濃縮乳清蛋白粉成分熒光光譜分析

趙　挺

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 數(shù)理學(xué)院， 安徽 蚌埠　233030)

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濃縮乳清蛋白粉成分熒光光譜分析

趙挺

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 數(shù)理學(xué)院， 安徽 蚌埠233030)

基于熒光光譜技術(shù)的濃縮乳清蛋白粉成分分析表明，濃縮乳清蛋白粉溶液熒光符合B類蛋白特點，其發(fā)射譜由4個單峰組成，強度最大的3個單峰對應(yīng)的分別是酪氨酸殘基和處于兩種不同環(huán)境下的色氨酸殘基。

濃縮乳清蛋白粉； 熒光光譜； 成分分析

0　引　言

濃縮乳清蛋白粉由牛奶乳清通過澄清、超濾、噴霧干燥等技術(shù)手段制成，其具有突出的生理功能特性和優(yōu)質(zhì)的生物利用價值[1-4]，是生產(chǎn)嬰幼兒配方奶粉、運動營養(yǎng)補劑、中老年營養(yǎng)品等食品的重要原料。原料質(zhì)量與食品安全息息相關(guān)，目前，市場上濃縮乳清蛋白粉多產(chǎn)自國外，導(dǎo)致無法從生產(chǎn)源頭監(jiān)控其質(zhì)量，同時由于市場的大量需求，出現(xiàn)了通過摻假(如加入奶精粉、大豆蛋白粉等)獲取暴利的現(xiàn)象。因此，加強關(guān)于濃縮乳清蛋白粉質(zhì)量檢測方法的研究就顯得十分迫切和必要。而當(dāng)前檢測方法(國標(biāo)GBT11674-2010)大都是化學(xué)方法，繁瑣耗時，而熒光光譜技術(shù)具有快速、靈敏、選擇性高等特點。文中通過origin8.0軟件利用高斯多峰擬合方法，明確了濃縮乳清蛋白粉水溶液發(fā)射譜中重疊熒光峰的位置、強度和寬度，并分析了對應(yīng)熒光團的成分。希望本實驗?zāi)転闈饪s乳清蛋白粉的質(zhì)量檢測提供一定的依據(jù)。

1　實驗過程

1.1樣品制備

前期實驗結(jié)果顯示，不同品牌的濃縮乳清蛋白粉水溶液熒光光譜變化規(guī)律相似，說明成分幾近相同，故采用市場上購買的Glanbia濃縮乳清蛋白粉(美國愛爾蘭哥蘭比亞營養(yǎng)有限公司生產(chǎn))，以實驗室去離子水為溶劑，配制成濃度為1mg/mL的濃縮乳清蛋白粉水溶液。配制完成后，將溶液用滴管移入10mm石英皿中。

1.2儀器及設(shè)定

F-450熒光分光光度計，天津市津維電子儀表有限公司生產(chǎn)。

實驗中設(shè)置激發(fā)波長為278nm；發(fā)射波長掃描范圍為290～490nm；激發(fā)和發(fā)射波長掃描步距皆為1nm；兩者狹縫縫寬均為5nm；掃描速率12 000nm/min。

2　數(shù)據(jù)處理

發(fā)射譜譜線如圖1所示。

圖1　發(fā)射譜譜線

由圖1可以看出，濃度為1mg/mL的濃縮乳清蛋白粉水溶液在激發(fā)光為278nm時的發(fā)射譜，其熒光峰較寬，說明溶液中可能含有不同種類的熒光生色團，為了明確分別與之對應(yīng)的熒光峰的強度和半峰寬，又對發(fā)射譜譜線進行了高斯多峰擬合，如圖2所示。

圖2　高斯多峰擬合

由圖2可以看出，其中深色曲線為高斯多峰擬合曲線，淺色曲線為發(fā)射光譜譜線。

兩者非常符合，發(fā)射譜曲線經(jīng)過高斯多峰擬合以后，被分解成4個高斯函數(shù)，即發(fā)射譜可看成由4個單峰疊加而成，其中每個單峰對應(yīng)參數(shù)見表1。

表1　高斯多峰擬合各單峰參數(shù)

3　實驗結(jié)果分析

3.1濃縮乳清蛋白粉水溶液發(fā)射光譜分析

一般在270～300nm紫外光的激發(fā)下，蛋白質(zhì)會發(fā)出內(nèi)源熒光，而色氨酸﹑酪氨酸﹑苯丙氨酸三者的殘基正是這種熒光的主要來源[5]。比較三者的分子結(jié)構(gòu)如圖3所示。

(a) 色氨酸結(jié)構(gòu)式 (b) 酪氨酸結(jié)構(gòu)式 (c) 苯丙氨酸結(jié)構(gòu)式

圖3芳香族氨基酸結(jié)構(gòu)式

由圖3可以發(fā)現(xiàn)，雖然3種氨基酸都具有苯環(huán)，然而由于酪氨酸多了一個羥基，色氨酸則多了一個吲哚環(huán)，根據(jù)熒光發(fā)射原理，分子的熒光效率會隨著π電子共軛度以及分子平面度增加而增大[6]，故在濃度相同時，三者熒光光強之比為100∶9∶0.5[5]，因此在蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光中，一般很難發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸殘基的熒光，人們看到的蛋白質(zhì)熒光主要來自于另外兩種氨基酸殘基。

在人們研究的大量蛋白質(zhì)中，從結(jié)構(gòu)上來說主要是球蛋白。根據(jù)以上3種殘基的構(gòu)成不同，球蛋白可以分成兩種:一種只含有苯丙氨酸、酪氨酸，不含有色氨酸，被稱為A類蛋白[7]，這種蛋白更多的表現(xiàn)為酪氨酸的熒光特性，比如胰島素、核酸組蛋白、原肌球蛋白等；另一種被稱為B類蛋白，含有以上3種氨基酸殘基[7]，其中的色氨酸與酪氨酸殘基由于發(fā)生能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，造成后者熒光淬滅，前者熒光增強，所以B類蛋白中主要體現(xiàn)的是色氨酸殘基的熒光，當(dāng)所處微環(huán)境極性發(fā)生改變時，色氨酸殘基的熒光峰也會隨之變化，一般變化范圍在325～352nm[8]之間。

乳清蛋白主要由4種蛋白質(zhì)構(gòu)成，分別是牛β-乳球蛋白、牛α-乳白蛋白、牛乳血清白蛋白、免疫球蛋白，他們都屬于球蛋白[9]。前3種蛋白質(zhì)中對應(yīng)芳香族氨基酸殘基的數(shù)目見表2。

表2　3種球蛋白所含芳香族氨基酸殘基數(shù)

免疫球蛋白的分子鏈很長，也同樣存在著3種氨基酸的殘基，因此可以確定，實驗中所研究的蛋白質(zhì)都是B類蛋白。

B類蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基，其熒光特征峰處于313nm[6]，從圖1中可以看到，實驗中得到發(fā)射譜譜峰在336nm處，這說明濃縮乳清蛋白粉溶液熒光符合B類蛋白的特點，其發(fā)出的熒光主要來自于色氨酸殘基。

3.2高斯多峰擬合結(jié)果的分析

高斯多峰擬合的結(jié)果(見圖2)說明，相對于原始發(fā)射譜，高斯多峰擬合的方法能清楚地分辨重疊的熒光峰，并給出了這些熒光峰的準確位置，以及每個單峰的強度和半峰寬的數(shù)值。

3.2.1熒光峰1

游離態(tài)的酪氨酸在水溶液中的熒光峰位于303nm，當(dāng)作為殘基存在于蛋白質(zhì)中時，其熒光特征峰位于313nm[6]，比較兩個數(shù)據(jù)，可推測314nm處的熒光峰1對應(yīng)的是球蛋白中的酪氨酸殘基。這說明在激發(fā)光為278nm時，酪氨酸殘基也得到了激發(fā)，但因為能量轉(zhuǎn)移和熒光效率相對不高等因素[6-7]，造成在濃度相同的情況下，其熒光強度弱于色氨酸殘基(見圖2中熒光峰2、3)，并且其熒光峰完全被峰2所覆蓋，這也直觀地說明了為什么在濃縮乳清蛋白粉水溶液的發(fā)射譜中，觀察不到前者熒光峰。

3.2.2熒光峰2

當(dāng)色氨酸處于游離態(tài)時，其發(fā)射峰在348nm處，而作為殘基存在于蛋白質(zhì)當(dāng)中時，其發(fā)射峰的位置會隨著所處的環(huán)境極性的改變而發(fā)生顯著變化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處溶劑的極性增加時，其熒光峰紅移[9]，因而其熒光峰的位置不是一個固定值，而是在325～352nm范圍內(nèi)有所變動[10],為此人們常常利用色氨酸熒光峰位置來判斷蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象。

Burstezin通過對蛋白質(zhì)水溶液熒光光譜的研究，提出了色氨酸殘基存在的3種基本微環(huán)境[11-12]：

1)當(dāng)色氨酸殘基處于蛋白質(zhì)內(nèi)部非極性區(qū)域時，發(fā)射峰位于330nm到332nm之處；

2)當(dāng)色氨酸殘基處于蛋白質(zhì)表面區(qū)域，并與水溶液的相互接觸受到限制時，其發(fā)射峰處于340nm到342nm之處；

3)當(dāng)色氨酸殘基整體處于水溶液中時，其發(fā)射峰位于350nm到352nm之處。

結(jié)合圖2推斷，圖中329nm處的熒光峰2對應(yīng)的是色氨酸殘基，并且其所處的環(huán)境是位于疏水的非極性區(qū)域，此時色氨酸殘基被包裹在B類蛋白分子的內(nèi)部。

3.2.3熒光峰3

蛋白質(zhì)所處環(huán)境的極性顯著影響色氨酸的熒光峰的位置[9 ]。根據(jù)上面的分析可以看出，在色氨酸殘基所在位置從蛋白質(zhì)分子內(nèi)部向水溶液移動的過程中，隨著極性的增加，其發(fā)射峰持續(xù)紅移，故351nm處的熒光峰3對應(yīng)的也是色氨酸殘基，其所處環(huán)境是極性區(qū)域，即完全暴露水溶液中。綜合以上分析，乳清蛋白粉水溶液中的色氨酸的殘基，一部分處于B類蛋白分子內(nèi)部，一部分處于水溶液當(dāng)中。

3.2.4熒光峰4

382nm處的熒光峰4對應(yīng)的熒光團尚不清楚，可能在濃縮乳清蛋白粉中還含有不明確的成分，需進一步研究。

總結(jié)以上分析結(jié)果可知，相對原始發(fā)射光譜而言，利用高斯多峰擬合方法獲得了更多關(guān)于熒光團的信息，這也為利用高斯多峰擬合方法測定濃縮乳清蛋白粉當(dāng)中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及質(zhì)量檢測提供了一定的參考。

4　結(jié)　語

利用高斯多峰擬合的方法，明確了濃縮乳清蛋白粉水溶液發(fā)射譜中各重疊熒光峰的位置、強度和寬度，并分析了對應(yīng)熒光團的成分。

1)濃縮乳清蛋白粉溶液熒光符合B類蛋白質(zhì)的特點，其發(fā)出的熒光主要來自于其中的色氨酸殘基。

2)濃縮乳清蛋白粉溶液的發(fā)射譜由4個單峰疊加而成，其中強度最大的3個單峰對應(yīng)的分別是酪氨酸殘基和處于兩種不同環(huán)境下的色氨酸殘基，比較三者強度發(fā)現(xiàn)，因為能量轉(zhuǎn)移和熒光效率相對較低等因素，造成在濃縮乳清蛋白粉水溶液發(fā)射譜中難于發(fā)現(xiàn)酪氨酸殘基的熒光峰。

3)峰4對應(yīng)的熒光團尚不清楚，需進一步研究。

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Analysis of condensed whey protein powder based onfluorescencespectroscopy

ZHAO Ting

(Section of Mathematics and Physics Teaching and Research, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China)

AnalysisoftheaqueoussolutionfromcondensedwheyproteinpowderbasedonfluorescencespectroscopyshowthatthefluorescenceofthesolutionisconsistentwiththecharacteristicsofBproteins,inwhichthespectrumisconsistedof4singlepeakswhilethethreemaximumstrengthemissionsarecorrespondenttotryptophanresiduesandtwo-conditionbasedtyrosineresiduesrespectively.

concentratedwheyproteinpowder;fluorescencespectrum;componentanalysis.

2016-05-06

趙挺(1981-)，男，漢族，江蘇無錫人，蚌埠醫(yī)學(xué)院助教，碩士，主要從事光譜分析方向研究,E-mail:guangmingstar@163.com.

10.15923/j.cnki.cn22-1382/t.2016.4.06

O433.1

A

1674-1374(2016)04-0336-06