取得了很大進(jìn)步，已經(jīng)能夠通過工業(yè)生產(chǎn)出良好的商品進(jìn)入人們生產(chǎn)生活的方方面面，如美容行業(yè)、飼料行業(yè)、醫(yī)藥業(yè)及食品添加劑等等。其中抗菌肽又在飼料行業(yè)應(yīng)用頗多，只是其作為飼料在實際應(yīng)用中也面臨著許多的問題，如如何不影響動物的食欲、提高其免疫力、增強肉質(zhì)等。而且如何大規(guī)模地生產(chǎn)優(yōu)化的抗菌肽使其滿足人們的生產(chǎn)生活也是一大難題。但隨著科技的不斷發(fā)展、經(jīng)驗的不斷增加，人們對抗菌肽的分子改造和生產(chǎn)研發(fā)將有著越來越多的認(rèn)識和改進(jìn)，抗菌肽的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)也會日益成熟，而這將是“后抗生素時代”的一條全新出路。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress of Efficient Expression and Optimization of Production of Antibacterial Peptide

YANG Ping1YUAN Yi-hao2YANG Xiao-li1ZHONG Yue2LIAO Yu-xin2GAO Rong1
（1. College of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610064；2. College of Polymer Science and Engineering，Sichuan University，Chengdu 610064）

Antimicrobial peptides（AMPs），a class of polypeptides induced by external conditions，are encoded by specific genes. In the era of facing the issue of “drug resistance” caused by antibiotics，AMPs own huge potential of benefits to mankind and replacing the antibiotics due to their characteristics of broad-spectrum antibacterial activity，scarce generation of drug-resistance，and antitumor virus，etc. However，the antibacterial activity and instability of natural AMPs should be enhanced，their toxicity should be reduced，and the large-scale production may be achieved by improving the industrial process. Therefore，the recent researches on the molecular modification and design，production and application of AMPS are summarized in detailed here.

antimicrobial peptides；molecular design；expression strategies；production optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.005

2015-06-11

國家自然科學(xué)基金項目（30871855），科技部國際科技合作項目（2011DFA10101103），四川大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金資助（208240-4184011，2020404131001）

楊平，女，研究方向：分子免疫、生物技術(shù)；E-mail：523008626@qq.com

高榮，教授，研究方向：分子遺傳和基因工程、分子免疫學(xué)、生物技術(shù)、微生物學(xué)和動物傳染病等；E-mail：gaorong96@163.com