元素分析-碳同位素比值質(zhì)譜法在純正葡萄汁摻假鑒別中的應(yīng)用

譚夢(mèng)茹，費(fèi)曉慶，吳　斌，沈崇鈺，張　睿，丁　濤，劉　蕓，楊功俊*

(1.中國(guó)藥科大學(xué)　藥學(xué)院，江蘇　南京　211198;2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局　食品實(shí)驗(yàn)室，江蘇　南京　210001)

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元素分析-碳同位素比值質(zhì)譜法在純正葡萄汁摻假鑒別中的應(yīng)用

譚夢(mèng)茹1，費(fèi)曉慶2*，吳斌2，沈崇鈺2，張睿2，丁濤2，劉蕓2，楊功俊1*

(1.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京211198;2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局食品實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210001)

采用元素分析-同位素比值質(zhì)譜法(EA-IRMS)對(duì)純正葡萄汁摻假情況進(jìn)行研究。通過(guò)測(cè)定152個(gè)不同產(chǎn)區(qū)純正葡萄汁的碳同位素比值(δ13C值)，初步建立了純正葡萄汁的同位素?cái)?shù)據(jù)庫(kù)。檢測(cè)結(jié)果表明，純正葡萄汁中糖的δ13C值(δ13CS)范圍為-26.92‰～-24.16‰，而有機(jī)酸的δ13C值(δ13CO)范圍為-27.56‰～-24.99‰。根據(jù)上述兩個(gè)參數(shù)，提出了純正葡萄汁應(yīng)滿足的δ13C值要求：有機(jī)酸和糖的差值(Δδ13CO-S)在-1.63‰～0.72‰范圍內(nèi)。采用該法對(duì)85個(gè)市售葡萄汁進(jìn)行檢測(cè)，檢出31個(gè)摻入碳-4植物糖和有機(jī)酸的陽(yáng)性樣品。糖漿添加實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，該方法可以檢測(cè)8%以上碳-4植物糖的摻假，能有效鑒別葡萄汁的摻假，在葡萄汁的品質(zhì)保證方面有很大的實(shí)際應(yīng)用潛力。

元素分析；同位素比值質(zhì)譜；葡萄汁摻假；碳-4植物糖

葡萄含有很多活性物質(zhì)，具有抗毒殺菌、抗氧化延緩衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化等功效[1-2]。由于葡萄的營(yíng)養(yǎng)功效逐漸得到消費(fèi)者的認(rèn)可，葡萄汁銷售額所占比例逐年加大[3]。與此同時(shí)，一些果汁生產(chǎn)企業(yè)受利益驅(qū)使對(duì)純正葡萄汁進(jìn)行非法添加，果汁中的常見(jiàn)添加物有糖、有機(jī)酸、色素和香精。國(guó)際食品法典委員會(huì)及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于果汁的規(guī)定指出，在果汁中添加任何成分均應(yīng)在標(biāo)簽注明[4-5]。目前關(guān)于果汁摻假的鑒別方法主要有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]、裂解質(zhì)譜法[7]、電子鼻[8]、毛細(xì)管電泳法[9]、光譜法[10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]等。但由于果汁中內(nèi)源性物質(zhì)和外源性添加物質(zhì)在結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)上的相似性，上述方法仍不足以很好地鑒別果汁摻假。

近年來(lái)，穩(wěn)定同位素技術(shù)已發(fā)展成為解決食品摻假及產(chǎn)地溯源問(wèn)題的一個(gè)強(qiáng)有力手段。目前，通過(guò)該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)各種食品的摻假鑒定(蜂王漿、油脂、葡萄酒、調(diào)味品等)以及產(chǎn)地溯源(如果汁、乳制品和蔬菜等)[12-15]。通過(guò)碳-3和碳-4兩種不同植物光合作用代謝途徑所得產(chǎn)物δ13C值的差異，可以鑒別碳-3代謝的純正葡萄汁中是否摻入碳-4代謝產(chǎn)物。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、試劑與材料

Flash 2500型元素分析儀和DELTA V Advantage同位素質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；FD115型恒溫干燥箱(德國(guó)Bingder公司)；5 mm×3.5 mm錫杯(英國(guó)Element Microanalysis公司)；RJ-LDL-50G型低速大容量多管離心機(jī)(無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司)；WH-861型渦旋混合器(太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；JYZ-E6型榨汁機(jī)(九陽(yáng)股份有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

碳同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Beet Sugar(IA-R005，δ13C值-26.03‰，英國(guó)Sercon公司)；丙酮、硫酸、氫氧化鈣、DL-酒石酸(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)；蘋果酸(分析純，上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；L-酒石酸、檸檬酸(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。0.1 mol/L 硫酸溶液：取2.8 mL濃硫酸用水稀釋至500 mL。

152個(gè)葡萄樣品來(lái)自于果園和超市，均產(chǎn)自約北緯20°～北緯50°范圍的主要葡萄產(chǎn)區(qū)，包括新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏、陜西、山西、遼寧等國(guó)內(nèi)產(chǎn)區(qū)以及法國(guó)、意大利、西班牙、智利、美國(guó)等國(guó)外產(chǎn)區(qū)。葡萄種類涵蓋赤霞珠、蛇龍珠、品麗珠、梅鹿輒、神索、百香、佳美、歌海娜、果若、黑品樂(lè)、佳麗釀、彌生、內(nèi)比奧羅、桑嬌維塞、增芳德、巨峰、甬優(yōu)一號(hào)、美人指、夏黑、酔金香等。

85個(gè)市售葡萄汁樣本來(lái)自超市或者果汁生產(chǎn)企業(yè)，標(biāo)簽上均標(biāo)明為100%葡萄汁樣本。糖漿為玉米糖漿和大米糖漿，均來(lái)自國(guó)內(nèi)糖漿生產(chǎn)企業(yè)。

1.2樣品前處理

1)在現(xiàn)階段高速公路風(fēng)險(xiǎn)管理中安全文化尚未完全體現(xiàn)其重要性，仍僅局限于傳統(tǒng)安全教育培訓(xùn). “知行合一”的哲學(xué)觀念要求，風(fēng)險(xiǎn)管理理念與風(fēng)險(xiǎn)管理實(shí)踐要居于同等重要的地位，風(fēng)險(xiǎn)管理的發(fā)展需要先進(jìn)安全文化的支撐.

選取新鮮、飽滿、無(wú)病斑、整粒的葡萄，去皮去籽，放入榨汁機(jī)中榨取純正葡萄汁。樣品前處理過(guò)程部分參考果汁中糖和果肉δ13C值的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[16-17]。

取50 mL葡萄汁樣品，于3 000 r/min離心5 min后取上清液，以除去果汁中的固體果肉成分。上清液中加入2.0 g氫氧化鈣，并在90 ℃水中煮3 min以沉淀有機(jī)酸。再以3 000 r/min離心5 min，所得上清液和沉淀分別用于果汁中δ13CS和δ13CO的測(cè)定。

果汁中δ13CS的測(cè)定：所得上清液用0.1 mol/L 硫酸溶液調(diào)至pH 5.0，于4 ℃過(guò)夜沉淀，用5 μL微量進(jìn)樣器移取1 μL上清液至5 mm×3.5 mm錫杯中，待測(cè)。

果汁中δ13CO的測(cè)定：所得有機(jī)酸沉淀用40 mL水洗3次(以除去殘留糖)，然后用40 mL丙酮洗3次(以除去脂質(zhì))，所得沉淀于75 ℃下恒溫干燥后，稱取約0.1 mg至5 mm×3.5 mm錫杯中，待測(cè)。

每個(gè)樣各組分平行測(cè)定2次，取平均值，絕對(duì)差小于0.30‰。

1.3實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1元素分析儀條件氧化管溫度：950 ℃；還原管溫度：680 ℃；氣相色譜柱溫箱溫度：50 ℃；載氣：高純氦氣，流速：120 mL/min；燃燒氣：高純氧氣，流速：100 mL/min；燃燒時(shí)間：3 s。

1.3.2同位素質(zhì)譜條件離子源：電子轟擊離子化(EI)；氦氣壓力：1.0 bar；參考?xì)舛趸級(jí)毫Γ?.0 bar；離子源電壓：2.97 kV；真空度：1.8×10-6mbar。

2　結(jié)果與討論

樣品的δ13C值由Isodat 3.0軟件直接給出。δ13C值的計(jì)算基于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Vienna peedee belemnite standard(VPDB)[18]，計(jì)算公式為：δ13C=(Rsample-RVPDB)/RVPDB×1 000，其中Rsample為樣品的13C與12C的同位素比值13C/12C，RVPDB=0.011 237 2。

在測(cè)定樣品時(shí)，每間隔10個(gè)樣品需測(cè)定1次碳同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Beet Sugar進(jìn)行系統(tǒng)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，要求所測(cè)得的δ13C值與證書標(biāo)明值相差小于0.30‰。

2.1葡萄汁中糖及有機(jī)酸分離過(guò)程的優(yōu)化

純正葡萄汁的主要成分是糖和有機(jī)酸。由于來(lái)源相同的各個(gè)組分的δ13C值十分接近，所以純正葡萄汁中糖和有機(jī)酸的δ13C值差異較小，而摻入碳-4植物來(lái)源的糖或有機(jī)酸均會(huì)造成二者的δ13C差值增大，使得該參數(shù)超出合理范圍，因此本研究需將糖和有機(jī)酸兩者有效分離來(lái)進(jìn)行測(cè)定。

通過(guò)加入氫氧化鈣與有機(jī)酸反應(yīng)形成沉淀后離心，上清液中為糖，沉淀為有機(jī)酸鈣鹽，從而實(shí)現(xiàn)兩者的分離。氫氧化鈣加入量過(guò)少會(huì)使有機(jī)酸沉淀不完全，進(jìn)而影響糖的δ13C值測(cè)定，而加入量過(guò)多則會(huì)造成試劑浪費(fèi)。因此，本文對(duì)氫氧化鈣的加入量進(jìn)行了優(yōu)化。選取1個(gè)純正葡萄汁樣本，在初步離心除去果肉后的50 mL澄清樣品中加入氫氧化鈣(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g)，分別測(cè)定δ13CS和δ13CO。結(jié)果表明，在不同加入量情況下，δ13CO值的變化很小，其值為-26.34‰～-26.18‰。當(dāng)加入量為1.0 g和1.5 g時(shí)，δ13CS值相對(duì)明顯偏負(fù)(-25.47‰～-25.39‰)，這是由于有機(jī)酸未完全沉淀，上清液中含有δ13C值相對(duì)偏負(fù)的有機(jī)酸，當(dāng)加入量為2.0 ～3.0 g時(shí)，糖的δ13CS值趨于穩(wěn)定(-24.74‰～-24.52‰)，表明有機(jī)酸已完全沉淀。因此實(shí)驗(yàn)選取氫氧化鈣的加入量為2.0 g。

2.2EA-IRMS法測(cè)定純正葡萄汁

采用EA-IRMS法對(duì)152個(gè)純正葡萄汁的δ13CS和δ13CO進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)果如圖1，可以看出純正葡萄汁中δ13CS范圍為-26.92‰～-24.16‰，而δ13CO的范圍為-27.56‰～-24.99‰，兩個(gè)參數(shù)的結(jié)果大致呈正態(tài)分布且表現(xiàn)出典型的碳-3代謝產(chǎn)物特征。計(jì)算得Δδ13CO-S在-1.63‰～0.72‰范圍內(nèi)，而可能摻入的碳-4代謝產(chǎn)物的典型δ13C值一般在-20‰～-9‰范圍內(nèi)，一旦其摻入純正葡萄汁中將會(huì)使Δδ13CO-S超出上述合理范圍。

為了驗(yàn)證方法重現(xiàn)性，選取1個(gè)純正葡萄汁，連續(xù)15 d檢測(cè)該樣本的δ13CS和δ13CO值，計(jì)算所得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.20%和0.21%，可見(jiàn)本方法的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性較好，能滿足葡萄汁中糖和有機(jī)酸δ13C值的檢測(cè)要求。

2.3EA-IRMS法在純正葡萄汁摻假鑒別中的應(yīng)用

2.3.1常見(jiàn)糖漿及糖漿摻假葡萄汁的測(cè)定選取2種常見(jiàn)的糖漿(大米糖漿和玉米糖漿)進(jìn)行摻假鑒別研究，其中大米糖漿為碳-3植物糖，而玉米糖漿為碳-4植物糖。在1個(gè)純正葡萄汁樣本中分別摻入大米糖漿和玉米糖漿，摻入比例均為15%，標(biāo)為摻假葡萄汁1和摻假葡萄汁2。采用EA-IRMS測(cè)定兩個(gè)樣本的δ13CS，δ13CO和Δδ13CO-S，結(jié)果顯示，摻假葡萄汁1的δ13CS相對(duì)于純正葡萄汁偏正，導(dǎo)致Δδ13CO-S為-4.85‰，超出純正葡萄汁的Δδ13CO-S合理范圍(-1.63 ‰～0.72 ‰)。而摻假葡萄汁2的Δδ13CO-S未超出上述范圍，因此，本方法對(duì)于碳-4來(lái)源的糖漿摻假有很好的鑒別能力，而對(duì)于碳-3來(lái)源的糖漿摻假則需進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的有效性，選取1個(gè)純正葡萄汁與1個(gè)玉米糖漿(δ13C=-14.56‰)按照不同的比例混合，分別測(cè)定該樣的δ13CS，δ13CO和Δδ13CO-S值。從圖2可以看出，當(dāng)摻入玉米糖漿比例達(dá)8%時(shí)，計(jì)算得Δδ13CO-S<-1.63‰，即被鑒定為摻入碳-4植物糖。因此當(dāng)摻糖比例不低于8%時(shí)，采用本方法即可被檢出。

2.3.2常見(jiàn)有機(jī)酸及有機(jī)酸摻假葡萄汁的測(cè)定葡萄汁中含量較高的有機(jī)酸包括酒石酸、蘋果酸和檸檬酸，含量分別約為0.3%，0.15%和0.14%[19-21]。選取上述3種有機(jī)酸進(jìn)行研究。首先采用EA-IRMS測(cè)定了L-酒石酸、DL-酒石酸、蘋果酸和檸檬酸的δ13C值，測(cè)定結(jié)果分別為-19.36‰，-27.07‰，-25.6‰和-11.15‰。分別將L-酒石酸、DL-酒石酸、蘋果酸、檸檬酸摻入1個(gè)純正葡萄汁中，摻入比例分別為0.3%,0.3%，0.15%和0.14%，記為自制1～4(Self-made 1～4)。采用EA-IRMS測(cè)定這4個(gè)樣本的δ13CS,δ13CO和Δδ13CO-S，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1自制摻假葡萄汁中糖和有機(jī)酸的δ13C值

Table 1δ13CSandδ13COresults of self-made adulterated grape juice

/‰

從表1可以看出，摻入碳-3來(lái)源的自制2、自制3摻假葡萄汁的Δδ13CO-S未超出-1.63‰～0.72‰限定范圍，而其他2個(gè)自制摻假葡萄汁樣本的Δδ13CO-S均超出限定范圍，被本方法有效鑒別?？梢?jiàn)，本方法對(duì)于碳-4來(lái)源的有機(jī)酸摻假同樣有效，但無(wú)法有效鑒別碳-3來(lái)源的有機(jī)酸摻假。

目前已有研究采用LC/EA-IRMS對(duì)碳-3來(lái)源的糖漿摻假進(jìn)行鑒別[22],本課題組擬用LC/EA-IRMS對(duì)碳-3植物來(lái)源摻假進(jìn)行后續(xù)鑒別研究。

2.3.3市售葡萄汁樣品的測(cè)定根據(jù)上述葡萄汁摻假鑒別新方法，采用EA-IRMS對(duì)市售標(biāo)明100%純葡萄汁樣品的真?zhèn)吻闆r進(jìn)行研究，85個(gè)樣本采自超市或果汁生產(chǎn)企業(yè)。結(jié)果檢測(cè)出陽(yáng)性樣品31個(gè)，陽(yáng)性率達(dá)36.47%。

3　結(jié)　論

本文利用EA-IRMS法初步建立了純正葡萄汁的碳同位素?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，提出了鑒別葡萄汁摻假的新技術(shù)，通過(guò)對(duì)純正葡萄汁的糖、有機(jī)酸的δ13C值進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步分析二者δ13C值的差異，該方法能有效地鑒別出葡萄汁摻入的外源性碳-4植物糖和有機(jī)酸。對(duì)市售葡萄汁樣品進(jìn)行了檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為36.47%，雖然對(duì)碳-3植物糖和有機(jī)酸的摻假檢測(cè)性能有待改善，但新方法在葡萄汁摻假鑒別的靈敏度方面顯示了較大優(yōu)勢(shì)，有較好的應(yīng)用前景。

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Identification of Authentic Grape Juice Adulteration Using Elemental Analysis-Carbon Isotope Ratio Mass Spectrometry

TAN Meng-ru1,FEI Xiao-qing2*,WU Bin2,SHEN Chong-yu2,ZHANG Rui2,DING Tao2,LIU Yun2,YANG Gong-jun1*

(1.College of Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing211198,China;2.Laboratory of Food,Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing210001,China)

A new research for authentic grape juice adulteration identification using elemental analysis-isotope ratio mass spectrometry(EA-IRMS) was developed.The carbon isotope ratio values(δ13C values) for 152 grape samples from different production regions were collected to primarily construct the isotopic database of authentic grape juices.The results indicated that theδ13C values of sugar and organic acid were in the ranges of -26.92‰-24.16‰ and-27.56‰-24.99‰，respectively.Based on the aboveδ13C values collected,theδ13C value limit for the authentic grape juice was proposed:theδ13C difference between organic acid and sugar Δδ13CO-Sshould be from-1.63‰ to 0.72‰.According to the above criteria,among 85 commercial samples,31 samples were confirmed adulterated with C-4 plant sugar or organic acid.According to the syrup addition test,EA-IEMS method could identify over 8%C-4 plant sugar adulteration.The newly developed method represented a significant potential application in the quality assurance of grape juice.

elemental analyzsis;isotope ratio mass spectrometry;grape juice adulteration;C-4 plant sugar

2015-12-10；

2016-02-15

江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015KJ31)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21275162)；“青藍(lán)工程”資助項(xiàng)目

楊功俊，博士，教授，研究方向：現(xiàn)代儀器分析，Tel：025-84589700，E-mail：gjyang@cpu.edu.cn

費(fèi)曉慶，碩士，工程師，研究方向：食品分析與食品摻假鑒別，Tel：025-52345193，E-mail:dii01208@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.018

O657.63;S663.1

A

1004-4957(2016)08-1031-05