一種檢測(cè)生物硫醇熒光探針的合成與應(yīng)用

陳　頌，王　靜，侯　鵬，劉　磊，王　鑫

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院　藥學(xué)院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

?

一種檢測(cè)生物硫醇熒光探針的合成與應(yīng)用

陳頌*，王靜，侯鵬，劉磊，王鑫

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006)

基于硫醇誘導(dǎo)的邁克爾加成反應(yīng)阻斷探針的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過程(PET)合成了一種基于氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川(Bodipy)類染料的熒光探針，該探針具有高靈敏度和選擇性，可在生理?xiàng)l件下檢測(cè)硫醇。利用核磁和高分辨質(zhì)譜對(duì)探針結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。當(dāng)向探針溶液加入硫醇(0～1 000 μmol/L)時(shí)，可在探針溶液的綠色光譜區(qū)域引起一個(gè)顯著的熒光增強(qiáng)響應(yīng)(增強(qiáng)至150倍)。同時(shí)，探針可以檢測(cè)相對(duì)較低濃度的硫醇，對(duì)于含有硫醇的氨基酸(半胱氨酸、谷胱甘肽和高半胱氨酸)的檢出限分別為4.5×10-7，1.2×10-7，2.1×10-7mol/L。此外，相對(duì)于其他氨基酸，探針對(duì)硫醇具有較高的選擇性和靈敏度。該方法成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)硫醇的熒光成像，證明該熒光探針在生物體系中具有潛在的應(yīng)用能力。

合成;應(yīng)用;熒光探針;檢測(cè);生物硫醇

生物硫醇(如半胱氨酸、同型半胱氨酸和三肽化合物谷胱甘肽)可參與可逆的氧化還原反應(yīng)過程，調(diào)節(jié)生化途徑中的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞代謝，近年來受到了人們極大的關(guān)注。半胱氨酸的缺乏會(huì)導(dǎo)致各種健康問題，如生長(zhǎng)遲緩、毛發(fā)色素脫失、嗜睡、肝臟和皮膚組織損傷以及脂肪損失[1-4]。作為最豐富的細(xì)胞內(nèi)的非蛋白硫醇，谷胱甘肽以氧化還原調(diào)節(jié)器的角色在維持細(xì)胞還原環(huán)境的過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，包括保持蛋白質(zhì)中的半胱氨酸處于還原狀態(tài)，以及通過捕獲易損傷DNA和RNA的自由基保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激影響[5-9]。因此，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)硫醇的含量對(duì)細(xì)胞功能的研究具有重要意義。與其他檢測(cè)技術(shù)相比，光學(xué)檢測(cè)是一種操作比較簡(jiǎn)單的分析方法。其中，熒光分析法由于具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏以及適于細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注[10-12]。

盡管研究人員已設(shè)計(jì)合成了許多識(shí)別硫醇的熒光探針[13-19]，但開發(fā)一種高選擇性、高靈敏度、同時(shí)能夠應(yīng)用于生物成像的熒光探針，仍是廣大科研工作者關(guān)注的熱門課題。氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川(Bodipy)類熒光染料，又名氟硼熒，是一類非常優(yōu)秀的新型染料，其分子的高度剛性使之具有非常優(yōu)良的光物理性能，如，較高的摩爾消光系數(shù)(ε>80 000 cm-1·M-1)和熒光量子產(chǎn)率(0.6以上)，較好的光穩(wěn)定性，其光譜不易受溶劑極性、pH值以及激發(fā)光降解的影響，確保了其在熒光分析過程中獲得的光譜信息完全來源于被測(cè)試物[20-22]。本文合成了以Bodipy染料為信號(hào)表達(dá)基團(tuán)、硝基烯烴部分作為潛在反應(yīng)位點(diǎn)的選擇性硫醇熒光探針，并將其用于生物體系內(nèi)硫醇的檢測(cè)。在探針分子1中，引入硝基烯烴作為光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過程(PET)中電子的受體時(shí)，探針的水溶液幾乎無熒光，當(dāng)加入硫醇(RSH)后，硫醇進(jìn)攻硝基烯烴的雙鍵，進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)，導(dǎo)致原有的PET過程被中斷，使探針的熒光恢復(fù)(圖1)。利用反應(yīng)前后熒光光譜的變化，建立了一種熒光識(shí)別硫醇的分析方法。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Bruker AV400波譜儀(300 MHz)、Bruker microTOF-Q Ⅱ高分辨質(zhì)譜(美國(guó)Bruker公司)，F(xiàn)4600-熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Nikon Eclipse TE300)。

硝基甲烷、醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，哌啶(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，石油醚(天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠)，二氯甲烷(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，測(cè)試用氨基酸(上海國(guó)藥試劑有限公司)：半胱氨酸(Cys)，天冬氨酸(Asp)，丙氨酸(Ala)，纈氨酸(Val)，苯丙氨酸(Phe)，組氨酸(His)，亮氨酸(Leu)，絲氨酸(Ser)，異亮氨酸(Ile)，色氨酸(Trp)，賴氨酸(Lys)，精氨酸(Arg)，脯氨酸(Pro)，甘氨酸(Gly)，甲硫氨酸(Met)，酪氨酸(Tyr)，天冬酰胺(Asn)，谷氨酸(Glu)，蘇氨酸(Thr)，上述試劑均為分析純。

1.2探針的合成與表征

在氬氣保護(hù)下，將化合物2[23](70 mg，0.2 mmol)和硝基甲烷(50 mg，0.8 mmol)溶于10 mL甲苯中，加入哌啶和醋酸各1滴，回流2 h，待反應(yīng)完成后，降至室溫，將反應(yīng)液倒入水中，以二氯甲烷(3×25 mL)萃取，無水硫酸鈉干燥，柱層析分離(石油醚∶二氯甲烷=1∶1)得到產(chǎn)品(53 mg，收率 68%)，即為探針分子1。1H NMR(300 MHz，CDCl3)：δ8.03(d，J=13.7 Hz，1H)，7.55(s，3H)，7.39-7.27(m，3H)，6.16(s，1H)，2.71(s，3H)，2.62(s，3H)，1.47(s，3H)，1.42(s，3H)。 HRMS Calcd for:395.162；Found:395.191。

1.3光譜分析測(cè)試

稱取適量的熒光探針1溶解于乙腈中，配制成1.0×10-3mol/L儲(chǔ)備液，4 ℃冷藏保存，測(cè)試物經(jīng)去離子水溶解，配成1.0×10-2mol/L溶液。20 mmol/L HEPES緩沖液(pH 7.4，50% CH3CN)測(cè)試體系的配制：將0.003 mL熒光探針1儲(chǔ)備液加至1.497 mL乙腈中，再加入0.3 mL被測(cè)物質(zhì)溶液，最后用HEPES緩沖液(pH 7.4)定容至3 mL，混合均勻，測(cè)定其光譜。熒光分光光度計(jì)參數(shù)：λex=506 nm，λem=520 nm，狹縫寬度均為5 nm，電壓為700 V，靈敏度為2。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與成像

將HeLa細(xì)胞放在含有10% 胚胎血清的DMEM培養(yǎng)液中，5% CO2的條件下，37 ℃無菌培養(yǎng)24 h，將其接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)無菌培養(yǎng)過夜，經(jīng)PBS緩沖液漂洗3次，加入探針1至終濃度為5 μmol/L，孵化30 min，經(jīng)PBS緩沖液漂洗3次，置于Nikon Eclipse TE300熒光倒置顯微鏡進(jìn)行成像?？瞻讓?duì)照試驗(yàn)：在相同條件下，向HeLa細(xì)胞中預(yù)先加入N-甲基馬來酰亞胺(1 mmol/L)，37 ℃孵化30 min，經(jīng)PBS緩沖液漂洗3次，再加入探針1，孵化30 min，經(jīng)PBS緩沖液漂洗3次，置于熒光顯微鏡下進(jìn)行成像。

2　結(jié)果與討論

2.1熒光光譜研究

如圖2所示，隨著Cys的加入，探針1溶液在520 nm處的熒光顯著增強(qiáng)，當(dāng)加入(1 000 μmol/L)Cys時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)至150倍，在相同的測(cè)試條件下，將探針1(1 μmol/L)分別與Hcy和GSH作用均可觀察到以上相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過分析探針1與不同濃度(0～80 μmol/L)生物硫醇反應(yīng)的熒光發(fā)射光譜數(shù)據(jù)，并對(duì)其進(jìn)行擬合后得到Cys,Hcy,GSH的方程分別為y=41.98+11.19x(r=0.999 7)，y=104.08+43.48x(r=0.998 8)，y=49.13+24.49x(r=0.999 7),式中y為熒光強(qiáng)度，x為生物硫醇濃度(μmol·L-1)。計(jì)算得其檢出限分別為4.5×10-7，2.1×10-7，1.2×10-7mol/L。在活體細(xì)胞中，生物硫醇的含量一般在10-6～10-3mol/L之間，因此，該熒光探針的靈敏度符合細(xì)胞水平中硫醇定量檢測(cè)的要求。

2.2選擇性與干擾實(shí)驗(yàn)

為了評(píng)估探針1對(duì)生物硫醇的專一識(shí)別能力，本文選取常見的氨基酸、典型的金屬離子以及氧化還原劑作為測(cè)試物(Cys，Asp，Ala，Val，Phe，His，Leu，Ser，Ile，Trp，Lys，Arg，Pro，Gly，Met，Tyr，Asn，Glu，Thr，K+，Na+，Mg2+，Ca2+，Glucose，AA，H2O2，NADH)，測(cè)定了不同測(cè)試物(200 μmol/L)與探針1(1 μmol/L)混合后的熒光恢復(fù)比值。結(jié)果顯示，探針1對(duì)含有巰基的氨基酸(Cys)具有很高的選擇性，僅在二者反應(yīng)后于520 nm處表現(xiàn)出明顯的熒光比值增強(qiáng)(R=(IF-IF0)/IF0≈40)，而在生物體系的硫醇檢測(cè)中，其他測(cè)試物的存在對(duì)探針溶液的熒光行為均未造成影響(R≈0)。為進(jìn)一步評(píng)估探針1對(duì)生物硫醇的高度選擇性，在其他測(cè)試物存在下，進(jìn)行了干擾實(shí)驗(yàn)的研究。結(jié)果表明，除H2O2對(duì)探針1識(shí)別Cys產(chǎn)生輕微干擾外(R≈33)，其他測(cè)試物均不影響探針1對(duì)生物硫醇的檢測(cè)(R≈40)。而且，探針分子溶液對(duì)巰基氨基酸具有專一的顏色變化。因此，探針1在模擬的生理狀態(tài)下對(duì)生物硫醇顯示出極高的選擇性，并能夠有效抵抗其他氨基酸的干擾。

2.3pH值的影響

研究表明，人體體液的酸堿度波動(dòng)范圍一般為pH 6.8～7.5，因此，設(shè)計(jì)在較寬的范圍內(nèi)對(duì)生物硫醇具有穩(wěn)定識(shí)別能力的探針將十分符合現(xiàn)實(shí)需求。實(shí)驗(yàn)考察了pH值對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響(見圖3)。結(jié)果顯示在pH 2.0～10.0范圍內(nèi)，探針分子溶液的熒光強(qiáng)度幾乎一致，不同的pH值不會(huì)使探針的光學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生變化，在pH 11.0～12.0范圍內(nèi)，熒光略有增強(qiáng)是由于探針分子在堿性條件下分解。然而，當(dāng)探針1(1 μmol/L)中加入Cys(200 μmol/L)后，由pH 2.0增至pH 4.0時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，在pH 5.0～11.0范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)定?？紤]到熒光響應(yīng)最大以及實(shí)際應(yīng)用的可能，本文選擇生理pH 7.4 作為研究體系的pH值。

2.4熒光成像

為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)生物硫醇的檢測(cè)，選用人源宮頸癌傳代細(xì)胞(HeLa)探討探針1對(duì)生物硫醇的熒光成像實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。由于腫瘤細(xì)胞含有一定量的硫醇氨基酸維持細(xì)胞活性，因此將HeLa細(xì)胞在探針1中孵育后，通過熒光顯微鏡可觀察到顯著的黃色熒光，然而，將HeLa細(xì)胞預(yù)先用巰基阻斷劑N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEM)處理后，再在探針1中孵育，此時(shí)在細(xì)胞內(nèi)只觀察到微弱的熒光，說明觀察到的黃色熒光是由于細(xì)胞內(nèi)存在的含硫醇物質(zhì)與探針作用所致。細(xì)胞內(nèi)硫醇熒光成像實(shí)驗(yàn)證明，探針1具有檢測(cè)生物體系內(nèi)硫醇的可行性。

3　結(jié)　論

本文合成了一種Bodipy染料作為熒光母體識(shí)別生物硫醇(Cys，Hcy，GSH)的新型熒光探針。相對(duì)于其他氨基酸，該探針對(duì)含硫醇的氨基酸顯示出較高的選擇性和專一性。熒光增強(qiáng)主要是由于硫醇進(jìn)攻硝基烯烴的雙鍵，發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，中斷了體系的PET作用。同時(shí)，HeLa細(xì)胞的熒光成像實(shí)驗(yàn)也證明了探針具有檢測(cè)生物體系內(nèi)硫醇的能力。

[1]Shahrokhian S.Anal.Chem.，2001，73(24)：5972-5978.

[2]Han Q，Xu M，Tang L，Sun X，Zhang N，Tan X H，Tan X Y，Tan Y，Hoffman R M.Clin.Chem.，2004，50(7)：1229-1231.

[3]Janaky R，Varga V，Hermann A，Saransaari P，Oja S S.Neurochem.Res.，2000，25(9/10)：1397-1405.

[4]Heafield M T，F(xiàn)earn S，Steventon G B，Waring R H，Williams A C，Sturman S G.Neurosci.Lett.，1990，110(1)：216-220.

[5]Rahman I，MacNee W.FreeRadicalBiol.Med.，2000，28(9)：1405-1420.

[6]Pastore A，F(xiàn)ederici G，Bertini E，Piemonte F.Clin.Chim.Acta，2003，333(1)：19-39.

[7]Townsend D M，Tew K D，Tapiero H.Biomed.Pharmacother.，2003，57(3)：145-155.

[8]Cereser C，Guichard J，Drai J，Bannier E，Garcia I，Boget S，Parvaz P，Revol A.J.Chromatogr.B，2001，752(1)：123-132.

[9]Wlodek P J，Iciek M B，Milkowski A，Smolenski O B.Clin.Chim.Acta，2001，304(1)：9-18.

[10]Qin Y A，Zhang X，Liu S Y，Sun M M.J.Instrum.Anal.(秦元安，張獻(xiàn)，劉叔堯，孫明明.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2015，34(10):1158-1162.

[11]Yuan X Y，Wang T L，Guan T T，Wang J L，Huang H W，Yi S J，Tang C R，Zeng Y L.J.Instrum.Anal.(元曉云，王天倫，關(guān)婷婷，王金龍，黃昊文，易守軍，唐春然，曾云龍.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2015，34(4):463-467.

[12]Zhang Z，Deng C Q，Guo T，Meng L S.J.Instrum.Anal.(張禎，鄧成權(quán)，郭添，孟列素.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2014，33(7):810-814.

[13]Zhao N，Wu Y H，Shi L X，Lin Q P，Chen Z N.DaltonTrans.，2010，39(35)：8288-8295.

[14]Kwon H，Lee K，Kim H J.Chem.Commun.，2011，47(6)：1773-1775.

[15]Screenath K，Yuan Z，Allen J R，Davidson M W，Zhu L.Chem.-Eur.J.，2015，21(2)：867-874.

[16]Long L，Lin W，Chen B，Gao W，Yuan L.Chem.Commun.，2011，47(3)：893-895.

[17]Goswami S，Manna A，Paul S，Das A K，Nandi P K，Maity A K，Saha P.TetrahedronLett.，2014，55(2)：490-494.[18]Zhu L，Yuan Z，Simmons J T，Screenath K.RSCAdv.，2014，4(39)：20398-20440.

[19]Hu M，F(xiàn)an J，Li H，Song K，Wang S，Cheng G，Peng X.Org.Biomol.Chem.，2011，9(4)：980-983.

[20]Karolin J，Johansson L B A，Strandberg L，Ny T.J.Am.Chem.Soc.，1994，116(17)：7801-7806.

[21]Meltola N J，Soini A E，H?nninen P E.J.Fluoresc.，2004，14(2)：129-138.

[22]Sunahara H，Urano Y，Kojima H，Nagano T.J.Am.Chem.Soc.，2007，129(17)：5597-5604.

[23]Madhu S，Gonnade R，Ravikanth M.J.Org.Chem.，2013，78：5056-5060.

Synthesis of a Fluorescent Probe and Its Application in Thiols Determination

CHEN Song*，WANG Jing，HOU Peng，LIU Lei，WANG Xin

(College of Pharmacy，Qiqihar Medical University，Qiqihar161006，China)

A bodipy-based fluorescence probe for thiols was developed with high sensitivity and excellent selectivity at a physiological pH(7.4) value.Its structure was characterized by nuclear magnetic resonance(NMR) and high resolution mass spectrometry(HRMS).This probe was designed based on the mechanism that thiols induced the Michael addition reaction to block photo-induced electron transfer process(PET) in this probe.The addition of thiols(0-1 000 μmol/L) to the solution of probe resulted in a remarkable fluorescence enhancement(150-fold) in the green spectra region.Meanwhile，probe was able to detect relatively low concentrations of thiols and the fluorescence detection limit for common amino acids containing thiols，Cys was determined to be 4.5×10-7mol/L.Additionally，similar results were obtained affording 1.2×10-7mol/L and 2.1×10-7mol/L detection limits for GSH and Hcy，respectively.The probe exhibited high selectivity and sensitivity towards thiols over other amino acids.Most importantly，the probe has been successfully utilized for thiols imaging in living cells，which makes it a good candidate for application in biological systems.

synthesis; application; fluorescence probe; determination; biothiols

2016-01-09；

2016-02-06

齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(SFGG-201416)

陳頌，博士，講師，研究方向：熒光探針的合成與應(yīng)用，Tel：0452-2663881，E-mail：chensongchemistry@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.021

O657.3;O623.81

A

1004-4957(2016)08-1046-04