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    浮游植物葉綠素a的微波法研究及其與反復(fù)凍融法的比較*

    2016-10-12 01:37:55林羅敏唐鵲輝韋桂峰林叔忠李湘姣楊浩文
    湖泊科學(xué) 2016年5期
    關(guān)鍵詞:小球藻微囊濾膜

    林羅敏,唐鵲輝,彭 亮,韋桂峰,林叔忠,李湘姣,楊浩文

    (1:暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系,熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心,廣州 510632) (2:廣東省水文局,廣州 510150)

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    浮游植物葉綠素a的微波法研究及其與反復(fù)凍融法的比較*

    林羅敏1,唐鵲輝1,彭亮1,韋桂峰1**,林叔忠2,李湘姣2,楊浩文2

    (1:暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系,熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心,廣州 510632) (2:廣東省水文局,廣州 510150)

    為縮短樣品處理時(shí)間和提高測(cè)定準(zhǔn)確度,本文設(shè)計(jì)和優(yōu)化了微波處理輔助提取浮游植物葉綠素a的方法,并比較了反復(fù)凍融法和微波法對(duì)浮游植物葉綠素a的提取效率. 結(jié)果表明:(1)微波法提取葉綠素a的最優(yōu)處理?xiàng)l件為:高火(額定輸出功率800W)處理60s左右. 過(guò)濾水量為:貧營(yíng)養(yǎng)型水體為1000ml以上,中、富營(yíng)養(yǎng)水體為100~500ml. (2)反復(fù)凍融法在測(cè)定貧營(yíng)養(yǎng)型水體時(shí)更穩(wěn)定,而微波法對(duì)中、富營(yíng)養(yǎng)水樣提取率顯著高于凍融法,可提高7%~12%,對(duì)具膠被及硅質(zhì)外殼的藻類(lèi)提取效率極顯著高于凍融法,測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差更小,且提取時(shí)間較凍融法縮短一半以上,適用于富營(yíng)養(yǎng)化水體的應(yīng)急監(jiān)測(cè).

    微波法;反復(fù)凍融法;提??;浮游植物;葉綠素a

    葉綠素a是表征藻類(lèi)現(xiàn)存量的一個(gè)重要指標(biāo)[1],可在一定程度上反映水體初級(jí)生產(chǎn)力和浮游植物生物量[2],是水體富營(yíng)養(yǎng)化評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)和水華預(yù)警的重要依據(jù)[3]. 因此,葉綠素a濃度的準(zhǔn)確測(cè)定是水體富營(yíng)養(yǎng)化研究和水質(zhì)評(píng)價(jià)的重要基礎(chǔ)[1]. 在葉綠素a的測(cè)定過(guò)程中,較高的提取率是保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的前提. 目前常用的提取方法是利用反復(fù)凍融細(xì)胞破碎藻類(lèi)細(xì)胞,再用丙酮或乙醇等有機(jī)溶劑浸提細(xì)胞溶出物中的葉綠素[4-7],該方法凍融操作簡(jiǎn)單,與有毒溶劑接觸時(shí)間短[7-8],但耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng),且可能對(duì)具膠被或硅質(zhì)殼藻細(xì)胞的破碎能力較弱.

    自1986年開(kāi)始利用微波技術(shù)從羽扇豆中提取鷹爪豆生物堿以來(lái)[9],微波輔助技術(shù)(microwave-assistedextraction,MAE)在色素的提取工藝中被廣泛應(yīng)用[10-12]. 微波法通過(guò)升溫汽化胞內(nèi)液體,使細(xì)胞膨脹破裂,內(nèi)容物自由流出,因此萃取率較高[13]. 但此方法對(duì)浮游植物細(xì)胞尤其是具膠被或硅質(zhì)殼藻細(xì)胞是否具有較強(qiáng)的破碎能力和較高的葉綠素提取效果還有待驗(yàn)證. 為縮短樣品處理時(shí)間和提高測(cè)定的準(zhǔn)確度,本文設(shè)計(jì)并優(yōu)化了微波法提取浮游植物葉綠素a的處理?xiàng)l件,比較了優(yōu)化后的微波法和反復(fù)凍融法(Freezing-thawing,FT)對(duì)葉綠素a的提取率及兩種方法的穩(wěn)定性,提出適合不同營(yíng)養(yǎng)水平水體葉綠素a的測(cè)定方法.

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    純?cè)逡簶悠罚簩?shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和顆粒直鏈藻(Melosira granulata).

    野外樣品:湖泊(暨南大學(xué)南湖S1 、明湖S2)、河流(流溪河石海橋S3、珠江獵德大橋S4)、水庫(kù)(流溪河水庫(kù)S5、南屏水庫(kù)S6),其中S1、S3、S5葉綠素濃度較低,S2、S4、S6葉綠素濃度較高.

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括微波處理?xiàng)l件優(yōu)化及其與反復(fù)凍融法提取葉綠素效果比較兩部分,具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1. 1.2.1 微波法操作步驟及實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化用醋酸纖維濾膜(0.45μm)過(guò)濾一定量的水樣,再將濾膜折疊為1/4后,置于對(duì)折的定性濾紙中遮光并吸去濾膜背面水分. 將濾膜連同定性濾紙和裝有小半杯水的燒杯(防止微波爐空燒)放入微波爐(型號(hào):P80D23N2L-A9(R0),額定輸出功率800W)中,在高火(額定輸出功率100%輸出,即800W功率輸出[14])條件下進(jìn)行微波破壁處理.

    破壁處理后將濾膜取出放入盛有10ml90%丙酮溶液的離心管中,用快速混勻器/手搖震蕩1min后放于4℃冰箱浸提8h以上,再經(jīng)過(guò)7000轉(zhuǎn)/min離心15min后,用HitachiU-3900紫外分光光度計(jì)于630、645、663和750nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光值后計(jì)算得出葉綠素a濃度[15].

    根據(jù)葉綠素a的測(cè)定結(jié)果,確定微波法中最優(yōu)的微波處理時(shí)長(zhǎng)和過(guò)濾水量. 1.2.2 比較微波法和反復(fù)凍融法提取效果分別用微波法和反復(fù)凍融法(-20℃冷凍20min,取出室溫融解5~10min,反復(fù)凍融5次,90%丙酮4℃浸提20h)[8]提取純?cè)逡?銅綠微囊藻、蛋白核小球藻和顆粒直鏈藻)以及野外水樣(S1、S2、S3、S4、S5和S6)的葉綠素a濃度. 微波法和反復(fù)凍融法樣品統(tǒng)一批次、濃度及過(guò)濾水量等條件,保證結(jié)果的可比性;所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置5組平行,保證重復(fù)性.

    表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)*Tab.1 Experimental design

    *Mic.:銅綠微囊藻;Chl.:蛋白核小球藻;Mel.:顆粒直鏈藻.

    1.3 數(shù)據(jù)分析與繪圖

    利用SPSS20.0進(jìn)行單因素方差分析;用Origin8.0軟件完成繪圖.

    圖1 不同微波處理時(shí)間對(duì)野外水樣(S1) 葉綠素a濃度測(cè)定結(jié)果的影響Fig.1 Effect of microwave treatment time on determination of chlorophyll-a concentration from field water samples

    2 結(jié)果與討論

    2.1微波法的處理?xiàng)l件篩選

    2.1.1 微波處理時(shí)間對(duì)葉綠素提取效果的影響微波法主要通過(guò)微波破壁產(chǎn)生裂縫和空隙[11-12],有助于有機(jī)溶劑丙酮有效地溶出葉綠素. 微波處理時(shí)長(zhǎng)直接影響提取效果. 對(duì)于野外水體(S1),微波處理60s后的葉綠素a濃度的測(cè)定結(jié)果顯著高于處理30s后的測(cè)定結(jié)果(P<0.05),且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小(圖1). 但隨著處理時(shí)間的增加,葉綠素a濃度的測(cè)定結(jié)果并未顯著升高,當(dāng)處理時(shí)間達(dá)150s時(shí),微波可能破壞了藻細(xì)胞體內(nèi)的葉綠素a結(jié)構(gòu)[15],導(dǎo)致測(cè)定的葉綠素a濃度顯著下降(P<0.05). 對(duì)于室內(nèi)培養(yǎng)的不同濃度的微囊藻藻液和小球藻藻液,微波處理時(shí)間超過(guò)60s時(shí),葉綠素a濃度的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖2). 因此,最適的微波破壁處理時(shí)長(zhǎng)為60s左右.

    圖2 不同微波處理時(shí)間對(duì)室內(nèi)培養(yǎng)藻液葉綠素a濃度的影響(a:銅綠微囊藻; b:蛋白核小球藻)Fig.2 Effect of microwave irradiation time on determination of chlorophyll-a concentration from cultured samples (a: Microcystis aeruginosa; b: Chlorella pyrenoidosa)

    2.1.2 過(guò)濾水量對(duì)微波法提取效果的影響過(guò)濾水量為50ml時(shí),S2水樣的葉綠素a提取效果較差,可能是由于此時(shí)濾膜上葉綠素過(guò)少,濃度低于檢測(cè)限,導(dǎo)致測(cè)量值偏低(圖3). 當(dāng)過(guò)濾水量增加到100、500ml時(shí),提取效果顯著提高(P<0.05),但當(dāng)過(guò)濾水量為1000ml時(shí),葉綠素a濃度測(cè)定值略降低(圖3),這可能與過(guò)濾時(shí)間較長(zhǎng),葉綠素部分分解有關(guān)[16],也可能與泥沙等雜質(zhì)增多,干擾測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性有關(guān). 因此,以葉綠素a濃度為15μg/L左右的富營(yíng)養(yǎng)水樣為例,微波法提取葉綠素a的最適過(guò)濾水量為100~500ml. 隨著葉綠素a濃度的升高或降低,應(yīng)相應(yīng)調(diào)整過(guò)濾水量:貧營(yíng)養(yǎng)型水體為1000ml;中、富營(yíng)養(yǎng)水體為100~500ml.

    圖3 微波法對(duì)不同體積野外水樣(S2) 葉綠素a濃度的測(cè)定結(jié)果Fig.3 The determination of chlorophyll-a concentration in field samples with different volumes by MAE

    2.2 微波法和反復(fù)凍融法對(duì)葉綠素a提取效果的比較

    對(duì)于室內(nèi)培養(yǎng)的微囊藻藻液,微波法和反復(fù)凍融法對(duì)葉綠素a的提取效果無(wú)顯著差異(圖4a),這可能與微囊藻細(xì)胞體積小、細(xì)胞壁薄[8]有關(guān);對(duì)于室內(nèi)培養(yǎng)的小球藻和直鏈藻藻液,微波法提取效果顯著高于反復(fù)凍融法(P<0.05),這可能是因?yàn)槲⒉ㄝ椛渚鶆?,選擇性強(qiáng)[13],對(duì)具細(xì)胞個(gè)體膠被的小球藻和具硅質(zhì)外殼的直鏈藻細(xì)胞壁的破碎效果較好. 而反復(fù)凍融法通過(guò)冷凍使細(xì)胞內(nèi)形成冰粒和細(xì)胞液濃度增高引起溶脹[17],依賴(lài)多次反復(fù)冷凍及室溫解凍,受環(huán)境因素影響較大,破壁效果較差.

    用微波法和反復(fù)凍融法分別測(cè)定以藍(lán)、綠藻占優(yōu)勢(shì)的湖泊和水庫(kù)水樣以及以硅藻占優(yōu)勢(shì)的河流水樣中的葉綠素a濃度. 當(dāng)葉綠素a濃度較低時(shí)(S1、S3和S5),兩種方法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異;當(dāng)葉綠素濃度較高(S2、S4和S6)時(shí),微波法的測(cè)定結(jié)果顯著高于反復(fù)凍融法(P<0.05),且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小,此時(shí)微波法的提取效果更好(圖4b).

    3 結(jié)論

    1)微波法提取葉綠素a的最優(yōu)處理?xiàng)l件為:高火(額定輸出功率800W)60s左右. 最佳過(guò)濾水量為:貧營(yíng)養(yǎng)型水體為1000ml;中、富營(yíng)養(yǎng)水體為100~500ml.

    2)微波法提取對(duì)具有膠被和硅質(zhì)外殼的藻類(lèi)提取效率優(yōu)于凍融法,且誤差更小.

    圖4 微波法和反復(fù)凍融法對(duì)室內(nèi)培養(yǎng)藻液(a)和野外水樣(b)葉綠素a濃度測(cè)定結(jié)果的比較Fig.4 Comparison of determination of chlorophyll-a concentration in cultured samples(a) and in field samples(b) by MAE and FT

    3)兩種方法在操作上均較簡(jiǎn)單易行. 反復(fù)凍融法在測(cè)定貧營(yíng)養(yǎng)水體葉綠素a濃度上具有一定的優(yōu)勢(shì)(采用反復(fù)凍融法建議貧營(yíng)養(yǎng)水體過(guò)濾水量為500~1000ml[8]),但當(dāng)葉綠素a濃度較高時(shí),微波法提取率顯著高于反復(fù)凍融法,測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差較小,且提取時(shí)間較凍融法縮短一半以上,適用于富營(yíng)養(yǎng)化水體的應(yīng)急監(jiān)測(cè).

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    Microwave-assisted method for extracting chlorophyll-a in phytoplankton and its comparison with freezing-thawing extraction method

    LIN Luomin1, TANG Quehui1, PENG Liang1, WEI Guifeng1**, LIN Shuzhong2, LI Xiangjiao2& YANG Haowen2

    (1: Engineering Research Center of Tropical and Subtropical Aquatic Ecological Engineering Ministry of Education, Department of Ecology, Jinan University, Guangzhou 510632, P.R.China) (2: Hydrological Bureau of Guangdong Province, Guangzhou 510150, P.R.China)

    Inordertosavetimeofsampleprocessingandtoimprovethedeterminingaccuracy,amicrowave-assistedextractionmethodwasdesignedandoptimizedtoextractchlorophyll-ainphytoplankton,andwascomparedtothefreezing-thawingmethodforextractionefficiencyofchlorophyll-a.Theresultsshowedthatmicrowave-assistedextractionmethodwasoptimalin60streatmentwithoutputpowerof800W,andtheappropriatewatervolumeforfiltrationwasabout100-500mlforsamplescollectedinmeso-eutrophicwaterbodiesand1000mlforthosefromoligotrophicwaterbodies.Thechlorophyllextractionrateofmicrowave-assistedextractionmethodwassignificantlyhigherthanthatoffreezing-thawingmethodinmeso-eutrophicwaterbodies,whichcanincreasedby7%-12%,whilefreezing-thawingmethodwasmorestableinmeasuringchlorophyll-aofoligotrophicwaterbodies.Forthosealgaewithaglueshellorsiliceousshell,microwave-assistedextractionmethodhadahigherefficiencyforchlorophyll-aextractionandalowerrelativestandarddeviationthanthefreeze-thawmethod.Themicrowave-assistedextractionmethodneedsonlyonehalfoperationtimeofthefreezing-thawingextractionmethod,sothatitismoresuitableforemergencymonitoringofeutrophicwaterbodies,whilethefreezing-thawingextractionmethodismoresuitableformonitoringoligotrophicwaterbodies.

    Microwave-assistedextractionmethod;freezing-thawingmethod;extraction;phytoplankton;chlorophyll-a

    *廣東省水利科技創(chuàng)新項(xiàng)目“廣東省河流水生態(tài)健康評(píng)價(jià)指標(biāo)體系及評(píng)價(jià)方法研究”(2014-01)資助.2015-10-23收稿;2015-12-16收修改稿. 林羅敏(1990~),女,碩士研究生;E-mail:linluomin@126.com.

    **通信作者;E-mail:tweigf@jnu.edu.cn.

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