microRNA-34a體外調(diào)控鼻咽癌鱗狀腫瘤干細(xì)胞表型

江文靜　蔣學(xué)范　胡未鳴

浙江省人民醫(yī)院耳鼻喉科，浙江杭州310000

microRNA-34a體外調(diào)控鼻咽癌鱗狀腫瘤干細(xì)胞表型

江文靜蔣學(xué)范胡未鳴▲

浙江省人民醫(yī)院耳鼻喉科，浙江杭州310000

目的探討microRNA-34a（miR-34a）對(duì)鼻咽癌鱗狀腫瘤干細(xì)胞表型的體外調(diào)控作用。方法利用原代培養(yǎng)的人類鼻咽癌細(xì)胞，采用流式分選法定量并收集ALDH（aldehyde dehydrogenase）+腫瘤干細(xì)胞。通過(guò)RT-qPCR分析miR-34與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)因子（Sox2、Nanog、Oct3/4）在ALDH+和ALDH-細(xì)胞中的表達(dá)情況。進(jìn)一步用miR-34a擬態(tài)轉(zhuǎn)染評(píng)估其對(duì)鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物以及相關(guān)因子的表達(dá)調(diào)控能力。結(jié)果原代鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)ALDH的細(xì)胞約占15.43%左右。與ALDH-細(xì)胞相比，miR-34a表達(dá)水平在大多數(shù)ALDH+細(xì)胞中顯著下調(diào)（-13.2 vs-4.1倍），3種腫瘤干細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)顯著增加（最高36.8倍）。ALDH+細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a擬態(tài)24 h、48 h、72 h后miR-34a mRNA水平顯著增加，48 h時(shí)達(dá)峰值水平（4.49倍，P＜0.01），而3種腫瘤干細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)水平顯著降低。結(jié)論恢復(fù)miR-34a表達(dá)顯著抑制人類原代鼻咽癌干細(xì)胞表型的形成。調(diào)控鼻咽癌和腫瘤干細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)可能降低腫瘤治療后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率。

鼻咽癌；腫瘤干細(xì)胞；microRNA-34a；轉(zhuǎn)染；擬態(tài)；醛脫氫酶

［Abstract］Objective To investigate the role of miR-34a in regulating cancer stem cell（CSC）phenotype of nasopharyngeal squamous cell carcinoma in vitro.Methods The cells were isolated from patients with nasopharyngeal carcinoma（NPC）and cultured in vitro.Flow-cytometry was used to quantify and enrich for ALDH+cancer stem cells（CSCs）.RT-qPCR was performed to analyze expression patterns of miR-34a and CSC-related transcription factors（CSC-TFs）（Sox2，Nanog，Oct3/4）for ALDH+and ALDH-cells.Transfection of miR-34a mimics was used to evaluate its regulatory potential for CSC marker profiles as well as CSC-TFs expression in NPC-CSC.Results The expression of ALDH was found in around 15.43%of primary NPC cells.miR-34a expression levels were significantly downregulated in the majority of ALDH+cells derived from primary NPC as compared to ALDH-cells（-13.2 vs-4.1 fold）.For CSC-related TF expression，ALDH+cells showed a significantly increased level compared to ALDH-cells（up to 36.8 fold）.miR-34a mRNA level in ALDH+cells after transfection with miR-34a mimics significantly increased after 24 h，48 h and 72 h，and the peak of miR-34a level was found 48 h post-transfection（4.49 fold，P＜0.01）.Transfection of miR-34a mimics significantly reduced the CSC-related TF expression level in ALDH+cells.Conclusion Restoration miR-34a significantly inhibited the formation of CSC-phenotype in human primary NPC cells.Therapeutic modulation of miR-34a in NPC and CSCs may reduce the rate of metastasis and recurrence of tumors after therapy.

［Key words］Nasopharyngeal carcinoma；Cancer stem cells；microRNA-34a；Transfection；Mimics；Aldehyde dehydrogenase

近年來(lái)，通路靶向抑制治療鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）的報(bào)道已取得了一些進(jìn)展，但其研究?jī)H限于NPC細(xì)胞株，未充分考慮到腫瘤細(xì)胞株在逐代的培養(yǎng)過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生某些生物學(xué)行為的改變，如細(xì)胞活性、藥物敏感性等等［1］。因此，為使研究更貼近臨床人體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，本文探討了miR-34a和人類原代NPC干細(xì)胞生物學(xué)行為之間的關(guān)系。本研究首先采用流式分選法分選出ALDH+和ALDH-細(xì)胞，然后通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)兩種細(xì)胞中CSCs相關(guān)的3種轉(zhuǎn)錄因子（CSC-TFs：Sox2、Nanog、Oct3/4）［2］及miR-34a的表達(dá)是否有差異，并將ALDH+細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a擬態(tài)，比較不同作用時(shí)間（24 h、48 h、72 h）后miR-34a及3種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的變化，探討miR-34a轉(zhuǎn)染對(duì)NPC干細(xì)胞增殖是否有抑制效應(yīng)。

1　材料與方法

1.1鼻咽癌原代細(xì)胞培養(yǎng)

新鮮鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織由本院耳鼻喉科提供。本研究經(jīng)患者知情同意和醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，研究工作從2015年8月開(kāi)展至今。步驟：①適量新鮮標(biāo)本置于15 mL離心管中，裝2 mL含10℅FBS（Gibco公司）的RPMI-1640（Gibco公司）培養(yǎng)基。②去除外周壞死組織，無(wú)血清培養(yǎng)基充分漂洗3次。③將組織塊剪成0.5 mm大小，加入適量0.25℅胰酶，37℃消化8～10 min；含10℅FBS的培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后200目篩網(wǎng)過(guò)濾；將濾液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基3 mL，置于37℃、5%CO2、濕潤(rùn)空氣的密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。④96孔板單細(xì)胞克隆分離提純細(xì)胞。

1.2Aldefluor測(cè)定和FACS分選

Aldefluor測(cè)定試劑盒（StemCell公司）檢測(cè)細(xì)胞活性；將細(xì)胞用胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，不含Ca2+/Mg2+的PBS洗滌，重懸浮于含5 μL ALDH底物的1 mL Aldefluor緩沖液中（1×106個(gè)細(xì)胞/mL），暗室37℃孵育30～40 min。加入ALDH抑制劑（DEAB，50 mmol/L）作為陰性對(duì)照。所有樣本使用250×g離心5 min，棄上清。緩沖液洗滌細(xì)胞兩次后加入ALDH緩沖液，并置于冰上待用。將細(xì)胞懸浮于PBS緩沖中，107個(gè)細(xì)胞/mL，應(yīng)用流式細(xì)胞儀Aria cell sorter進(jìn)行分選（BD Biosciences公司）。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR

Trizol試劑（Gibco公司）分離總RNA，Poly A尾和cDNA使用Ncode VILO miR cDNA（Invitrogen）合成。使用Chromo 4（BioRad）PRC儀及SYBR Green ERTM qPCR SuperMix試劑（Invitrogen公司）進(jìn)行RT-qPCR分析。參照基因GAPDH。啟動(dòng)序列見(jiàn)表1。

1.4microRNAs（miRs）的轉(zhuǎn)染

為轉(zhuǎn)染miR擬態(tài)（mimics），首先將ALDH+細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，然后接種于含完全培養(yǎng)基的6孔板中，密度8×104個(gè)細(xì)胞/孔。50 nmol/L miR-34a擬態(tài)（mimics）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，陰性對(duì)照（NC）或空白對(duì)照（MOCK）用Lipofectamine RNAiMAX試劑（Invitrogen），且不含抗生素Opti-MEM（Invitrogen）。使用BLOCK-ITTM公司的Alexa Fluor紅色熒光指示劑處理后，通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)以確定轉(zhuǎn)染效率。RT-qPCR評(píng)估對(duì)ALDH+細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后miR-34a的表達(dá)及3種CSC-TFs的表達(dá)進(jìn)行定量，后者分別在轉(zhuǎn)染后的24 h、48 h和72 h測(cè)定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用2△△Ct進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［3］，相關(guān)CT值見(jiàn)表2～5。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ALDH在NPC中表達(dá)情況

流式分選ALDH+腫瘤干細(xì)胞，見(jiàn)圖1。DEAB抑制下分采用流式分選法定性并分選ALDH+細(xì)胞。圖1左顯示DEAB抑制下ALDH+細(xì)胞分選情況，圖1右顯示無(wú)DEAB抑制劑下ALDH+細(xì)胞分選情況，R2區(qū)域顯示ALDH+細(xì)胞熒光強(qiáng)度（原代鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)ALDH的細(xì)胞均占15.43%左右）。

2.2RT-qPCR分析CSC相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（CSC-TFs: Sox2、Nanog、Oct3/4）mRNA及miR-34a的表達(dá)

圖1　DEAB抑制下流式分選ALDH+和ALDH-細(xì)胞

RT-qPCR分析3種CSC-TFs的表達(dá)，ALDH+細(xì)胞中3種CSC-TFs的表達(dá)均顯著高于ALDH-細(xì)胞（最高36.8倍）（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)圖2、表2；RT-qPCR分析miR-34a的表達(dá)，ALDH+細(xì)胞中miR-34a表達(dá)量顯著低于ALDH-細(xì)胞（-13.2 vs-4.1倍），見(jiàn)圖3、表3。

表1　RT-PCR引物序列（5’→3’）

2.3miR-34a超表達(dá)降低ALDH+細(xì)胞的干細(xì)胞特性

ALDH+細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后miR-34a表達(dá)量比較，轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h其表達(dá)量顯著增加，其中48 h時(shí)表現(xiàn)更明顯（4.49倍），然而與對(duì)照組比較，Mock組轉(zhuǎn)染前后miR-34a表達(dá)量無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖4、表4。ALDH+細(xì)胞轉(zhuǎn)染后CSC相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Nanog、Oct3/4）表達(dá)顯著降低，Sox2表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖5、表5。

圖2　ALDH+細(xì)胞中CSC相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（CSC-TFs：Sox2］Nanog］Oct3/4）的表達(dá)顯著高于ALDH-細(xì)胞，*P＜0.05，**P＜0.01

圖3　ALDH+細(xì)胞中miR-34a表達(dá)量顯著低于ALDH-細(xì)胞，***P＜0.001

表2　ALDH+和ALDH-細(xì)胞中CSC相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)CT值

表3　ALDH+和ALDH-細(xì)胞miR-34a表達(dá)CT值

表4　miR-34a在3組ALDH+細(xì)胞且不同時(shí)間內(nèi)表達(dá)的CT值

圖4　ALDH+細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后miR-34a表達(dá)量比較，轉(zhuǎn)染后24 h］48 h］72 h其表達(dá)量顯著增加，其中48 h時(shí)表現(xiàn)更為明顯，*P＜0.05，**P＜0.01

圖5　ALDH+細(xì)胞轉(zhuǎn)染后CSC相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Nanog，Oct3/4）表達(dá)顯著降低，Sox2表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，*P＜0.05，**P＜0.01

3　討論

CSCs是腫瘤組織細(xì)胞的一小部分，它們具有無(wú)限的增殖潛能［4］。同時(shí)，CSCs是腫瘤細(xì)胞真正的“種子”，在某些腫瘤中表現(xiàn)出重要的生物學(xué)特性［5］，它們與腫瘤的發(fā)生、致癌性、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等密切相關(guān)，并對(duì)傳統(tǒng)的放化療具有抵抗性［6-7］。Ginestier等［8］發(fā)現(xiàn)將人類乳腺癌ALDH+細(xì)胞接種于非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷的小鼠體內(nèi)能形成腫瘤，因此推測(cè)這些細(xì)胞可能包含CSCs。隨后，利用ALDH1活性能從乳腺癌中鑒別并分離出CSCs［9］。ALDH在人類頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中分離出的CSC中也呈現(xiàn)高表達(dá)［10］。本研究中我們采用流式分選獲取具有CSC表型的ALDH+和ALDH-細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)了ALDH+細(xì)胞中3種CSCTFs的表達(dá)均顯著高于ALDH-細(xì)胞。

microRNAs（miRs）是非編碼短單鏈RNAs，在正常和腫瘤細(xì)胞中調(diào)控目的mRNAs基因的翻譯，頻繁失調(diào)能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。miR-34a屬于腫瘤抑制因子，它直接作用于p53轉(zhuǎn)錄后水平。在p53缺陷的人類胰腺癌細(xì)胞中，miR-34a過(guò)度表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期進(jìn)展及自我更新，表明miR-34a可能恢復(fù)p53功能，直接作用于與CSC分化和自我更新相關(guān)的下游靶基因［11］。MiR-34a也能抑制前列腺癌［12］和乳腺癌［13］腫瘤干細(xì)胞相關(guān)特性和功能的表達(dá)。最新研究顯示，miR-34a調(diào)節(jié)結(jié)腸癌干細(xì)胞的不對(duì)稱分裂，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［14］。此外，miR-34a不僅抑制非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞株的增殖，并能促進(jìn)其凋亡［15］。越來(lái)越多的研究表明，針對(duì)miRNA靶向抑制CSCs在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也能預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)［16］。本研究也證實(shí)miR-34a在ALDH+細(xì)胞中表達(dá)水平顯著低于ALDH-細(xì)胞，同時(shí)miR-34a能抑制原代NPC中ALDH+細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。近來(lái)相關(guān)研究也表明miR-34a在頭頸部CSC中下調(diào)可能誘發(fā)腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)生［17］。腫瘤干細(xì)胞相關(guān)因子Nanog、Oct3/4、Sox2在miRNA誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)［18］。然而，在我們的研究中miR-34a擬態(tài)轉(zhuǎn)染在增加miR-34a表達(dá)的同時(shí)，只減少ALDH+細(xì)胞中相關(guān)CSC表型Nanog、Oct3/4的表達(dá)，而Sox2表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本研究顯示原代NPC細(xì)胞中含ALDH+細(xì)胞，即NPC干細(xì)胞。RT-qPCR分析結(jié)果顯示ALDH+細(xì)胞中3種CSC-TFs的表達(dá)均顯著高于ALDH-細(xì)胞，但miR-34a表達(dá)量顯著低于ALDH-細(xì)胞。由此推斷，miR-34a的表達(dá)在NPC干細(xì)胞中明顯少于非NPC干細(xì)胞。進(jìn)一步對(duì)分選出的ALDH+細(xì)胞進(jìn)行miR-34a擬態(tài)轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后miR-34a表達(dá)量顯著增加，其中48 h時(shí)表現(xiàn)更明顯，然而對(duì)照組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明miR-34a表達(dá)呈一定時(shí)間依賴性。同時(shí)分別對(duì)ALDH+細(xì)胞轉(zhuǎn)染后3種CSC-TFs的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后CSC相關(guān)表達(dá)因子Nanog、Oct3/4的表達(dá)顯著降低，而Sox2表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。據(jù)此研究表明，miR-34a體外抑制鼻咽癌鱗狀腫瘤干細(xì)胞表型的表達(dá)。因此，使用針對(duì)相關(guān)通路靶向提高miR-34a表達(dá)從而抑制CSC的生長(zhǎng)，將可能成為徹底清除人類腫瘤包括NPC在內(nèi)的一個(gè)革新性治療策略。

此外，研究發(fā)現(xiàn)在口咽部鱗狀細(xì)胞癌中，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是否感染對(duì)細(xì)胞生物學(xué)和臨床特性也起到一定作用，與HPV-DNA-細(xì)胞相比，HPV-DNA+腫瘤細(xì)胞中ALDH1A1的表達(dá)水平降低［19］。ALDH1A1作為一種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記之一，與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后密切相關(guān)［20］。因此，在以后的研究中，圍繞HPV感染及治療將待進(jìn)一步研究。

表5　ALDH+細(xì)胞中CSC相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在3組條件下表達(dá)的CT值

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microRNA-34a regulates cancer stem cell phenotype of squamous nasopharyngeal carcinoma in vitro

JIANG WenjingJIANG XuefanHU Weiming
Department of Otorhinolaryngology，Zhejiang Provincial People's Hospital，Hangzhou310000，China

R76

A

1673-9701（2016）21-0028-05

2016-05-07）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016KYB024）▲