DNA聚合酶基因在范可泥貧血癥家系突變狀態(tài)中的影響研究

劉宇　王培昌

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·論著·

DNA聚合酶基因在范可泥貧血癥家系突變狀態(tài)中的影響研究

劉宇王培昌

目的通過對范可泥貧血癥(fanconi anemia,FA)家系DNA聚合酶基因突變分析，初步觀察其穩(wěn)定突變位點(diǎn)，為上述疾病易感基因風(fēng)險突變位點(diǎn)的進(jìn)一步確定奠定基礎(chǔ)。 方法FA家系15例成員作為研究對象對家系先征者DNA聚合酶基因家族POLA、POLB、POLD1、POLD2、POLE、POLG測序，檢測突變位點(diǎn)，并分析篩選有義突變位點(diǎn)；對家系成員在先征者有義突變區(qū)域直接測序。結(jié)果FA患兒DNA聚合酶的外顯子共有四個突變位點(diǎn)。其中，POLD1 19p13.3-1 3.4 EXON2 50403975 G>A，密碼子由CGU變?yōu)镃AU,氨基酸由精氨酸變?yōu)榻M氨酸；POLE1 12p24.3 EXON43-44 132688389 A>G，密碼子由GAG變?yōu)镚GG，編碼氨基酸由谷氨酸變?yōu)楦拾彼幔患蚁抵谢純旱哪赣H、外祖父發(fā)生POLD1 EXON2 50403975 G>A；家系中患兒的外祖母、外祖父、祖母、父親、母親、二伯、四伯、大姑、二姑、兩個堂姐均發(fā)生了POLE1 EXON43-44 132688389 A>G。結(jié)論通過對FA家系成員在上述已經(jīng)篩選出的兩個突變位點(diǎn)進(jìn)行測序，該家族成員廣泛攜帶這兩個突變位點(diǎn)。這兩個基因的突變位點(diǎn)應(yīng)得到足夠的重視，其可能為FA疾病的穩(wěn)定突變位點(diǎn)。

范可尼貧血癥；共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥；DNA聚合酶基因；家系；基因突變；基因表達(dá)

范可泥貧血癥(FA)是一種常染色體或X染色體連鎖的隱性遺傳病，其又稱為范可尼綜合征，患者具有先天性發(fā)育異常、骨髓衰竭、高度癌癥易感性等特征。FA在人群中發(fā)病比例十分罕見，僅為1∶1 000 000～5∶1 000 000[1]。1927年由瑞士Fanconi[2]首先命名并報道。FA患者的臨床表現(xiàn)具有多樣性的特點(diǎn)，多伴有FA患者可出現(xiàn)發(fā)育遲滯現(xiàn)象， 表現(xiàn)為體格矮小、小頭畸形、眼球小，皮膚色素沉著，拇指或橈骨不發(fā)育或缺如，呈多指、有指蹼等，還可合并貧血、出血、感染。FA患者多數(shù)伴有進(jìn)行性骨髓衰竭，最終約90%的FA患者死于此原因[3]?；颊哌€好發(fā)腫瘤，25%的FA患者以實(shí)體腫瘤而就診[3]，其中多見鱗狀細(xì)胞癌(食管癌、陰道癌)和頭頸部癌，此外還有腦瘤、星狀細(xì)胞瘤、肝癌、腎母細(xì)胞癌和乳腺癌等[4]。近年來對FA的研究進(jìn)展快速，現(xiàn)臨床將FA分為15 個亞型，并已有15 個相關(guān)基因相應(yīng)被克隆，且發(fā)現(xiàn)這15個基因中任何一個特定突變或缺失均與不同的FA亞型相對應(yīng)，呈現(xiàn)不同的臨床特征，這些基因均參與DNA交聯(lián)損傷修復(fù)[5-8]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)情況下,FA是由FA基因中的一個發(fā)生突變而不是多個發(fā)生突變導(dǎo)致，已經(jīng)確定, 這15個FA 基因的突變導(dǎo)致超過95%已知患者的FA 綜合征。然而,在實(shí)際病例中還發(fā)現(xiàn)有一些FA患者并沒有已知的15個FA 基因的突變,說明還有一些未知的FA 相關(guān)基因有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。眾所周知，真核細(xì)胞主要有5種DNA聚合酶，分別為DNA聚合酶α(DNA polymerase α,polα)、DNA聚合酶β(DNA polymerase β, polβ)、DNA聚合酶γ(DNA polymerase γ, polγ)、DNA聚合酶δ(DNA polymerase δ, polδ)、DNA聚合酶ε(DNA polymerase ε, polε)。DNA聚合酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、線粒體DNA復(fù)制等均起著十分重要的作用。本文檢測了一個FA家系編碼DNA polα、β、γ、δ、ε的部分基因序列，以期發(fā)現(xiàn)FA家系穩(wěn)定的突變位點(diǎn)，為滯后FA風(fēng)險突變位點(diǎn)的篩選及機(jī)制研究提供一定的基礎(chǔ)。

1　資料與方法

1.1一般資料FA家系，家系圖見圖1。

圖1本研究FA家系圖譜,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15分別代表外祖父、外祖母、祖父、祖母、母親、父親、大伯、二伯、三伯、四伯、大姑、二姑

1.2儀器與試劑儀器、試劑和耗材各稱生產(chǎn)廠家見表1、2。

表1　主要儀器

表2　主要試劑、耗材

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集和處理：征得家系成員知情同意的情況下，當(dāng)?shù)夭杉蚁党蓡T14人的外周血5 ml置于乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)抗凝管中，干冰保存運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2全血DNA提取:詳見試劑盒說明書。

1.3.3引物設(shè)計(jì)：對所研究的六條基因POLA、POLB、POLD1、POLD2、POLE、POLG外顯子設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)采用Primer Premier 5.0專業(yè)軟件，生工生物合成。

1.3.4PCR擴(kuò)增：采用普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)PCR技術(shù)，直接采用設(shè)計(jì)引物對上述六條基因的外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。見表3。

表3　PCR擴(kuò)增體系及參數(shù)

注：退火溫度根據(jù)引物TM值設(shè)定，延伸時間根據(jù)片段長度設(shè)定

1.3.5PCR產(chǎn)物純化：PCR產(chǎn)物電泳后，用DNA純化試劑盒純化，詳見試劑盒說明書。

1.3.6PCR產(chǎn)物測序：將上述已純化好的PCR產(chǎn)物交美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.3.7患兒目的基因序列分析：將上述測序結(jié)果用Chromas軟件與美國NCBI基因庫所公布的POLA、POLB、POLG、POLD1、POLD2和POLE六條基因序列進(jìn)行比對，尋找突變位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)后對該位點(diǎn)反向測序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.8家系成員突變位點(diǎn)位置測序：提取家系成員基因組DNA，對家系成員在上述比對結(jié)果所查找出的有意義的突變位點(diǎn)位置進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、測序。

2　結(jié)果

2.1患兒目的基因突變位點(diǎn)信息對該FA家系先證者POLA、POLB、POLG 、POLD1、POLD2和POLE六條基因外顯子序列進(jìn)行比對。發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)后對該位點(diǎn)所在六個基因反向測序發(fā)現(xiàn)，外顯子區(qū)共有4個突變位點(diǎn)，內(nèi)含子區(qū)共發(fā)現(xiàn)7個突變位點(diǎn)。其中有兩個外顯子區(qū)位點(diǎn)突變導(dǎo)致了氨基酸改變，分別是位于POLD1基因 19 p13.3～13.4 EXON2 50403975，密碼子由CGU突變?yōu)镃AU，編碼氨基酸由精氨酸變?yōu)榻M氨酸；另一突變位點(diǎn)位于POLE1基因12 p24.3 EXON43-44 13268838，密碼子由GAG突變?yōu)镚GG，編碼氨基酸由谷氨酸變?yōu)楦拾彼帷Ｒ姳?、5，圖2、3。

表4　FA患兒DNA聚合酶基因外顯子突變位點(diǎn)分析

表5　FA患兒DNA聚合酶基因非外顯子區(qū)域突變位點(diǎn)分析

圖2　DNA POLD1EXON2部分測序結(jié)果;箭頭示POLD1 EXON250403975突變(G>A)

2.2家系成員在患兒突變位點(diǎn)位置測序結(jié)果分析POLD1 EXON2 50403975與POLE1 EXON45 132688389均導(dǎo)致了氨基酸的改變，因突變位點(diǎn)分別位于DNApol δ催化亞基和DNA pol ε催化亞基，推測此兩個突變位點(diǎn)對DNA pol δ、DNA pol ε功能影響較大，為分析其是否為該家系穩(wěn)定遺傳突變位點(diǎn)，本研究對家系其他成員該位點(diǎn)進(jìn)行測序。發(fā)現(xiàn)家系中患兒的母親、外祖父亦見POLD1 EXON2 50403975G>A；家系中患兒的外祖母、外祖父、祖母、父親、母親、二伯、四伯、大姑、二姑、兩個堂姐均見POLE1 EXON43-44 132688389 A>G。見表5、6，圖4、5。

3　討論

FA是由于基因損傷修復(fù)缺陷所致，而DNA損傷修復(fù)是一復(fù)雜的生理過程，與DNA堿基錯配、氧化損傷、交聯(lián)、插入或缺失等的識別、切除及修復(fù)密切相關(guān)，那么，DNA聚合酶家族與FA關(guān)系如何，是否DNA聚合酶基因突變直接或間接導(dǎo)致了FA的發(fā)生，筆者目前尚未見報道。FA為一種罕見的常染色體或X染色體連鎖隱性遺傳病，一般5～10年發(fā)病[9]。有研究報道，除去骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)和急性髓細(xì)胞白血病(acute myelocytic leukemia,AML)所占比例，F(xiàn)A患者患實(shí)體腫瘤的累積發(fā)病率已達(dá)到76%[10]。FA患者的臨床表現(xiàn)有些僅表現(xiàn)為輕微貧血，部分表現(xiàn)為多臟器或身體特定部位發(fā)育畸形伴嚴(yán)重的再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)，有些以AML為首發(fā)表現(xiàn)。經(jīng)對FA患者臨床表現(xiàn)總結(jié)，此病的臨床表現(xiàn)個體差異很大，除臨床表現(xiàn)及常規(guī)檢查應(yīng)作為此病診斷的重要標(biāo)準(zhǔn)，還要結(jié)合其他診斷方法，如基因診斷等。

圖3　DNA POLE1 EXON45部分測序結(jié)果;箭頭示POLE1 EXON45132688389突變(A>G)

樣品名稱染色體外顯子區(qū)域STARTENDREFALT原始氨基酸原始密碼子突變氨基酸突變密碼子ANNOGENE先證者Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GA精氨酸CGU組氨酸CAUexonicPOLD1ymk-pold1Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GG精氨酸CGU精氨酸CGUexonicPOLD1yj-pold1Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GG精氨酸CGU精氨酸CGUexonicPOLD1ywk-pold1Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GG精氨酸CGU精氨酸CGUexonicPOLD1zjy-pold1Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GG精氨酸CGU精氨酸CGUexonicPOLD1zhl-pold1Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GA精氨酸CGU組氨酸CAUexonicPOLD1zmd-pold1Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GA精氨酸CGU組氨酸CAUexonicPOLD1yck-pold1Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GG精氨酸CGU精氨酸CGUexonicPOLD1ylx-pold1Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GG精氨酸CGU精氨酸CGUexonicPOLD1yyw-pold1Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GG精氨酸CGU精氨酸CGUexonicPOLD1wgl-pold1Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GG精氨酸CGU精氨酸CGUexonicPOLD1ysl-pold1Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GG精氨酸CGU精氨酸CGUexonicPOLD1yt-pold1Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GG精氨酸CGU精氨酸CGUexonicPOLD1ysk-pold1Char19-p13.3-13.419638-202745040397550403975GG精氨酸CGU精氨酸CGUexonicPOLD1

注：ymk、yj、ywk、zjy、zhl、zmd、yck、ylx、yyw、wgl、ysl、yt、ysk分別代表患兒的父親、四伯、大伯、外祖母、外祖父、母親、二伯、大姑、祖父、祖母、二姑、姐姐、三伯

表6　POLE EXON45132632393A>G在家系成員中突變情況位點(diǎn)分析

注：ymk、yj、ywk、zjy、zhl、zmd、yck、ylx、yyw、wgl、ysl、yt、ysk分別代表患兒的父親、四伯、大伯、外祖母、外祖父、母親、二伯、大姑、祖父、祖母、二姑、姐姐、三伯

圖4FA家系POLD1 EXON2 50403975突變位點(diǎn)攜帶示意圖.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15分別代表患兒的外祖父、外祖母、祖父、祖母、母親、父親、大伯、 二伯、三伯、四伯、大姑、二姑、患兒、大堂姐、二堂姐

圖5FA家系POLE1 EXON45 132688389突變位點(diǎn)攜帶示意圖. 1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、14、15分別代表患兒的外祖父、外祖母、祖父、祖母、母親、父親、大伯、二伯、三伯、四伯、大姑、二姑、患兒、大堂姐、二堂姐

大量研究顯示，F(xiàn)A發(fā)病與一系列參與DNA 交聯(lián)損傷修復(fù)基因的突變有關(guān)，迄今已克隆了15個FA基因，它們是FANC A,FANC B,FANC C,FANC D1,FANC D2,FANC E，F(xiàn)ANC F,FANC G,FANC I,FANC J,FANC L,FANC M,FANC N,FANC O,FANC P[11-14]。且已明確95%的FA患者是由上述FA基因中的某一個發(fā)生突變所致[15]。但是仍有少部分FA病例突變未發(fā)生在上述區(qū)域，提示尚有一些未知的基因突變與FA發(fā)生有關(guān)聯(lián)[1]。

真核DNA聚合酶家族在基因的損傷修復(fù)中起到至關(guān)重要的作用。DNApol α的生物學(xué)功能包括復(fù)制(引發(fā)復(fù)制起始)、DNA雙鏈斷裂修復(fù)(DNA double strand breaks repair，DSBR)、端粒穩(wěn)定性維持、S 期關(guān)卡調(diào)控；DNA pol β主要參與DNA損傷修復(fù)；DNA pol γ主要參與線粒體DNA 復(fù)制；DNA pol δ除參與DNA復(fù)制等，還參與DNA損傷修復(fù)，包括錯配修復(fù)(Mis-match repair，MMR)、堿基切除修復(fù)(Base excision repair，BER)、核苷酸切除修復(fù)(Nuleotide excision repair，NER)、DSBR、重組、端粒穩(wěn)定性維持、S 期關(guān)卡調(diào)控等作用；DNA polε的生物學(xué)功能主要為復(fù)制、損傷修復(fù)(MMR、BER、DSBR)、重組、轉(zhuǎn)錄沉寂、S 期關(guān)卡調(diào)控[16]。此外，DNA聚合酶與腫瘤易感性有著密不可分的聯(lián)系，已有研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌組織中DNA pol δ催化亞基p125表達(dá)水平較癌旁組織高，肺癌組織中DNA pol δ第4個亞基p12 低表達(dá)，也有發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織及細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)DNA pol δ催化亞基p125 的編碼基因POLD1 發(fā)生突變[17]。

DNA pol δ是最保守的真核生物DNA 聚合酶，POLD1編碼 DNA聚合酶δp125催化亞基，其位于19號染色體q13.3～13.4上。POLD1的cDNA全長3 443 bp，包含了27個外顯子和26 個內(nèi)含子，該片段可編碼1 107個氨基酸[17]。DNA聚合酶δ參與真核生物DNA合成、損傷、修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)控等過程，與腫瘤的發(fā)生有著密不可分的關(guān)系，它是非常重要聚合酶之一。真核DNApol ε有4個亞基，分別是Pol2(最大亞基、催化亞基、A亞基)、Dpb2、Dpb3 和Dpb4。其中催化亞基在DNA復(fù)制、校正、損傷修復(fù)等起著十分重要的作用。Pol2 的N端結(jié)構(gòu)域不但有聚合酶活性和還具有3’-5’外切酶活性。起著催化活性作用的C端結(jié)構(gòu)域不僅介導(dǎo)催化亞基與另外3個小的調(diào)節(jié)亞基間的相互作用,而且與S 期的復(fù)制關(guān)卡裝置相關(guān)聯(lián)[18]。有研究顯示, 鼠雙微基因2(murine double minute 2，MDM2)是腫瘤抑制因子p53 的一種調(diào)節(jié)因子。MDM2 可與DNA聚合酶ε催化亞基的C 端結(jié)構(gòu)域相結(jié)合[19]，通過誘導(dǎo)使DNA聚合酶ε結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 對DNA損傷作出反應(yīng)[20]。DNA聚合酶δ、DNA聚合酶ε是真核生物兩種非常重要的酶，研究表明DNA聚合酶δ突變基因型的出現(xiàn)會提高腫瘤易感性[21]，DNA聚合酶ε的催化亞基Pol2 與其他真核DNA 聚合酶B家族成員尤其是DNA聚合酶δ催化亞基相比結(jié)構(gòu)有同源性(圖6[22])。

圖6　DNAPE與DNAPD催化亞基的結(jié)構(gòu)比較

本研究病例來自內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾地區(qū)1例EA家系，該家系共3代14名成員。先證者，女，11歲，口唇發(fā)白，明顯貧血貌，手部拇指有特征性的先天畸形，身材比同齡孩子矮小，有兒童MDS血象表現(xiàn)。先癥者于2009年在首都醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院血液科就診，接受臨床體征和骨髓穿刺檢查，診斷為范可尼貧血，詢問其他家系成員均無此病。

對患兒DNA聚合酶基因測序，在外顯子區(qū)域有4處突變位點(diǎn)，內(nèi)含子區(qū)共7個突變位點(diǎn)。其中兩處有義外顯子突變位點(diǎn)，分別是POLD1 EXON2 50403975(G>A)，家系中患兒的母親、外祖父在該位點(diǎn)亦有突變；POLE1 EXON43-44 132688389(A>G)，家系中患兒的外祖母、外祖父、祖母、父親、母親、二伯、四伯、大姑、二姑、兩個堂姐亦有該處突變?；純悍峭怙@子區(qū)域的(內(nèi)含子)突變位置多位于POLE1 12 p24.3。

POLD1 EXON2 50403975(G>A)突變，密碼子由CGU變?yōu)镃AU，編碼的氨基酸由精氨酸變?yōu)榻M氨酸，該突變位于DNA pol δ催化亞基；POLE1 EXON43-44 132688389(A>G)，密碼子由GAG變?yōu)镚GG，編碼氨基酸由谷氨酸變?yōu)楦拾彼?，該突變位于DNA pol ε催化亞基。上述2個突變可能導(dǎo)致了DNA聚合酶DNA復(fù)制及損傷修復(fù)功能的改變，推測與先證者發(fā)病存在一定關(guān)聯(lián)。尤其引人關(guān)注的是，該家系中發(fā)生上述兩處突變位點(diǎn)的成員應(yīng)密切回訪，觀察是否發(fā)病。

本研究還存在很多不足，由于疾病本身的罕見性導(dǎo)致了研究例數(shù)過少，雖在研究中發(fā)現(xiàn)了該FA家系中存在的潛在的易感突變位點(diǎn)，但要最終確定還需在更多家系中驗(yàn)證。此外，還需要繼續(xù)對DNA聚合酶基因家族擴(kuò)大測序范圍，才能更全面地找到DNA聚合酶基因?qū)υ摬〉囊赘型蛔兾稽c(diǎn)。DNA聚合酶對FA的發(fā)生發(fā)展以及對其發(fā)病機(jī)制有何作用還有待更加深入的研究。

該部分對一個FA家系成員進(jìn)行了DNA聚合酶基因測序，在先證者中發(fā)現(xiàn)兩處有義外顯子突變位點(diǎn)POLD1 EXON2 50403975(G>A)、POLE1 EXON43-44 132688389(A>G)。在未發(fā)病的家系成員中患兒的母親、外祖父亦有POLD1 EXON2 50403975(G>A)；患兒的外祖母、外祖父、祖母、父親、母親、二伯、四伯、大姑、二姑、兩個堂姐亦有POLE1 EXON43-44 132688389(A>G)。

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Study on the mutation status of DNA polymerase genes in Fanconi anemia family constellation

LIUYu,WANGPeichang.

DepartmentofClinicalLaboratory,XuanwuHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100153,China

ObjectiveThrough analysing the mutation status of DNA polymerase genes in Fanconi anemia (FA) family constellation to observe initially its stable mutation sites in order to establish basis further for determining the risky mutation site of predisposing genes of the disease.MethodsThe 15 family menbers of FA family constellation were enrolled in the study. DNA polymerase gene family members including POLA,POLB,POLD1,POLD2,POLE and POLG of FA proband were analyzed by gene sequencing to screen meaningful mutation sites,and DNA of the family members was analyzed by direct sequencing in plus sense mutation region of the proband.ResultsThere were four mutation sites in exon of DNA polymerase in children patients with FA in which POLD1 19p13.3～13.4 EXON2 50403975 G>A,the codon was changed from CGU to CAU,and coding amino acid was changed from glutamic acid to glycine,moreover, POLE1 12p24.3 EXON43-44 132688389 A>G, the codon was changed from GAG to GGG,and coding amino acid was changed from glutamic acid to glycine,besides, POLE1 12p24.3 EXON43-44 132688389 G>A in patient's mother and adoptive grand-father,and there appeared POLE1 EXON43-44 132688389 A>G in patient's adoptive grand-mother,adoptive grand-father, grandmother,father,mother,the second uncle,the 4th uncle,the first aunt,the second aunt,two sisters in-law.ConclusionThrough the sequencing for two gene mutation sites of FA family members that have been selected, it is indicated that the family members take along with the two gene mutation sites generally.Thus,the two gene mutation sites should be payed much attention to,besides,which may be the stable mutation sites of FA.

Fanconi anemia;ataxiatelangiectasia;DNA polymerase genes; family constellation; gene mutation; gene expression

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.19.001

100153北京市，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科

王培昌,100153北京市，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科；

E-mail：583494898@qq.com

R 394.112

A

1002-7386(2016)19-2885-06

2016-03-02)