蘆筍三種花蕾性別分化相關(guān)差異蛋白表達(dá)分析

劉 孟，乜蘭春，王珊珊，胡淑明

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蘆筍三種花蕾性別分化相關(guān)差異蛋白表達(dá)分析

劉 孟，乜蘭春，王珊珊，胡淑明

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定 071001）

【目的】探究與蘆筍性別分化相關(guān)的蛋白，為揭示性別分化的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳蕴J筍雌株、雄株、雄性兩性株兩性分化期的花蕾為材料，采用雙向電泳、質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)相結(jié)合的方法，對其進(jìn)行蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析?！窘Y(jié)果】通過雙向電泳3次重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雌、雄花蕾相比，雄花蕾特異蛋白點(diǎn)25個，上調(diào)蛋白點(diǎn)5個；雌花蕾特異蛋白點(diǎn)13個，上調(diào)蛋白點(diǎn)12個；雄性兩性花蕾與雄花蕾相比，特異蛋白點(diǎn)19個，上調(diào)蛋白點(diǎn)8個。經(jīng)過質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)分析，鑒定出雄花蕾特異或上調(diào)表達(dá)同源蛋白6個，包括1個促進(jìn)α淀粉酶合成的luminal binding protein（BiP）；3個參與糖代謝的蛋白，分別為β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶；1個與質(zhì)體相關(guān)的脂連接蛋白PAP fibrillin和1個未知功能的Os02g0634900蛋白；雄性兩性花蕾和雌花蕾特異或上調(diào)表達(dá)同源蛋白16個，包括2個參與糖酵解過程的蛋白，即烯醇化酶1和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶；2個維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白，即肌動蛋白亞型B和肌動蛋白；2個參與能量代謝的蛋白，即ATP合成酶CF1α亞基和ATP合成酶β亞基；2個參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)牡鞍祝葱TP結(jié)合蛋白和GTP結(jié)合蛋白，1個抑制蛋白質(zhì)合成的核糖體失活蛋白，1個參與物質(zhì)運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白，即ADP核糖激化因子相似蛋白，1個催化磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移的蛋白，即核苷二磷酸激酶，1個脂質(zhì)相關(guān)蛋白，1個與光合作用（光系統(tǒng)Ⅱ）有關(guān)的蛋白，即放氧增強(qiáng)蛋白1，1個允許離子、糖和氨基酸被動轉(zhuǎn)運(yùn)穿過外膜的蛋白，即細(xì)胞外膜孔道蛋白，2個未知功能的蛋白，即細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4和假想蛋白?！窘Y(jié)論】β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶、luminal binding protein (BiP)、PAP fibrillin和Os02g0634900在蘆筍上的同源蛋白與蘆筍雄性器官發(fā)育相關(guān)；烯醇化酶1、胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶、肌動蛋白亞型B、肌動蛋白、ATP合成酶CF1α亞基、小GTP結(jié)合蛋白、GTP結(jié)合蛋白、核糖體失活蛋白、ADP核糖激化因子相似蛋白、核苷二磷酸激酶、脂質(zhì)相關(guān)蛋白、放氧增強(qiáng)蛋白1、細(xì)胞外膜孔道蛋白和假想蛋白在蘆筍上的同源蛋白，ATP合成酶β亞基、細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4與蘆筍雌性器官發(fā)育相關(guān)。放氧增強(qiáng)蛋白1和細(xì)胞外膜孔道蛋白在蘆筍上的同源蛋白可能為雌性器官發(fā)育的關(guān)鍵蛋白。

蘆筍；雌花蕾；雄花蕾；雄性兩性花蕾；性別分化；差異蛋白

0 引言

【研究意義】蘆筍（L.），又名石刁柏，是百合科天門冬屬宿根性多年生草本植物，具有較高的營養(yǎng)和保健價值[1-3]。蘆筍雌雄異株，其性別分化先經(jīng)歷“兩性”時期，之后在特定階段，性器官選擇性發(fā)育。但也有極少數(shù)雄株花的雌性器官發(fā)育完全，為雄性兩性株[4-6]。蘆筍性別由1對等位基因決定，Mm為雄株（包括雄性兩性株），mm為雌株[7-9]，其中雄株產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)壽命長[10-11]。雄性兩性株（Mm）及其自交后代超雄株（MM）是蘆筍遺傳研究及全雄育種的重要種質(zhì)材料。但自然條件下，雄性兩性株出現(xiàn)的比例極低，加之田間篩選困難，蘆筍種質(zhì)創(chuàng)新和全雄品種選育受到很大限制[6,10,12]。明確蘆筍性別分化機(jī)理，將為蘆筍性別調(diào)控和種質(zhì)創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)，也可進(jìn)一步豐富雌雄異株植物性別分化的相關(guān)理論?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蘆筍性別分化是由性別決定基因主導(dǎo)的，同時許多特異表達(dá)基因參與調(diào)控[13-17]。國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)分離并且得到與蘆筍花器官發(fā)育相關(guān)的10多個特異基因，但又證實(shí)這些基因與蘆筍性別決定與分化無直接關(guān)系，由于蘆筍性別決定基因區(qū)域有大量重復(fù)序列，阻礙了單拷貝M位點(diǎn)的定位，蘆筍性別決定與分化的分子機(jī)理尚未完全揭示[13]。蘆筍性別分化的基因調(diào)控是復(fù)雜的，采用轉(zhuǎn)錄子組和蛋白質(zhì)組技術(shù)是識別這些基因的有效方法。基因表達(dá)的直接產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)通過其自身特異的活動控制和調(diào)節(jié)生命活動[18]。在性別分化過程中，蛋白質(zhì)的差異在一定程度上可以反映基因?qū)τ诨òl(fā)育的調(diào)控[19]，對蛋白質(zhì)組學(xué)及差異蛋白質(zhì)研究可從植物本身的代謝活動方面更清晰地揭示植物性別分化的機(jī)理?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，在文冠果[19]、苦瓜[20]、黃瓜[21]、果梅[22]等植物上已研究發(fā)現(xiàn)了與其性別分化相關(guān)的特異蛋白，但大部分停留在檢測其分子量方面，有關(guān)蘆筍性別分化相關(guān)蛋白的研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)利用雙向電泳和質(zhì)譜鑒定技術(shù)對蘆筍雌株、雄株和雄性兩性株進(jìn)入兩性分化期的花蕾可溶性蛋白進(jìn)行分離和鑒定，結(jié)合生物信息學(xué)分析，確定其功能，以期找出與蘆筍性別分化有關(guān)的蛋白，為揭示性別分化的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

蛋白質(zhì)樣品制備、雙向電泳及圖譜分析和質(zhì)譜鑒定于2015年6—8月在北京華大蛋白技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 供試材料

材料為3年生蘆筍品種‘冠軍’，采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)林試驗(yàn)基地。2015年春季萌芽后，嫩莖側(cè)枝展開，根據(jù)形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)觀察[23]，分別取雌株、雄株、雄性兩性株上進(jìn)入兩性分化期的花蕾液氮速凍，-80℃冰箱保存。

1.2 差異蛋白分析

1.2.1 蛋白質(zhì)樣品制備 分別取適量花蕾加入10% PVPP和液氮進(jìn)行研磨，將磨細(xì)后的粉末放入離心管中，加入10% TCA的預(yù)冷丙酮，-20℃沉淀2 h，在4℃下20 000×離心30 min，棄上清；再加入預(yù)冷的純丙酮，清洗沉淀，振蕩后于-20℃沉淀30 min，重復(fù)清洗3次，除去丙酮后，加入終濃度為1 mmol·L-1PMSF，2 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1DTT的L3裂解液500 μL，冰浴超聲5 min，最后在15℃，20 000×條件下離心30 min，收集上清保存于-80℃冰箱備用。使用2-D Quant-kit法對蛋白進(jìn)行定量。

1.2.2 雙向電泳及圖譜分析 采用18 cm、pH為4—7的線性IPG膠條，上樣量500 μg。等電聚焦電壓設(shè)置為：水化12 h，然后依次經(jīng)過50 v 2 h、500 v 2 h、1 000 v 2 h，最終穩(wěn)定在8 000 v，最后總電壓時間積為110 000 vh。等電聚焦結(jié)束后將膠條移至平衡槽中，在膠條平衡緩沖液中平衡15 min，然后進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳。在50 mA/gel、20℃條件下電泳至溴酚藍(lán)指示劑跑出膠底。用純水沖去電泳液，倒入考染液，室溫染色1 h，然后倒入考染脫色液，室溫脫色至背景透明，使用UMAXPowerLook 2100xl掃描儀掃描雙向電泳凝膠并保存可用于膠圖分析的TIF圖，每個蛋白質(zhì)樣品重復(fù)3次。將掃描后膠圖導(dǎo)入IMAGEMASTER 5.0分析軟件中，分別分析每一張膠，將同一個樣品的3張膠圖擬合成一張?zhí)摂M膠圖進(jìn)行定量分析，得出3倍以上差異點(diǎn)和特異點(diǎn)列表。

1.2.3 差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢測 使用液相二級質(zhì)譜（LC-MS-MS）檢測，得到肽指紋圖譜、肽段長度、分子量等參數(shù)，基于這些參數(shù)進(jìn)行mascot搜索，得到與其匹配的蛋白。數(shù)據(jù)庫選擇NCBInr，種屬選擇Green Plants，氨基酸固定修飾方式選擇“Carbamidomethyl (C)”修飾，可變的修飾方式選擇“Gln->pyro-Glu (N-term Q)，Oxidation (M)”修飾，選取單同位素峰檢索，可接受的肽段分子量誤差設(shè)為15 ppm。

2 結(jié)果

2.1 蘆筍雌花蕾、雄花蕾與雄性兩性花蕾的雙向電泳圖譜分析

3種花蕾全蛋白雙向電泳后，得到電泳圖（圖1）。雌、雄花蕾相比，雄花蕾特異蛋白點(diǎn)25個，分子量主要在12—59 kD，pI主要在5.5—8.0，上調(diào)蛋白點(diǎn)5個（點(diǎn)43、48、58、155、233），分子量分別為16 kD、16 kD、17 kD、32 kD和43 kD，pI分別為6.0、5.8、5.8、8.4、7.5；雌花蕾特異蛋白點(diǎn)13個，分子量主要在21—39 kD，pI主要在4.9—6.9，上調(diào)蛋白點(diǎn)12個(點(diǎn)67、72、84、105、122、162、167、169、193、269、273、276)，分子量主要在15—56 kD，pI主要在5.4—6.3（表1）。雄性兩性花蕾與雄花蕾相比，雄性兩性花蕾特異蛋白點(diǎn)19個，分子量主要在11—33 kD，pI主要在5.0—6.4，上調(diào)蛋白點(diǎn)8個（點(diǎn)29、47、108、113、116、173、181、195），分子量主要在20—33 kD，pI主要在5.6—6.0（表2）。

用IMAGEMASTER 5.0軟件分析，得到3種花蕾的差異蛋白點(diǎn)電泳圖，如圖2。將上述雌、雄花蕾相比，雄花蕾特異且占全部蛋白量比例大于0.11%的15個蛋白點(diǎn)（點(diǎn)18、24、26、37、38、54、72、133、134、154、161、164、206、211、237）和上調(diào)量大于7.3倍的4個蛋白點(diǎn)（點(diǎn)43、48、58、233）；雌花蕾特異且占全部蛋白量比例大于0.20的8個蛋白點(diǎn)（點(diǎn)7、53、60、92、106、180、274、275）和上調(diào)量大于4.4倍的5個蛋白點(diǎn)（點(diǎn)84、167、169、273、276）；雄性兩性花蕾和雄花蕾相比，雄性兩性花蕾特異且占全部蛋白量比例大于0.30%的10個蛋白點(diǎn)（點(diǎn)59、63、64、69、71、72、79、82、175、195）和上調(diào)量大于4.3倍的4個蛋白點(diǎn)（點(diǎn)29、47、113、116）進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

2.2 差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析

對差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果見表3。從表3可以看出，雄花蕾15個特異蛋白點(diǎn)中，鑒定出1種蛋白即早期開花蛋白（點(diǎn)54、211）和8種蘆筍同源蛋白，分別為ATP合成酶CF1α亞基（點(diǎn)18）、ATP合成酶β亞基（點(diǎn)161、206）、β淀粉酶（點(diǎn)24、26、37、38、72）、核糖體失活蛋白（點(diǎn)164）、胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶（點(diǎn)237）、luminal binding protein (BiP)（點(diǎn)134）、PAP fibrillin（點(diǎn)154）和Os02g0634900（點(diǎn)133）。由于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在雙向電泳中很容易顯示出來，因此可能會造成在凝膠上不同蛋白點(diǎn)被鑒定為同一蛋白質(zhì)的現(xiàn)象，稱為重復(fù)點(diǎn)（multiple spots）。雄花蕾4個上調(diào)蛋白點(diǎn)中，共鑒定出3種蘆筍同源蛋白，分別為β淀粉酶（點(diǎn)43、58）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（點(diǎn)48）和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶（點(diǎn)233）。雌花蕾8個特異蛋白點(diǎn)中，共鑒定出3種蛋白，即細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4（點(diǎn)53）、早期開花蛋白1（點(diǎn)60）和ATP合成酶β亞基（點(diǎn)274）；5種蘆筍同源蛋白，分別為細(xì)胞外膜孔道蛋白（點(diǎn)7）、放氧增強(qiáng)蛋白1（點(diǎn)180）、ATP合成酶β亞基（275）、ADP核糖基化因子相似蛋白（點(diǎn)92）和登錄號為gi|61968970、序列覆蓋率為38.4%認(rèn)定為磷酸甘油酸激酶的蛋白（點(diǎn)106）。雌花蕾5個上調(diào)蛋白點(diǎn)中，共鑒定出1種蛋白，即ATP合成酶β亞基（點(diǎn)276）；4種蘆筍同源蛋白，分別為烯醇化酶1（點(diǎn)84）、核糖體失活蛋白（點(diǎn)167）、肌動蛋白亞型B（點(diǎn)169）和ATP合成酶CF1α亞基（點(diǎn)173）。其中ATP合成酶CF1α亞基、ATP合成酶β亞基、β淀粉酶、早期開花蛋白1、核糖體失活蛋白和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶在雌雄花蕾特異或上調(diào)同源蛋白中均存在。因此，雌、雄花蕾相比，luminal binding protein（BiP）、PAP fibrillin和Os02g0634900為蘆筍雄花蕾特異表達(dá)同源蛋白，β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶為雄花蕾上調(diào)表達(dá)同源蛋白。而細(xì)胞外膜孔道蛋白、細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4、放氧增強(qiáng)蛋白1和ADP核糖基化因子相似蛋白為蘆筍雌花蕾特異表達(dá)同源蛋白，烯醇化酶1、核糖體失活蛋白、肌動蛋白亞型B、ATP合成酶CF1α亞基和ATP合成酶β亞基為雌花蕾上調(diào)表達(dá)同源蛋白。

a、b、c為雌花蕾雙向電泳標(biāo)準(zhǔn)圖譜，d、e、f為雄花蕾雙向電泳標(biāo)準(zhǔn)圖譜，g、h、i為雄性兩性花蕾雙向電泳標(biāo)準(zhǔn)圖譜

表1 雌花蕾與雄花蕾差異表達(dá)蛋白點(diǎn)

表2 雄性兩性花蕾與雄花蕾差異表達(dá)蛋白點(diǎn)

從左到右依次為雌花蕾、雄花蕾和雄性兩性花蕾差異顯著表達(dá)蛋白點(diǎn)圖

表3 3種花蕾質(zhì)譜鑒定結(jié)果

雄性兩性花蕾10個特異蛋白點(diǎn)中，共鑒定出1種蛋白，即早期開花蛋白1（點(diǎn)71）；8種蘆筍同源蛋白，分別為核苷二磷酸激酶（點(diǎn)59）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（點(diǎn)63、64）、ATP合成酶α亞基（點(diǎn)69）、脂質(zhì)相關(guān)蛋白（點(diǎn)72）、β淀粉酶（點(diǎn)79）、假想蛋白（點(diǎn)82）、肌動蛋白（點(diǎn)175）和放氧增強(qiáng)蛋白1（點(diǎn)195）。4個上調(diào)蛋白點(diǎn)中共鑒定出4種蘆筍同源蛋白，分別為細(xì)胞外膜孔道蛋白（點(diǎn)29）、小GTP結(jié)合蛋白（點(diǎn)47）、GTP結(jié)合蛋白（點(diǎn)113）和磷酸甘油酸激酶（點(diǎn)116）。其中早期開花蛋白1、3-磷酸甘油醛脫氫酶、ATP合成酶α亞基和β淀粉酶在雄花蕾特異或上調(diào)同源蛋白中均存在。因此，與雄花蕾相比，核苷二磷酸激酶、脂質(zhì)相關(guān)蛋白、假想蛋白、肌動蛋白和放氧增強(qiáng)蛋白1為蘆筍雄性兩性花蕾特異表達(dá)同源蛋白；小GTP結(jié)合蛋白、GTP結(jié)合蛋白、細(xì)胞外膜孔道蛋白和磷酸甘油酸激酶為雄性兩性花蕾上調(diào)表達(dá)同源蛋白。其中放氧增強(qiáng)蛋白1和細(xì)胞外膜孔道蛋白同時出現(xiàn)在雌花蕾和雄性兩性花蕾的特異或上調(diào)表達(dá)同源蛋白中，可能為蘆筍雌性器官發(fā)育的關(guān)鍵蛋白。

3 討論

關(guān)于植物性別分化特異蛋白的研究已有很多報道，但大多停留在檢測條帶差異性與分子量上[24-28]。本研究利用雙向電泳、質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析相結(jié)合的技術(shù)方法，研究了蘆筍雌株、雄株和雄性兩性株進(jìn)入兩性分化期的花蕾的差異蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)蘆筍同源蛋白luminal binding protein（BiP）、PAP fibrillin和Os02g0634900在雄花蕾中特異表達(dá)，β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶在雄花蕾中上調(diào)表達(dá)，它們可能與蘆筍雄性器官選擇性發(fā)育相關(guān)。其中l(wèi)uminal binding protein是一種分子伴侶，其過表達(dá)有助于α淀粉酶合成[29]。PAP fibrillin是由核基因編碼，與質(zhì)體相關(guān)的脂連接蛋白[30]。Os02g0634900功能尚未見報道。β淀粉酶可將直鏈淀粉分解成麥芽糖，3-磷酸甘油醛脫氫酶和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶參與糖酵解中的放能階段。可見，蘆筍雄性器官選擇性發(fā)育需要大量可溶性糖和更多的能量物質(zhì)，所以β淀粉酶，3-磷酸甘油醛脫氫酶和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶表達(dá)量增加。王學(xué)德[31]研究表明，棉花花藥內(nèi)雄性細(xì)胞生長發(fā)育對碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)的需求可促進(jìn)淀粉酶基因的表達(dá)和活性的提高，本研究結(jié)果與其結(jié)論一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，與雄花蕾相比，在蘆筍雌花蕾和雄性兩性花蕾中特異表達(dá)或上調(diào)表達(dá)的同源蛋白有16個。其中蘆筍同源蛋白細(xì)胞外膜孔道蛋白、細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4、放氧增強(qiáng)蛋白1和ADP核糖基化因子相似蛋白在雌花蕾中特異表達(dá)；烯醇化酶1、核糖體失活蛋白、肌動蛋白亞型B、ATP合成酶CF1α亞基和ATP合成酶β亞基在雌花蕾中上調(diào)表達(dá)。核苷二磷酸激酶、脂質(zhì)相關(guān)蛋白、假想蛋白、肌動蛋白和放氧增強(qiáng)蛋白1在雄性兩性花蕾中特異表達(dá)、小GTP結(jié)合蛋白、GTP結(jié)合蛋白、細(xì)胞外膜孔道蛋白和磷酸甘油酸激酶在雄性兩性花蕾中上調(diào)表達(dá)。它們都有可能與蘆筍雌性器官的選擇性發(fā)育有關(guān)。放氧增強(qiáng)蛋白1和細(xì)胞外膜孔道蛋白同時出現(xiàn)在雌花蕾和雄性兩性花蕾的特異或上調(diào)表達(dá)同源蛋白中，可能為蘆筍雌性器官發(fā)育的關(guān)鍵蛋白。細(xì)胞外膜孔道蛋白參與離子，糖和氨基酸被動轉(zhuǎn)運(yùn)穿過外膜。放氧增強(qiáng)蛋白1是與光合作用（光系統(tǒng)Ⅱ）有關(guān)的蛋白。另外，蘆筍同源蛋白肌動蛋白亞型B在雌花蕾中的表達(dá)量為雄花蕾的4.5倍，肌動蛋白為雄兩性花蕾的特異蛋白，表明肌動蛋白可能在蘆筍雌性器官發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。肌動蛋白在形成細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞形態(tài)等方面具有重要作用。這與胡青[19]報道的文冠果子房膨大，胚珠發(fā)育成熟，需要細(xì)胞壁具有較強(qiáng)的延展性，以維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致。

烯醇化酶1和磷酸甘油酸激酶參與糖酵解過程。但Ucker等[32]報道，過量表達(dá)的烯醇化酶1也可能是細(xì)胞凋亡的早期表現(xiàn)。在凋亡細(xì)胞中，烯醇化酶1失去了糖酵解酶的活性，作為纖溶酶原受體參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的過程[33]。蘆筍雌花蕾中同源蛋白烯醇化酶1表達(dá)量增加，也可能與雌花蕾中的雄性生殖細(xì)胞的凋亡有關(guān)。ATP合成酶α亞基和ATP合成酶β亞基參與ATP的合成。核苷二磷酸激酶可以維持NDP和NTP代謝平衡，參與植物細(xì)胞的生長與分化，光敏色素A和氧化脅迫相應(yīng)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動[34]。GTP結(jié)合蛋白參與細(xì)胞通訊，核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，小泡運(yùn)輸，蛋白質(zhì)合成等；小GTP結(jié)合蛋白在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸過程中起重要作用；核糖體失活蛋白抑制蛋白質(zhì)的合成；脂質(zhì)相關(guān)蛋白參與脂質(zhì)合成。細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4，假想蛋白功能尚未見報道。它們與蘆筍雌性器官發(fā)育的關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究。

從本研究鑒定出的蛋白及其功能來看，涉及光合作用、糖酵解、能量代謝、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、物質(zhì)運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成等過程的多種蛋白。性別分化是一個復(fù)雜的過程，尚需對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，制作探針，用于性別分化基因的定位研究。

4 結(jié)論

蘆筍雄性器官發(fā)育涉及糖代謝、α淀粉酶合成、質(zhì)體相關(guān)和未知功能的蛋白等4類蘆筍同源蛋白，包括3種參與糖代謝的蛋白，分別為β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶；1種促進(jìn)α淀粉酶合成的蛋白，即luminal binding protein（BiP）；1種質(zhì)體相關(guān)蛋白即PAP fibrillin和1種未知功能的蛋白Os02g0634900。雌性器官發(fā)育涉及糖酵解過程、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能量代謝、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、蛋白質(zhì)合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、催化磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移、脂質(zhì)代謝、光合作用過程和未知功能的蛋白等10類蘆筍同源蛋白，包括2種參與糖酵解過程的蛋白，分別為烯醇化酶1和胞質(zhì)磷酸甘油酸激酶；2種維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白，分別為肌動蛋白亞型B和肌動蛋白；2種與能量代謝有關(guān)的蛋白，分別為ATP合成酶CF1α亞基和ATP合成酶β亞基；3種與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)的蛋白，分別為小GTP結(jié)合蛋白、GTP結(jié)合蛋白和細(xì)胞外膜孔道蛋白；1種與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的蛋白，即核糖體失活蛋白；1種與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的蛋白，即ADP核糖激化因子相似蛋白；1種催化磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移的蛋白，即核苷二磷酸激酶；1種參與脂質(zhì)代謝的蛋白，即脂質(zhì)相關(guān)蛋白；1種參與光合作用過程的蛋白，即放氧增強(qiáng)蛋白1；2種未知功能的蛋白，分別為細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白亞型4和假想蛋白。放氧增強(qiáng)蛋白1和細(xì)胞外膜孔道蛋白可能為蘆筍雌性器官發(fā)育的關(guān)鍵同源蛋白。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Expression Analysis of Differential Proteins in Three Kinds of Flower Buds with Sex Differentiation of Asparagus

LIU Meng, NIE Lan-chun, WANG Shan-shan, HU Shu-ming

(College of Horticulture, Agriculture University of Hebei, Baoding 071000, Hebei)

【Objective】 To investigate the proteins which are related to the sex differentiation, and lay a foundation for revealing the molecular mechanism of sex differentiation inL. 【Method】Differential proteins were analyzed in female flower buds, male flower buds and hermaphroditic flower buds at hermaphroditic differentiation stage by 2-D electrophoresis, mass spectrometry and bioinformatics method. 【Result】Compared male and female flower buds, 25 specific protein spots and 5 up-regulated protein spots were detected in male flower buds, 13 specific protein spots and 12 up-regulated protein spots were detected in female flower buds. Compared with male flower buds, 19 specific protein spots and 8 up-regulated protein spots were detected in hermaphroditic flower buds. The proteins were identified by LC-MS-MS and analyzed through bioinformatics. Six specific or up-regulated homologous proteins ofwere identified in male flower buds, including luminal binding protein (BiP) which promoted the synthesis of alpha amylase; beta-amylase, glyceraldehyde-3-phosphate and cytosolic phosphoglycerate kinase which are all involved in the glycolytic pathway, PAP fibrillin which is associated with liposomes,Os02g0634900 which its function is unknown. There were 16 specific or up-regulated homologous proteins ofwere identified in hermaphroditic and female flower buds, including enolase 1 and cytosolic phospho-glycerate kinase which are involved in the glycolytic pathway, actin isoform B and actin which maintained cell structure, ATP synthase CF1 alpha subunit and ATP synthase beta subunit which participated in energy metabolism;small GTP-binding protein and GTP-binding protein which participated in material transportation, ribosome inactivating protein RIPm which depressed protein synthesis, ADP-ribosylation factor which participated in material transportation and signal transduction, nucleoside diphosphate kinase which catalyzed phosphate group transfer, plastid-lipid-associated protein which participated in lipid metabolism,oxygen-evolving enhancer protein 1 which was related to photosynthesis, porin which allowed ions, sugars and amino acids across the outer membrane, intracellular pathogenesis-related protein isoform 4 and hypothetical protein which their functions are unknown.【Conclusion】Beta-amylase,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, cytosolic phosphoglycerate kinase, luminal binding protein (BiP), PAP fibrillin and Os02g0634900 which are homologous proteins ofare related to the male organ development. Enolase 1, cytosolic phosphoglycerate kinase, actin isoform B, actin, ATP synthase CF1 alpha subunit, small GTP-binding protein, GTP-binding protein, ribosome inactivating protein RIPm, with strong similarity to ADP-ribosylation factor, nucleoside diphosphate kinase, plastid-lipid-associated protein, oxygen-evolving enhancer protein 1, porin and hypothetical protein which are homologous proteins of, ATP synthase beta subunit and intracellular pathogenesis-related protein isoform 4 are related to the female organ development. Oxygen-evolving enhancer protein 1 and porin which are homologous proteins ofmight be the key proteins of female organ’s development.

; female flower buds; male flower buds; hermaphroditic flower buds; sex differentiation; differential proteins

2016-04-15；接受日期：2016-08-25

河北省自然科學(xué)基金（C2012204065）

聯(lián)系方式：劉孟，Tel：15933589812；E-mail：hbndsclm10@163.com。通信作者乜蘭春，Tel：13784960296；E-mail：nlch66@126.com