水華衰亡過程中微囊藻群體膠鞘結構及其元素組成的變化*

施麗梅，蔡元鋒，孔繁翔，于　洋

(中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京 210008)

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水華衰亡過程中微囊藻群體膠鞘結構及其元素組成的變化*

施麗梅，蔡元鋒，孔繁翔**，于洋

(中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京 210008)

維系微囊藻群體結構的膠鞘是微囊藻水華維持優(yōu)勢的重要原因之一. 為了探討微囊藻水華的衰亡機理，在太湖梅梁灣水華衰亡過程中(10月至次年1月)，對微囊藻群體大小的組成做了統(tǒng)計，同時對單位藻細胞的膠鞘多糖產量變化進行了檢測，并對微囊藻群體膠鞘的變化進行了能譜掃描電鏡觀察和元素組成分析. 結果表明，隨著水華的衰亡，100～180 μm的微囊藻小群體的比例表現(xiàn)出增多的趨勢，而大于180 μm的大群體逐漸減少，單位藻細胞的多糖含量呈現(xiàn)下降的趨勢. 掃描電鏡結果顯示了微囊藻群體的膠鞘從完整到逐漸裂解的變化過程，群體表面的能譜化學元素分析顯示，鈉和磷元素的百分含量呈下降的趨勢，鋁和硫元素的百分含量趨于穩(wěn)定，而鈣和硅元素的百分含量呈上升的趨勢. 以上結果說明了微囊藻群體中單位細胞的多糖產量減少,群體膠鞘裂解，元素組成發(fā)生變化，伴隨著微囊藻群體的解聚，出現(xiàn)水華的衰亡.

微囊藻；膠鞘；掃描電子顯微鏡/X射線能譜儀；水華

微囊藻(Microcystisspp.)是一個在全世界廣泛分布，在富營養(yǎng)化的水體中頻繁發(fā)生水華的藍藻種類[1]. 在野外條件下，微囊藻大都以群體形式存在. 微囊藻群體主要是以微囊藻分泌的胞外多糖為主要成分的膠鞘圍繞在藻細胞周圍形成[2]. 研究表明相比單細胞狀態(tài)的微囊藻,群體微囊藻更能耐受低溫、黑暗等條件[3]，并且可以抵御浮游動物的捕食[4-5]. 微囊藻群體膠鞘能夠吸收生長所必需的金屬元素[6]，在微囊藻的漂浮以及群體結構的維持中起到重要的作用[7]. 除此之外，膠鞘對微囊藻群體的形態(tài)和大小有著重要的影響，而藻細胞表面的多糖在藻細胞聚合形成群體中發(fā)揮著重要作用[8-10].

微囊藻水華在一年中經過衰亡休眠、復蘇、生物量增加和上浮積聚4個階段[11]，其中在秋、冬季節(jié)，微囊藻水華進入衰亡階段，除了小部分微囊藻群體仍然停留在水柱或者下沉到底泥中越冬，成為來年春季復蘇的主力軍[12]，大部分微囊藻群體消失[13]. 膠鞘多糖是微囊藻在湖泊浮游植物中占據(jù)優(yōu)勢的主要原因之一. 水華衰亡期間，隨著溫度的逐漸下降，微囊藻群體膠鞘多糖的分泌可能會受到影響. 已有相關研究表明，多糖的合成受到環(huán)境條件的影響[14-17]. 然而，關于微囊藻水華衰亡過程中膠鞘的變化目前研究仍然較少.

為了揭示對維持微囊藻群體優(yōu)勢起關鍵作用的膠鞘在水華衰亡過程中的變化，本研究探討了太湖梅梁灣水華衰亡過程中的微囊藻群體大小以及單位藻細胞多糖的變化，并采用能譜掃描電鏡(SEM-EDS)方法研究了微囊藻群體膠鞘和元素組成的變化.

1 材料與方法

1.1 微囊藻群體大小組成和單位細胞膠鞘多糖含量的變化

1.1.1 樣品的采集和不同大小群體藻細胞數(shù)分析在微囊藻水華衰亡期間(10月至次年1月)，在太湖梅梁灣用25#浮游生物網收集微囊藻群體，依次用180、100和50 μm尼龍篩絹過濾后，采用超聲波破碎儀，在30～40 W工作功率下，超聲1 min，將群體打散[18]，采用血球計數(shù)板計數(shù)每部分的細胞個數(shù)，用來計算組成不同大小群體的細胞數(shù)的比例.

1.1.2 苯酚硫酸法分析單位細胞膠鞘多糖含量的變化采用苯酚硫酸法分析微囊藻群體膠鞘多糖[19]. 具體方法是收集一定體積湖水中的微囊藻群體，浸泡在終濃度為3%的戊二醛中，在4℃進行多糖提取[20]. 以6000 轉/min離心10 min收集上清液，采用3500道爾頓透析膜透析后用于微囊藻群體胞外多糖濃度的測定. 藻群體沉淀重新懸浮于相同體積的GF/C膜濾過的湖水中，采用1.1.1節(jié)中所述的方法打散藻群體計數(shù)藻細胞.

葡萄糖標準曲線的繪制及樣品多糖濃度的測定. 準確稱取干燥至恒重的無水葡萄糖20 mg于500 ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6 、0. 8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8 ml，用水補至2.0 ml，然后加入 5%苯酚1 ml 搖勻，接著垂直加入濃硫酸5.0 ml，使?jié)饬蛩嵫杆贈_下去的同時起到混勻的效果，室溫放置20 min后搖勻，在490 nm處測光密度，2.0 ml水按同樣的顯色操作為空白對照，橫坐標為多糖濃度(μg/ml)，縱坐標為光密度值，得到標準曲線. 取樣品液1.0 ml，按以上操作步驟測定光密度值，根據(jù)標準曲線公式計算對應多糖濃度(mg/L). 將多糖濃度除以細胞總數(shù)可得單位藻細胞的多糖含量.

1.2 微囊藻群體膠鞘的顯微分析

1.2.1 阿利新蘭(Alcian blue)染色用蒸餾水配制1%的阿利新蘭染液，用稀鹽酸分別調節(jié)pH值到2.5和0.5，在這兩種pH值下該染料分別能選擇性結合酸性多糖和硫酸多糖而使多糖呈現(xiàn)藍色[21]，以此證明兩種多糖的存在. 同時經過染色，原本無色透明的膠鞘將變得清晰可辨. 吸取兩種pH值下該染料各1.0 ml加入1.5 ml離心管中，加入少量微囊藻群體，染色30 min后，用蒸餾水沖洗微囊藻群體，直接于光學顯微鏡下觀察并拍照.

1.2.2 能譜掃描電鏡(SEM-EDS)分析微囊藻群體在2.5%的戊二醛溶液中固定保存直到掃描電鏡樣品的制作. 樣品的前處理過程如下：首先用0.01 mol/L的磷酸緩沖液將微囊藻群體洗3次，以去除戊二醛. 然后依次用不同濃度(30%、50%、70%、80%、90%、100%，v/v)的乙醇溶液進行梯度脫水，最后在空氣中風干. 樣品在噴鍍金膜后，在掃描電鏡(JSM-5610LV/Vantage Ⅳ)下，對樣品中隨機選定的微囊藻群體進行形貌特征觀察并拍照，同時，利用與掃描電鏡相偶聯(lián)的X射線能譜儀(實驗所用電壓為15 kV)進行微囊藻群體表面元素組成分析，通過獲取二次電子圖像得到主要組成元素的相對重量百分比.

2 結果與分析

2.1 微囊藻群體大小組成與微囊藻單位細胞膠鞘多糖含量分析

隨著水華的衰亡，大于180 μm的微囊藻群體趨于減少，50～100 μm的群體在總群體中所占的比例變化不大，而100～180 μm的群體顯示出增加的趨勢(圖1). 微囊藻群體中大于180 μm的比例在11月上旬之前出現(xiàn)增加趨勢，可能是群體體積較小的惠氏微囊藻(M.wesenbergii)的比例逐漸減少，而群體體積較大的銅綠微囊藻(M.aeruginosa)比例增多，導致總體上大群體的增多；11月上旬之后，大于180 μm的比例逐漸減少，有兩個方面的原因：一方面是由于存在不同形態(tài)的微囊藻的演替，如從銅綠微囊藻向水華微囊藻(M.flos-aquae)的演替，一般銅綠微囊藻群體平均大小大于水華微囊藻群體；另一方面是由于大群體裂解成為小的群體.

葡萄糖的標準曲線為：y=0.007x-0.016，R2=0.99，據(jù)此公式得出：在微囊藻水華衰亡過程中的微囊藻群體中，單位細胞產生的胞外多糖含量總體呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，從8.9±0.6 pg/cell 增加到25.8±1.8 pg/cell，然后下降到3.4±0.3 pg/cell(圖 2). 在11月上旬之前，多糖含量的增加與大于180 μm的藻群體的增加一致，可能與微囊藻不同種類的演替有關，而在11月之后，單位細胞產生的胞外多糖含量的下降，與多糖合成受到環(huán)境因素如溫度、光照以及不同微囊藻種屬的影響有關[22]. 值得注意的是本文針對的是微囊藻群體的附著多糖，即微囊藻群體膠鞘中的主要組分，在微囊藻形成群體上發(fā)揮著重要作用[10]. 多糖產量減少會影響群體大小[23]，引起膠鞘發(fā)生變化.

圖1 水華衰亡過程中微囊藻群體大小組成變化Fig.1 Changes in size fractionated Microcystis colonies during the bloom decline period

圖2 水華衰亡過程中單位微囊藻細胞多糖含量的變化Fig.2 Changes in polysaccharide content of Microcystis colonies during the bloom decline period

圖3 微囊藻群體的阿利新蘭染色結果：(A) pH值為0.5時所染色的微囊藻群體；(B) pH值為2.5時所染色的微囊藻群體；(C)正在裂解的微囊藻群體(pH值為2.5)；(D)破碎的微囊藻群體(pH值為2.5)Fig.3 Microcystis colonies stained with alcian blue: (A) colony stained at pH 0.5; (B) colony stained at pH 0.5; (C) being cracked colony stained at pH 2.5; (D) broken colony stained at pH 2.5

2.2 微囊藻群體的阿利新蘭染色

微囊藻群體經過阿利新蘭染色，膠鞘結構明顯，圍繞在微囊藻細胞周圍，pH值為 0.5(圖 3A)和2.5(圖 3B)都可將微囊藻群體染色，顯示群體中含有酸性多糖和硫酸多糖，這與以往報道的結果相似[19,24-25]. 在正在裂解和已經破碎的微囊藻群體中(圖 3C、D)，可以看到微囊藻群體膠鞘的開裂，破碎的藻群體中含較少細胞的膠鞘碎片，說明了微囊藻群體的裂解以及藻細胞的脫落.

2.3 水華衰亡過程中微囊藻膠鞘結構以及元素組成變化

掃描電鏡分析結果顯示，不同時間的微囊藻群體膠鞘形態(tài)明顯不同. 在10月、11月8日和11月15日采集的微囊藻群體具有較完整的膠鞘結構，細胞結合緊密，并包裹在膠鞘中(圖4A、B、C、D)，說明此時的微囊藻群體還沒有開始衰亡. 而在后面的幾個時期即11月25日、12月以及1月所采集的微囊藻群體，膠鞘結構趨于破碎，質地變硬，膠鞘出現(xiàn)裂解，膠鞘內的細胞外翻，細胞分散地裸露在膠鞘的表面(圖4E、F、G、H)，一些藻細胞從群體中脫落出去，表現(xiàn)為采回來的微囊藻群體很容易解散. 這說明隨著水華的衰亡，維持微囊藻群體結構的膠鞘逐漸老化，藻細胞脫落，使得部分微囊藻不能維持群體的狀態(tài)，從而被浮游動物捕食，或者因為沒有膠鞘的保護而無法耐受低溫環(huán)境而死亡，因為單細胞的微囊藻對低溫和黑暗的耐受都低于群體狀態(tài)的微囊藻[3]，從而導致微囊藻水華的衰亡.

圖4 水華衰亡過程中微囊藻群體膠鞘的掃描電鏡照片：A、B、C、D、E、F、G和H分別是 10月13日、10月26日、11月8日、11月15日、11月25日、12月6日、12月21日和1月9日所 采集的微囊藻群體(圖中的電鏡掃描照片代表該時期大部分微囊藻的群體狀態(tài))Fig.4 Scanning electron micrographs of Microcystis colonies during the bloom decline period: A, B, C, D, E, F, G and H showed samples on 13 October, 26 October, 8 November, 15 November, 25 November, 6 December, 21 December and 9 January, respectively

元素組分分析結果顯示(圖5)，除了高含量的碳和氧元素(兩者含量相對穩(wěn)定，在主要組成元素中分別占60%和30%左右，圖5A)，以及部分群體中有含量較低的鉀(K)、鎂(Mg)、鐵(Fe)以及氯(Cl)元素(圖5D)之外，主要的元素有鈣(Ca)、硅(Si)、鈉(Na)、鋁(Al)、磷(P)和硫(S)(圖5B、C)，其中含量最高的是Na、P、Ca和Si元素，這幾種元素的相對重量百分比在水華衰亡過程的微囊藻群體中發(fā)生了變化. 其中Ca和Si元素在幾個主要的元素組分中的比例呈增加趨勢，Na和P元素所占的比例則呈現(xiàn)波動下降的趨勢，Al和S元素則圍繞初始值上下浮動.

微囊藻的膠鞘具有吸附微量元素的作用，能夠供給藻細胞生長必須的元素[26]. 膠鞘的吸附功能實際上是源于其主要組分多糖對于金屬元素的吸附，吸附的機理包含絡合、離子交換和表面沉降等，吸附能力與環(huán)境溫度，pH值，離子強度、形態(tài)和種類有關，但主要還是取決于多糖本身結構和功能基團如羧基、羥基、磷酸基等[27]. 因此，膠鞘表面元素含量的變化在一定程度上反映了膠鞘多糖對元素吸附功能的變化. 因而對于了解微囊藻群體所處的狀態(tài)有重要的參考作用. 在所檢測到的主要元素中，碳和氧含量很高，說明了所檢測的顆粒物質來自于膠鞘，而非非生物雜質顆粒. 除此之外，含量比較高的元素有Na、P、Ca和Si. 其中Na、P元素是藻生長必需的元素之一，能夠影響藻的大多數(shù)代謝活動，尤其是光合作用[2829]. Si元素存在于微囊藻群體中已有相關報道[30]，但是其作用機制并不清晰. 微囊藻膠鞘多糖中所含有的酸性多糖能夠高效地螯合金屬離子，尤其是Ca離子[31]，而Ca的濃度會影響到微囊藻多糖產量和群體大小[32]. 也有研究報道藍藻表面含有較高含量的Ca和Si元素，可以導致藍藻的鈣化和硅化[33-34]. 我們推測在溫度逐漸降低的過程中，微囊藻細胞產生胞外多糖含量減少，而膠鞘吸附的鈣和硅元素相對增多，伴隨著膠鞘的質地變硬、變脆、易于裂解，從而導致了水華的衰亡.

圖5 微囊藻群體膠鞘主要元素組成Fig.5 Elements composition in sheath of Microcystis colonies determined by SEM-EDS

3 結論

在富營養(yǎng)化水體中，每年秋、冬季節(jié)微囊藻水華開始衰亡，然而衰亡的機制并不清楚. 微囊藻維持優(yōu)勢的一個重要原因是其具有膠鞘，形成群體. 因此，本文對太湖梅梁灣微囊藻水華衰亡過程中微囊藻群體的膠鞘結構變化進行了分析. 結果表明：隨著藍藻水華的衰亡，大于180 μm的微囊藻群體趨于減少，而100～180 μm的群體顯示出增加的趨勢；單位細胞產生的胞外多糖含量呈下降的趨勢；膠鞘結構趨于破碎，質地變硬，膠鞘出現(xiàn)裂解，膠鞘內的細胞外翻，一些藻細胞從群體中脫落出去，表現(xiàn)為采回來的微囊藻群體很容易解散. 膠鞘中的Na和P元素所占的比例則呈現(xiàn)波動下降，Ca和Si元素的比例呈增加的趨勢.

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Changes in structure and element composition of mucilage sheath of Microcystis colony during the bloom decline period

SHI Limei, CAI Yuanfeng, KONG Fanxiang**& YU Yang

(StateKeyLaboratoryofLakeScienceandEnvironment,NanjingInstituteofGeographyandLimnology,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,P.R.China)

Mucilage sheath is critical for maintaining predominance of colonialMicrocystisin eutrophic freshwaters. To explore mechanism underlying the decline ofMicrocystisbloom, colony size, polysaccharide content and sheath structure ofMicrocystiscolonies were investigated from October to January when the bloom decline. The results indicated that the proportion ofMicrocystiswith colony size larger than 180 μm decreased, while colonies in the 100-180 μm size range increased. Polysaccharide content per cell decreased during the decline period. The scanning electron micrograph showed that sheath structure ofMicrocystis colonies changed from complete to broken. Element analysis of the surface ofMicrocystiscolonies showed the percentages of Na and P decreased gradually, Al and S fluctuated, while Ca and Si increased. These results indicated that changes in polysaccharide content and element composition of colony sheath accompanied with colonialMicrocystisdisaggregation, and thus led to bloom decline.

Microcystis; sheath; scan electric microscope/X-ray energy spectrometer; water bloom

*國家自然科學基金項目(31370509)、江蘇省自然科學基金項目(BK20131466)和中國博士后基金面上項目(20090461147)聯(lián)合資助．2015-11-20收稿；2016-01-21收修改稿. 施麗梅(1983～)，女，助理研究員；E-mail：lmshi@niglas.ac.cn.

**通信作者；E-mail：fxkong@niglas.ac.cn.