• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    浮游植物葉綠素a的微波法研究及其與反復(fù)凍融法的比較*

    2016-10-12 01:37:55林羅敏唐鵲輝韋桂峰林叔忠李湘姣楊浩文
    湖泊科學(xué) 2016年5期
    關(guān)鍵詞:小球藻微囊濾膜

    林羅敏,唐鵲輝,彭 亮,韋桂峰,林叔忠,李湘姣,楊浩文

    (1:暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系,熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心,廣州 510632) (2:廣東省水文局,廣州 510150)

    ?

    浮游植物葉綠素a的微波法研究及其與反復(fù)凍融法的比較*

    林羅敏1,唐鵲輝1,彭亮1,韋桂峰1**,林叔忠2,李湘姣2,楊浩文2

    (1:暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系,熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心,廣州 510632) (2:廣東省水文局,廣州 510150)

    為縮短樣品處理時(shí)間和提高測(cè)定準(zhǔn)確度,本文設(shè)計(jì)和優(yōu)化了微波處理輔助提取浮游植物葉綠素a的方法,并比較了反復(fù)凍融法和微波法對(duì)浮游植物葉綠素a的提取效率. 結(jié)果表明:(1)微波法提取葉綠素a的最優(yōu)處理?xiàng)l件為:高火(額定輸出功率800W)處理60s左右. 過(guò)濾水量為:貧營(yíng)養(yǎng)型水體為1000ml以上,中、富營(yíng)養(yǎng)水體為100~500ml. (2)反復(fù)凍融法在測(cè)定貧營(yíng)養(yǎng)型水體時(shí)更穩(wěn)定,而微波法對(duì)中、富營(yíng)養(yǎng)水樣提取率顯著高于凍融法,可提高7%~12%,對(duì)具膠被及硅質(zhì)外殼的藻類(lèi)提取效率極顯著高于凍融法,測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差更小,且提取時(shí)間較凍融法縮短一半以上,適用于富營(yíng)養(yǎng)化水體的應(yīng)急監(jiān)測(cè).

    微波法;反復(fù)凍融法;提??;浮游植物;葉綠素a

    葉綠素a是表征藻類(lèi)現(xiàn)存量的一個(gè)重要指標(biāo)[1],可在一定程度上反映水體初級(jí)生產(chǎn)力和浮游植物生物量[2],是水體富營(yíng)養(yǎng)化評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)和水華預(yù)警的重要依據(jù)[3]. 因此,葉綠素a濃度的準(zhǔn)確測(cè)定是水體富營(yíng)養(yǎng)化研究和水質(zhì)評(píng)價(jià)的重要基礎(chǔ)[1]. 在葉綠素a的測(cè)定過(guò)程中,較高的提取率是保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的前提. 目前常用的提取方法是利用反復(fù)凍融細(xì)胞破碎藻類(lèi)細(xì)胞,再用丙酮或乙醇等有機(jī)溶劑浸提細(xì)胞溶出物中的葉綠素[4-7],該方法凍融操作簡(jiǎn)單,與有毒溶劑接觸時(shí)間短[7-8],但耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng),且可能對(duì)具膠被或硅質(zhì)殼藻細(xì)胞的破碎能力較弱.

    自1986年開(kāi)始利用微波技術(shù)從羽扇豆中提取鷹爪豆生物堿以來(lái)[9],微波輔助技術(shù)(microwave-assistedextraction,MAE)在色素的提取工藝中被廣泛應(yīng)用[10-12]. 微波法通過(guò)升溫汽化胞內(nèi)液體,使細(xì)胞膨脹破裂,內(nèi)容物自由流出,因此萃取率較高[13]. 但此方法對(duì)浮游植物細(xì)胞尤其是具膠被或硅質(zhì)殼藻細(xì)胞是否具有較強(qiáng)的破碎能力和較高的葉綠素提取效果還有待驗(yàn)證. 為縮短樣品處理時(shí)間和提高測(cè)定的準(zhǔn)確度,本文設(shè)計(jì)并優(yōu)化了微波法提取浮游植物葉綠素a的處理?xiàng)l件,比較了優(yōu)化后的微波法和反復(fù)凍融法(Freezing-thawing,FT)對(duì)葉綠素a的提取率及兩種方法的穩(wěn)定性,提出適合不同營(yíng)養(yǎng)水平水體葉綠素a的測(cè)定方法.

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    純?cè)逡簶悠罚簩?shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和顆粒直鏈藻(Melosira granulata).

    野外樣品:湖泊(暨南大學(xué)南湖S1 、明湖S2)、河流(流溪河石海橋S3、珠江獵德大橋S4)、水庫(kù)(流溪河水庫(kù)S5、南屏水庫(kù)S6),其中S1、S3、S5葉綠素濃度較低,S2、S4、S6葉綠素濃度較高.

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括微波處理?xiàng)l件優(yōu)化及其與反復(fù)凍融法提取葉綠素效果比較兩部分,具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1. 1.2.1 微波法操作步驟及實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化用醋酸纖維濾膜(0.45μm)過(guò)濾一定量的水樣,再將濾膜折疊為1/4后,置于對(duì)折的定性濾紙中遮光并吸去濾膜背面水分. 將濾膜連同定性濾紙和裝有小半杯水的燒杯(防止微波爐空燒)放入微波爐(型號(hào):P80D23N2L-A9(R0),額定輸出功率800W)中,在高火(額定輸出功率100%輸出,即800W功率輸出[14])條件下進(jìn)行微波破壁處理.

    破壁處理后將濾膜取出放入盛有10ml90%丙酮溶液的離心管中,用快速混勻器/手搖震蕩1min后放于4℃冰箱浸提8h以上,再經(jīng)過(guò)7000轉(zhuǎn)/min離心15min后,用HitachiU-3900紫外分光光度計(jì)于630、645、663和750nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光值后計(jì)算得出葉綠素a濃度[15].

    根據(jù)葉綠素a的測(cè)定結(jié)果,確定微波法中最優(yōu)的微波處理時(shí)長(zhǎng)和過(guò)濾水量. 1.2.2 比較微波法和反復(fù)凍融法提取效果分別用微波法和反復(fù)凍融法(-20℃冷凍20min,取出室溫融解5~10min,反復(fù)凍融5次,90%丙酮4℃浸提20h)[8]提取純?cè)逡?銅綠微囊藻、蛋白核小球藻和顆粒直鏈藻)以及野外水樣(S1、S2、S3、S4、S5和S6)的葉綠素a濃度. 微波法和反復(fù)凍融法樣品統(tǒng)一批次、濃度及過(guò)濾水量等條件,保證結(jié)果的可比性;所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置5組平行,保證重復(fù)性.

    表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)*Tab.1 Experimental design

    *Mic.:銅綠微囊藻;Chl.:蛋白核小球藻;Mel.:顆粒直鏈藻.

    1.3 數(shù)據(jù)分析與繪圖

    利用SPSS20.0進(jìn)行單因素方差分析;用Origin8.0軟件完成繪圖.

    圖1 不同微波處理時(shí)間對(duì)野外水樣(S1) 葉綠素a濃度測(cè)定結(jié)果的影響Fig.1 Effect of microwave treatment time on determination of chlorophyll-a concentration from field water samples

    2 結(jié)果與討論

    2.1微波法的處理?xiàng)l件篩選

    2.1.1 微波處理時(shí)間對(duì)葉綠素提取效果的影響微波法主要通過(guò)微波破壁產(chǎn)生裂縫和空隙[11-12],有助于有機(jī)溶劑丙酮有效地溶出葉綠素. 微波處理時(shí)長(zhǎng)直接影響提取效果. 對(duì)于野外水體(S1),微波處理60s后的葉綠素a濃度的測(cè)定結(jié)果顯著高于處理30s后的測(cè)定結(jié)果(P<0.05),且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小(圖1). 但隨著處理時(shí)間的增加,葉綠素a濃度的測(cè)定結(jié)果并未顯著升高,當(dāng)處理時(shí)間達(dá)150s時(shí),微波可能破壞了藻細(xì)胞體內(nèi)的葉綠素a結(jié)構(gòu)[15],導(dǎo)致測(cè)定的葉綠素a濃度顯著下降(P<0.05). 對(duì)于室內(nèi)培養(yǎng)的不同濃度的微囊藻藻液和小球藻藻液,微波處理時(shí)間超過(guò)60s時(shí),葉綠素a濃度的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖2). 因此,最適的微波破壁處理時(shí)長(zhǎng)為60s左右.

    圖2 不同微波處理時(shí)間對(duì)室內(nèi)培養(yǎng)藻液葉綠素a濃度的影響(a:銅綠微囊藻; b:蛋白核小球藻)Fig.2 Effect of microwave irradiation time on determination of chlorophyll-a concentration from cultured samples (a: Microcystis aeruginosa; b: Chlorella pyrenoidosa)

    2.1.2 過(guò)濾水量對(duì)微波法提取效果的影響過(guò)濾水量為50ml時(shí),S2水樣的葉綠素a提取效果較差,可能是由于此時(shí)濾膜上葉綠素過(guò)少,濃度低于檢測(cè)限,導(dǎo)致測(cè)量值偏低(圖3). 當(dāng)過(guò)濾水量增加到100、500ml時(shí),提取效果顯著提高(P<0.05),但當(dāng)過(guò)濾水量為1000ml時(shí),葉綠素a濃度測(cè)定值略降低(圖3),這可能與過(guò)濾時(shí)間較長(zhǎng),葉綠素部分分解有關(guān)[16],也可能與泥沙等雜質(zhì)增多,干擾測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性有關(guān). 因此,以葉綠素a濃度為15μg/L左右的富營(yíng)養(yǎng)水樣為例,微波法提取葉綠素a的最適過(guò)濾水量為100~500ml. 隨著葉綠素a濃度的升高或降低,應(yīng)相應(yīng)調(diào)整過(guò)濾水量:貧營(yíng)養(yǎng)型水體為1000ml;中、富營(yíng)養(yǎng)水體為100~500ml.

    圖3 微波法對(duì)不同體積野外水樣(S2) 葉綠素a濃度的測(cè)定結(jié)果Fig.3 The determination of chlorophyll-a concentration in field samples with different volumes by MAE

    2.2 微波法和反復(fù)凍融法對(duì)葉綠素a提取效果的比較

    對(duì)于室內(nèi)培養(yǎng)的微囊藻藻液,微波法和反復(fù)凍融法對(duì)葉綠素a的提取效果無(wú)顯著差異(圖4a),這可能與微囊藻細(xì)胞體積小、細(xì)胞壁薄[8]有關(guān);對(duì)于室內(nèi)培養(yǎng)的小球藻和直鏈藻藻液,微波法提取效果顯著高于反復(fù)凍融法(P<0.05),這可能是因?yàn)槲⒉ㄝ椛渚鶆?,選擇性強(qiáng)[13],對(duì)具細(xì)胞個(gè)體膠被的小球藻和具硅質(zhì)外殼的直鏈藻細(xì)胞壁的破碎效果較好. 而反復(fù)凍融法通過(guò)冷凍使細(xì)胞內(nèi)形成冰粒和細(xì)胞液濃度增高引起溶脹[17],依賴(lài)多次反復(fù)冷凍及室溫解凍,受環(huán)境因素影響較大,破壁效果較差.

    用微波法和反復(fù)凍融法分別測(cè)定以藍(lán)、綠藻占優(yōu)勢(shì)的湖泊和水庫(kù)水樣以及以硅藻占優(yōu)勢(shì)的河流水樣中的葉綠素a濃度. 當(dāng)葉綠素a濃度較低時(shí)(S1、S3和S5),兩種方法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異;當(dāng)葉綠素濃度較高(S2、S4和S6)時(shí),微波法的測(cè)定結(jié)果顯著高于反復(fù)凍融法(P<0.05),且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小,此時(shí)微波法的提取效果更好(圖4b).

    3 結(jié)論

    1)微波法提取葉綠素a的最優(yōu)處理?xiàng)l件為:高火(額定輸出功率800W)60s左右. 最佳過(guò)濾水量為:貧營(yíng)養(yǎng)型水體為1000ml;中、富營(yíng)養(yǎng)水體為100~500ml.

    2)微波法提取對(duì)具有膠被和硅質(zhì)外殼的藻類(lèi)提取效率優(yōu)于凍融法,且誤差更小.

    圖4 微波法和反復(fù)凍融法對(duì)室內(nèi)培養(yǎng)藻液(a)和野外水樣(b)葉綠素a濃度測(cè)定結(jié)果的比較Fig.4 Comparison of determination of chlorophyll-a concentration in cultured samples(a) and in field samples(b) by MAE and FT

    3)兩種方法在操作上均較簡(jiǎn)單易行. 反復(fù)凍融法在測(cè)定貧營(yíng)養(yǎng)水體葉綠素a濃度上具有一定的優(yōu)勢(shì)(采用反復(fù)凍融法建議貧營(yíng)養(yǎng)水體過(guò)濾水量為500~1000ml[8]),但當(dāng)葉綠素a濃度較高時(shí),微波法提取率顯著高于反復(fù)凍融法,測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差較小,且提取時(shí)間較凍融法縮短一半以上,適用于富營(yíng)養(yǎng)化水體的應(yīng)急監(jiān)測(cè).

    [1]SEPA"AquaticOrganismsMonitoringHandbook"editorialed.Aquaticorganismsmonitoringhandbook.Nanjing:SoutheastUniversityPress, 1993: 177-180(inChinese).[國(guó)家環(huán)境保護(hù)局《水生生物監(jiān)測(cè)手冊(cè)》編委會(huì). 水生生物監(jiān)測(cè)手冊(cè). 南京: 東南大學(xué)出版社, 1993: 177-180.]

    [2]KimSangchan,TuQingyingeds.Eutrophicationsurveyspecifications(2ndedition).Beijing:ChinaStandardPress, 1990: 268-270(inChinese).[金相燦, 屠清瑛. 湖泊富營(yíng)養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范(第2版). 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1990: 268-270.]

    [3]HuangYingbo.Animprovedmethodforextractionofchlorophyllainphytoplankton:freezing-thawingmethod. China Science and Technology Information, 2012, (10): 157(inChinesewithEnglishabstract). [黃瑩波. 浮游植物葉綠素a提取方法的改進(jìn): 反復(fù)凍融—浸提法. 中國(guó)科技信息, 2012, (10): 157.]

    [4]RosenBH,LoweRL.PhysiologicalandultrastructuralresponsesofCyclotella meneghiniana (Bacillariophyta)tolightintensityandnutrientlimitation. Journal of Phycology, 1984, 20(2): 173-183.

    [5]LevassseurM,ThompsonPA,HarrisonPJ.Physiologicalacclimationofmarinephytoplanktontodifferentnitrogensources. Journal of Phycology, 1993, 29(5): 587-595.

    [6]Pápistaé,csé,B?ddiB.Chlorophyll-adeterminationwithethanol—acriticaltest. Hydrobiologia, 2002, 485: 191-198.

    [7]FengJing,LiYanbo,ZhuQinget al.Comparisonofmethodsforphytoplanktonchlophyll-aconcentrationmeasurement. Ecology and Environment, 2008, 17(2): 524-527(inChinesewithEnglishabstract). [馮菁,李艷波,朱擎等. 浮游植物葉綠素a測(cè)定方法比較. 生態(tài)環(huán)境, 2008, 17(2): 524-527.]

    [8]LinShaojun,HeLijing,HuangPeishenget al.Comparisonandimprovementontheextractionmethodforchlorophyllainphytoplankton. Ecology and Environment, 2005, 24(1): 9-11(inChinesewithEnglishabstract). [林少君,賀立靜,黃沛生等. 浮游植物中葉綠素a提取方法的比較與改進(jìn). 生態(tài)科學(xué), 2005, 24(1): 9-11.]

    [9]GanzlerK,SalgóA,ValkóK.MicrowaveextractionAnovelsamplepreparationmethodforchromatography. Journal of Chromatography A, 1986, 371: 299-306.

    [10]XieMingyong,ChenYi.Theresearchprogressofmicrowaveassistedextractingtechnology. Journal of Food Science and Biotechnology, 2006, 25(1): 105-114(inChinesewithEnglishabstract). [謝明勇, 陳奕. 微波輔助萃取技術(shù)研究進(jìn)展. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2006, 25(1): 105-114.]

    [11]EskilssonCS,Bj?rklundE.Analytical-scalemicrowave-assistedextraction. Journal of Chromatography A, 2000, 902(1): 227-250.

    [12]RenQingguo.Thestudyofmicrowaveassistantextractiononchlorophyllfromsilkwarmandchlorophyll-copper-sodiumpreparation[Dissertation].Dalian:DalianUniversityofTechnology, 2005(inChinesewithEnglishabstract).[任清國(guó). 微波輔助萃取蠶沙中葉綠素及葉綠酸銅鈉的研究[學(xué)位論文]. 大連: 大連理工大學(xué), 2005.]

    [13]PasquetV,ChérouvrierJR,FarhatFet al.Studyonthemicroalgalpigmentsextractionprocess:performanceofmicrowaveassistedextraction. Process Biochemistry, 2011, 46(1): 59-67.

    [14]JiangXiuxined.Microwaverepairatlas.Harbin:HarbinEngineeringUniversityPress, 2006: 31(inChinese).[蔣秀欣. 微波爐維修圖集. 哈爾濱: 哈爾濱工程大學(xué)出版社, 2006: 31.]

    [15]LiZhenguo,LuJun,WangGuoxianget al.Comparisonofmeasurementofphytoplanktonchlorophyll-aconcentrationbyspectrophotometry. Environmental Monitoring in China, 2006, 22(2): 21-23(inChinesewithEnglishabstract). [李振國(guó), 盧軍, 王國(guó)祥等. 分光光度法測(cè)定浮游植物葉綠素a的比較研究. 中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè), 2006, 22(2): 21-23.]

    [16]ZhangWuchang,WangRong.Effectoflightandtemperatureonthedegradationofchlorophyllaandphaeophorbidea. Marine Science, 2000, 24(4): 50-52(inChinesewithEnglishabstract). [張武昌, 王榮. 光和溫度對(duì)葉綠素a和脫鎂葉綠素a降解的影響. 海洋科學(xué), 2000, 24(4): 50-52.]

    [17]SunLiqin,WangChanghai,JiangTao.ResearchonthemethodsofPorphyridium cruentumcellsfragmentation. Marine Science Bulletin, 2004, 23(4): 71-74(inChinesewithEnglishabstract). [孫利芹, 王長(zhǎng)海, 江濤. 紫球藻細(xì)胞破碎方法研究. 海洋通報(bào), 2004, 23(4): 71-74.]

    Microwave-assisted method for extracting chlorophyll-a in phytoplankton and its comparison with freezing-thawing extraction method

    LIN Luomin1, TANG Quehui1, PENG Liang1, WEI Guifeng1**, LIN Shuzhong2, LI Xiangjiao2& YANG Haowen2

    (1: Engineering Research Center of Tropical and Subtropical Aquatic Ecological Engineering Ministry of Education, Department of Ecology, Jinan University, Guangzhou 510632, P.R.China) (2: Hydrological Bureau of Guangdong Province, Guangzhou 510150, P.R.China)

    Inordertosavetimeofsampleprocessingandtoimprovethedeterminingaccuracy,amicrowave-assistedextractionmethodwasdesignedandoptimizedtoextractchlorophyll-ainphytoplankton,andwascomparedtothefreezing-thawingmethodforextractionefficiencyofchlorophyll-a.Theresultsshowedthatmicrowave-assistedextractionmethodwasoptimalin60streatmentwithoutputpowerof800W,andtheappropriatewatervolumeforfiltrationwasabout100-500mlforsamplescollectedinmeso-eutrophicwaterbodiesand1000mlforthosefromoligotrophicwaterbodies.Thechlorophyllextractionrateofmicrowave-assistedextractionmethodwassignificantlyhigherthanthatoffreezing-thawingmethodinmeso-eutrophicwaterbodies,whichcanincreasedby7%-12%,whilefreezing-thawingmethodwasmorestableinmeasuringchlorophyll-aofoligotrophicwaterbodies.Forthosealgaewithaglueshellorsiliceousshell,microwave-assistedextractionmethodhadahigherefficiencyforchlorophyll-aextractionandalowerrelativestandarddeviationthanthefreeze-thawmethod.Themicrowave-assistedextractionmethodneedsonlyonehalfoperationtimeofthefreezing-thawingextractionmethod,sothatitismoresuitableforemergencymonitoringofeutrophicwaterbodies,whilethefreezing-thawingextractionmethodismoresuitableformonitoringoligotrophicwaterbodies.

    Microwave-assistedextractionmethod;freezing-thawingmethod;extraction;phytoplankton;chlorophyll-a

    *廣東省水利科技創(chuàng)新項(xiàng)目“廣東省河流水生態(tài)健康評(píng)價(jià)指標(biāo)體系及評(píng)價(jià)方法研究”(2014-01)資助.2015-10-23收稿;2015-12-16收修改稿. 林羅敏(1990~),女,碩士研究生;E-mail:linluomin@126.com.

    **通信作者;E-mail:tweigf@jnu.edu.cn.

    猜你喜歡
    小球藻微囊濾膜
    溶膠-凝膠法制備高性能ZrO2納濾膜
    A case report of acupuncture of dysphagia caused by herpes zoster virus infection
    正負(fù)極互換式小球藻光合微生物燃料電池性能
    不同溶劑萃取小球藻油脂結(jié)構(gòu)及組分差異
    微囊懸浮-懸浮劑和微囊懸浮劑不是同種劑型
    荷負(fù)電手性殼聚糖納復(fù)合濾膜的制備與性能研究
    微囊藻毒素-LR對(duì)秀麗線(xiàn)蟲(chóng)精子形成的毒性作用
    馬錢(qián)子生物堿微囊的制備及評(píng)價(jià)
    雙溶劑體系提取小球藻油脂的研究
    1種荷正電納濾膜的制備
    亚洲免费av在线视频| 在线视频色国产色| 久久精品91蜜桃| 国产乱人伦免费视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 日本三级黄在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久久久久午夜电影| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲成av人片免费观看| 久久久久久大精品| 男女之事视频高清在线观看| 大陆偷拍与自拍| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 涩涩av久久男人的天堂| 曰老女人黄片| 午夜日韩欧美国产| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产激情久久老熟女| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 在线观看免费日韩欧美大片| 这个男人来自地球电影免费观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产真人三级小视频在线观看| 此物有八面人人有两片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 操出白浆在线播放| 国产精华一区二区三区| 一级,二级,三级黄色视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 91成年电影在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 午夜日韩欧美国产| 久久 成人 亚洲| 国产1区2区3区精品| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品欧美国产一区二区三| 丝袜人妻中文字幕| 69av精品久久久久久| 精品国产乱码久久久久久男人| 极品教师在线免费播放| 视频区欧美日本亚洲| videosex国产| 国产精品日韩av在线免费观看 | 精品久久久久久成人av| 操美女的视频在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产极品粉嫩免费观看在线| bbb黄色大片| 日韩有码中文字幕| 69精品国产乱码久久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲熟女毛片儿| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久精品91蜜桃| 免费在线观看影片大全网站| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲精品国产区一区二| 一区二区三区高清视频在线| 久久久久久免费高清国产稀缺| 色哟哟哟哟哟哟| 纯流量卡能插随身wifi吗| 自线自在国产av| 精品电影一区二区在线| 久久香蕉精品热| av电影中文网址| 亚洲专区字幕在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品一区二区免费欧美| av片东京热男人的天堂| 少妇的丰满在线观看| www国产在线视频色| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲免费av在线视频| 女人精品久久久久毛片| 日韩欧美在线二视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲avbb在线观看| 伦理电影免费视频| 久久热在线av| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品电影一区二区三区| 久久伊人香网站| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲精品国产一区二区精华液| www.熟女人妻精品国产| 久久伊人香网站| 久久影院123| 久久久久久久久免费视频了| 两个人看的免费小视频| 久久热在线av| 黑人操中国人逼视频| 丝袜美足系列| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲成人国产一区在线观看| 88av欧美| 制服丝袜大香蕉在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久中文字幕一级| 久久久久久久久久久久大奶| 日韩大码丰满熟妇| 成人手机av| 午夜精品在线福利| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 99香蕉大伊视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| www.精华液| 正在播放国产对白刺激| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲色图综合在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲最大成人中文| 岛国在线观看网站| 激情在线观看视频在线高清| 精品福利观看| 老司机靠b影院| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产免费av片在线观看野外av| 久久天堂一区二区三区四区| 淫秽高清视频在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 免费看十八禁软件| 人人妻人人澡人人看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| svipshipincom国产片| 精品久久久久久久久久免费视频| 中文字幕高清在线视频| 香蕉久久夜色| 手机成人av网站| 国产一区二区三区视频了| 乱人伦中国视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲人成电影免费在线| 婷婷丁香在线五月| www.熟女人妻精品国产| xxx96com| 咕卡用的链子| 999久久久精品免费观看国产| 成人国产一区最新在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久精品影院6| 黄频高清免费视频| 成人手机av| 亚洲人成电影免费在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲成国产人片在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| www.精华液| 国产1区2区3区精品| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久久久久免费高清国产稀缺| 嫩草影视91久久| 亚洲国产精品999在线| 国产精品一区二区三区四区久久 | 自线自在国产av| 国产免费av片在线观看野外av| 91成年电影在线观看| а√天堂www在线а√下载| 一区在线观看完整版| 亚洲avbb在线观看| 在线国产一区二区在线| 国产视频一区二区在线看| 涩涩av久久男人的天堂| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 男人的好看免费观看在线视频 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲,欧美精品.| 国产高清有码在线观看视频 | 制服人妻中文乱码| 无限看片的www在线观看| 我的亚洲天堂| 国产精品 国内视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 老汉色∧v一级毛片| 一区二区日韩欧美中文字幕| 俄罗斯特黄特色一大片| 两性夫妻黄色片| 国产单亲对白刺激| 欧美一级a爱片免费观看看 | videosex国产| 青草久久国产| www.熟女人妻精品国产| 中文字幕高清在线视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲国产精品999在线| 国产精品二区激情视频| 嫩草影院精品99| 午夜免费激情av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 性欧美人与动物交配| 窝窝影院91人妻| 欧美精品啪啪一区二区三区| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 成人国产综合亚洲| 久久精品91蜜桃| 日韩欧美三级三区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲精品一区av在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 首页视频小说图片口味搜索| 国产99久久九九免费精品| 日韩精品中文字幕看吧| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 色精品久久人妻99蜜桃| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲精品一区av在线观看| 变态另类丝袜制服| 午夜福利视频1000在线观看 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲人成电影免费在线| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美日韩精品网址| 在线视频色国产色| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99在线视频只有这里精品首页| www.精华液| 日韩国内少妇激情av| 久久人人97超碰香蕉20202| 精品乱码久久久久久99久播| 国产成人影院久久av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲一区二区三区不卡视频| 91字幕亚洲| 欧美黑人欧美精品刺激| 最近最新免费中文字幕在线| 精品日产1卡2卡| 成人永久免费在线观看视频| 18禁观看日本| www.999成人在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 在线永久观看黄色视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日日爽夜夜爽网站| 激情在线观看视频在线高清| 久久国产精品男人的天堂亚洲| videosex国产| 极品人妻少妇av视频| 一级毛片高清免费大全| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久人妻熟女aⅴ| 精品无人区乱码1区二区| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品,欧美在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 夜夜夜夜夜久久久久| 热re99久久国产66热| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲熟妇熟女久久| 日韩av在线大香蕉| 国产精品 欧美亚洲| 在线观看66精品国产| 他把我摸到了高潮在线观看| 十八禁人妻一区二区| 精品第一国产精品| 久久香蕉精品热| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久精品成人免费网站| av天堂久久9| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久香蕉国产精品| 麻豆国产av国片精品| 日韩大尺度精品在线看网址 | 成年人黄色毛片网站| 久久青草综合色| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久精品影院6| 美女 人体艺术 gogo| 黑人操中国人逼视频| 日韩精品青青久久久久久| 99在线人妻在线中文字幕| 精品欧美国产一区二区三| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 国产精品国产高清国产av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 操美女的视频在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品久久久av美女十八| 久久久精品欧美日韩精品| 免费在线观看亚洲国产| 咕卡用的链子| 久久人人精品亚洲av| 精品免费久久久久久久清纯| 午夜福利成人在线免费观看| 手机成人av网站| 午夜a级毛片| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 激情视频va一区二区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久影院123| 999久久久精品免费观看国产| www.999成人在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 丝袜美足系列| 波多野结衣av一区二区av| 夜夜爽天天搞| 两个人看的免费小视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 视频区欧美日本亚洲| 国产区一区二久久| 曰老女人黄片| 国产91精品成人一区二区三区| 久久香蕉激情| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 丝袜美腿诱惑在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久香蕉精品热| 午夜福利,免费看| 国产国语露脸激情在线看| 久久精品国产综合久久久| 国产在线观看jvid| 夜夜爽天天搞| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 777久久人妻少妇嫩草av网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 午夜福利视频1000在线观看 | 91精品三级在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 真人一进一出gif抽搐免费| 窝窝影院91人妻| 久久国产乱子伦精品免费另类| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美中文综合在线视频| 亚洲精品在线美女| 亚洲人成77777在线视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 亚洲成人免费电影在线观看| 免费少妇av软件| 成在线人永久免费视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 丁香六月欧美| 国产av在哪里看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日日爽夜夜爽网站| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲精品美女久久av网站| 国产av又大| 一区二区三区国产精品乱码| 国产男靠女视频免费网站| а√天堂www在线а√下载| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 精品人妻在线不人妻| 国产成人影院久久av| 精品久久久久久久久久免费视频| 不卡一级毛片| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产麻豆成人av免费视频| 国产精品一区二区免费欧美| 又紧又爽又黄一区二区| 啦啦啦免费观看视频1| 日本a在线网址| 国产人伦9x9x在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品爽爽va在线观看网站 | а√天堂www在线а√下载| 多毛熟女@视频| 黄色 视频免费看| 香蕉丝袜av| 亚洲天堂国产精品一区在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产成人精品无人区| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久人人精品亚洲av| 最近最新免费中文字幕在线| 国产成人免费无遮挡视频| 美女午夜性视频免费| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲国产欧美网| 欧美黑人精品巨大| 亚洲成av人片免费观看| 一本大道久久a久久精品| 亚洲视频免费观看视频| 无人区码免费观看不卡| 成人国产综合亚洲| 国产三级黄色录像| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 伦理电影免费视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 黄色视频,在线免费观看| www.精华液| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲人成电影观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产av一区二区精品久久| 三级毛片av免费| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲av电影在线进入| 亚洲第一电影网av| 一进一出抽搐gif免费好疼| 在线永久观看黄色视频| 久久精品国产清高在天天线| 99香蕉大伊视频| 日韩精品中文字幕看吧| 国产一区二区激情短视频| 在线播放国产精品三级| 最好的美女福利视频网| 在线观看午夜福利视频| 9191精品国产免费久久| 国产精品久久久久久精品电影 | 欧美乱妇无乱码| 国产精品亚洲美女久久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 成人亚洲精品av一区二区| 91字幕亚洲| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久精品国产综合久久久| 午夜福利,免费看| 免费不卡黄色视频| 在线播放国产精品三级| 999精品在线视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 一a级毛片在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久中文字幕一级| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 免费高清视频大片| 国产亚洲欧美精品永久| www.自偷自拍.com| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲精华国产精华精| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久久久久久午夜电影| 欧美久久黑人一区二区| 国产xxxxx性猛交| 国产麻豆69| 动漫黄色视频在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品亚洲一级av第二区| 大型av网站在线播放| 少妇熟女aⅴ在线视频| 51午夜福利影视在线观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 男女下面插进去视频免费观看| www日本在线高清视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 成人欧美大片| 国内精品久久久久久久电影| 黄色成人免费大全| av在线天堂中文字幕| 免费在线观看日本一区| 久久亚洲精品不卡| 国产亚洲欧美98| 男人舔女人的私密视频| a级毛片在线看网站| 精品国产国语对白av| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩有码中文字幕| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品久久视频播放| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩视频一区二区在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址 | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品1区2区在线观看.| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品久久久精品久久久| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | x7x7x7水蜜桃| 免费在线观看影片大全网站| 又大又爽又粗| 欧美精品亚洲一区二区| 国产成人精品久久二区二区91| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久久久久大精品| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产片内射在线| avwww免费| 欧美中文综合在线视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩精品青青久久久久久| 女警被强在线播放| 国产精品综合久久久久久久免费 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 深夜精品福利| 日本在线视频免费播放| 久久亚洲精品不卡| 精品日产1卡2卡| 国产在线观看jvid| 亚洲免费av在线视频| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产又色又爽无遮挡免费看| 精品日产1卡2卡| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲免费av在线视频| 波多野结衣高清无吗| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 色哟哟哟哟哟哟| 麻豆国产av国片精品| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 国产高清有码在线观看视频 | 岛国视频午夜一区免费看| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜免费观看网址| 欧美久久黑人一区二区| 91精品三级在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产精品一区二区三区四区久久 | 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲人成电影免费在线| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩有码中文字幕| 久久人人97超碰香蕉20202| 极品人妻少妇av视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 午夜影院日韩av| 精品欧美一区二区三区在线| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 曰老女人黄片| 久久精品成人免费网站| 老司机在亚洲福利影院| 国产成人影院久久av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产欧美日韩一区二区精品| 午夜精品国产一区二区电影| 午夜老司机福利片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久久国产成人精品二区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产不卡一卡二| 久久草成人影院| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 91麻豆av在线| 在线观看免费视频网站a站| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 岛国视频午夜一区免费看| 中文字幕av电影在线播放| 久久中文字幕人妻熟女| 一本综合久久免费| 高清黄色对白视频在线免费看| 一二三四在线观看免费中文在| 丝袜人妻中文字幕| 在线观看www视频免费| 女警被强在线播放| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美一级毛片孕妇| 一区福利在线观看| 制服人妻中文乱码| 欧美激情极品国产一区二区三区| 色播在线永久视频| а√天堂www在线а√下载| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 成年人黄色毛片网站| 黄色 视频免费看| 性少妇av在线| 一a级毛片在线观看| 操美女的视频在线观看|