口蹄疫疫苗研究進(jìn)展

曾剛秀，陳貴英，曾玉梅，朱庭俊

（1.重慶市榮昌區(qū)昌州畜牧獸醫(yī)站，重慶 榮昌 402460；2.重慶市榮昌區(qū)峰高畜牧獸醫(yī)站，重慶 榮昌 402460；3.重慶市榮昌區(qū)遠(yuǎn)覺(jué)畜牧獸醫(yī)站，重慶 榮昌 402460）

口蹄疫疫苗研究進(jìn)展

曾剛秀1，陳貴英1，曾玉梅2，朱庭俊3

（1.重慶市榮昌區(qū)昌州畜牧獸醫(yī)站，重慶 榮昌 402460；2.重慶市榮昌區(qū)峰高畜牧獸醫(yī)站，重慶 榮昌 402460；3.重慶市榮昌區(qū)遠(yuǎn)覺(jué)畜牧獸醫(yī)站，重慶 榮昌 402460）

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由具有抗原易變性、血清多樣性的口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病具有易感動(dòng)物種類(lèi)繁多、傳播途徑多樣、四季均可發(fā)病等特點(diǎn)，死亡率很低，一般在2.5%左右，但發(fā)病率卻可達(dá)到100%。病畜主要表現(xiàn)為口、舌、唇、蹄、乳房等部位發(fā)生水皰和潰爛，造成行動(dòng)與飲食不便，從而導(dǎo)致發(fā)育遲緩，如果是犢牛或仔豬發(fā)病，其死亡率可高達(dá)65%，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失。目前防控該病主要通過(guò)疫苗免疫和無(wú)害化處理方法，本文通過(guò)對(duì)口蹄疫疫苗的研究進(jìn)行綜述，目的是為生產(chǎn)實(shí)踐為防控該病提供理論依據(jù)。

1　傳統(tǒng)疫苗

1.1弱毒苗

弱毒疫苗是指經(jīng)過(guò)充分制弱的，但它仍然可以在動(dòng)物體內(nèi)增殖，還可以引起動(dòng)物接種無(wú)癥狀感染的發(fā)病率，使機(jī)體產(chǎn)生一個(gè)非常強(qiáng)大的和持久的抗病毒制劑。弱毒疫苗的優(yōu)點(diǎn)是，在許多方面，如成本低，良好的免疫原性和抗體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)和接種途徑多樣化等優(yōu)點(diǎn)，但弱毒疫苗也有很多缺點(diǎn)，比如很多方法從根本上無(wú)法克服，免疫動(dòng)物后，動(dòng)物可能會(huì)產(chǎn)生病毒血癥，排毒及病毒返強(qiáng)、長(zhǎng)期帶毒等一系列的缺點(diǎn)，因?yàn)樵撘呙缇哂幸陨系姆N種不足，所以在臨床上大量使用活疫苗是有限的，為了使口蹄疫病疫苗更安全可靠，為了保護(hù)動(dòng)物的安全，人們就探索出了一些相對(duì)而言比較安全可靠的新型疫苗。

1.2滅活苗

滅活疫苗是使用化學(xué)或物理的方法使口蹄疫病毒失去毒力，但保留抗原性，加入佐劑制成的疫苗。滅活疫苗的滅活劑多種多樣的。滅活疫苗的制備有3個(gè)重要的步驟：

（1）考慮獲得大量的病毒抗原的方式。

（2）正確選擇滅活疫苗的滅活方法和滅活劑。

（3）免疫佐劑的選擇必須考慮佐劑的毒副作用等。漢森和施密特（1934年）發(fā)現(xiàn)了氫氧化鋁凝膠的輔助，不僅沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒性，并還具有有效增強(qiáng)免疫力的功效。荷蘭學(xué)者弗蘭克（1935年），通過(guò)在體外培養(yǎng)的牛、羊、豬胚胎皮膚，使用固定的組織培養(yǎng)方法等，在口蹄疫病病毒培養(yǎng)上獲得成功。河谷（1925）采集了FMDV感染牛的水皰液，通過(guò)使用滅活劑甲醛滅活，第一次成功研制了口蹄疫病滅活疫苗。貝林和他的同事（1926～1929年）首次使用口蹄疫發(fā)病牛舌皮組織病料通過(guò)甲醛滅活制造口蹄疫滅活疫苗。弗蘭克爾（1947年）利用牛舌上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，發(fā)展了自己創(chuàng)造的組織塊弗蘭克爾法，并用其增殖FMDV，使大規(guī)模病毒抗原生產(chǎn)技術(shù)獲得成功，從那時(shí)起，能夠一次生產(chǎn)大量的口蹄疫病毒疫苗。貝科（1952）首先用胰蛋白酶消化動(dòng)物腎臟皮質(zhì)，獲得初代單層腎上皮細(xì)胞的培養(yǎng)成功，口蹄疫病病毒在初代單層腎上皮細(xì)胞上成功生長(zhǎng)。然而，在1938～1962年很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，口蹄疫病疫苗一直是由動(dòng)物組織產(chǎn)生病毒抗原，然后用甲醛滅活，加入氫氧化鋁凝膠吸附而生產(chǎn)出來(lái)的（王永錄等2009）。自1962年理想的BHK-21細(xì)胞問(wèn)世至今，它已成為制備口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想細(xì)胞系，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)口蹄疫疫苗（潘麗等，2003），目前，世界上仍然主要使用口蹄疫病滅活疫苗，但人們不僅僅局限于單價(jià)滅活疫苗，而是想辦法研制雙價(jià)滅活疫苗，如張永光（1995）的二價(jià)牛O型—A型口蹄疫滅活疫苗的研制成功，在牛的口蹄疫病的預(yù)防上已經(jīng)取得了理想的效果。然而，越來(lái)越多的測(cè)試顯示，通過(guò)甲醛滅活的口蹄疫疫苗與口蹄疫的多次發(fā)生是有很大關(guān)系的，所以甲醛滅活口蹄疫疫苗受到質(zhì)疑，但是如果不使用滅活苗而使用活苗，毒性大，也可能會(huì)造成巨大的損失，除了動(dòng)物免疫力差，活苗里面有很多的病毒也有較強(qiáng)的毒性，那么整個(gè)生物就存在極大的安全隱患，使得生產(chǎn)難度系數(shù)加大，生產(chǎn)成本相應(yīng)地提高，疫苗的用量也很大，由于有以上的這些問(wèn)題，所以迫切需要研究和開(kāi)發(fā)新的口蹄疫疫苗。

2　新疫苗

由于傳統(tǒng)疫苗有很多的問(wèn)題，科學(xué)家根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要，開(kāi)始發(fā)展口蹄疫新疫苗，發(fā)展要達(dá)到的目標(biāo)是高效、安全、多價(jià)、經(jīng)濟(jì)。自上世紀(jì)70年代，隨著分子生物學(xué)和生物工程等學(xué)科的不斷發(fā)展，新的口蹄疫疫苗的免疫組化研究取得了很大的進(jìn)步。

2.1口蹄疫核酸疫苗

核酸疫苗是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的生物技術(shù)，具有非常廣闊的應(yīng)用前景，具有成本低，穩(wěn)定性好，免疫期長(zhǎng)，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，抗原呈遞過(guò)程和病原體的感染是非常相似的，核酸疫苗，通常被稱(chēng)為基因疫苗，又稱(chēng)多核苷酸疫苗，“裸”DNA核酸疫苗，DNA疫苗。事實(shí)上是外源性抗原的基因克隆到載體和質(zhì)粒，然后病毒DNA或質(zhì)粒直接注射到動(dòng)物體內(nèi)后的重組，使外源基因在體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生天然蛋白抗原，激活免疫系統(tǒng)，并能不斷地引起免疫反應(yīng)。不過(guò)短時(shí)間內(nèi)，DNA疫苗如果想要取代當(dāng)前已廣泛使用的傳統(tǒng)的疫苗還是不容易的。但只要加大力度研究DNA疫苗，核酸疫苗一定可以得到更好更多的新突破。

2.2口蹄疫重組活載體疫苗所謂的活載體疫苗，就是把微生物保護(hù)性的抗原基因插入到載體病毒上，載體病毒就多種多樣了，有的采用的皰疹病毒、痘病毒等的特殊地方，然后使載體病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中不斷地復(fù)制，當(dāng)然也同時(shí)來(lái)表達(dá)外源基因的產(chǎn)物，簡(jiǎn)單概括也就是抗原。不同的幾個(gè)外源基因可以同時(shí)插入到一個(gè)載體病毒中，同時(shí)表達(dá)多種病原微生物的抗原，能夠預(yù)防多種不同的傳染病。近些年來(lái)，除了用病毒作載體之外，還有很多的專(zhuān)家是把細(xì)菌做載體的。腺病毒是在口蹄疫病毒載體疫苗的研究中最常使用的一種病毒。腺病毒是一種單分子線狀雙股的DNA病毒，基因組的大小大概為34～43kb，由252個(gè)殼粒組成，包括12個(gè)五鄰體、12根纖毛及240個(gè)六鄰體，沒(méi)有囊膜，核衣殼呈20面體對(duì)稱(chēng)。此外，還存在著很多其他的小分子蛋白 。六鄰體形成病毒衣殼20個(gè)三角形的面，12個(gè)頂端是5個(gè)五鄰體亞單位和3個(gè)纖毛蛋白構(gòu)成的復(fù)合物，12根纖毛以五鄰體的蛋白為基礎(chǔ)，從殼頂表面延伸，形成纖毛頂端的頭節(jié)。頭節(jié)區(qū)纖毛和五鄰體與細(xì)胞表面受體結(jié)合，在病毒感染細(xì)胞過(guò)程中具有十分重要的作用。在腺病毒基因組兩端各有100～140bp的一段末端反向重復(fù)序列（末端反向重復(fù)，ITR），ITR是病毒復(fù)制起始位點(diǎn)，并且，這個(gè)階段的病毒復(fù)制是整個(gè)過(guò)程中不能缺少的。ITR3有一個(gè)長(zhǎng)約300bp的包裝信號(hào)在左方，主要作用就是介導(dǎo)包裝腺病毒基因組的病毒衣殼結(jié)構(gòu)。所謂的腺病毒，是一個(gè)順式作用元件僅包括約0.5kb序列ITR包裝信號(hào)，換句話來(lái)說(shuō)，就是必須引起腺病毒載體自我攜帶和超過(guò)30種蛋白質(zhì)可以被其他病毒輔助（或細(xì)胞）提供。近年來(lái)，許多研究者在研究口蹄疫腺病毒載體病毒疫苗，現(xiàn)在，大部分相關(guān)的報(bào)道都是關(guān)于E3和E1編碼區(qū)的AdHu5為載體，有些載體還缺失了E4基因編碼區(qū)。復(fù)制缺陷腺病毒表達(dá)口蹄疫病毒P1基因編碼區(qū)的重組是通過(guò)桑斯帕拉試驗(yàn)來(lái)證明的，通過(guò)皮下和鼻咽這兩種免疫途徑來(lái)免疫牛只，后面2次僅僅能產(chǎn)生一小部分的免疫保護(hù)力。含有口蹄疫病毒A24/A12Mayr構(gòu)建的嵌合重組腺病毒P1-2A-3C基因，根據(jù)3C計(jì)劃的腺病毒可將腺病毒劃分為野生型和突變株兩種重組腺病毒，這個(gè)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，只有3C野生型重組腺病毒才能把聚蛋白P1裂解成為VP0、VP1和VP3，中和抗體可以在被刺激動(dòng)物機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生很高的水平，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了衣殼的裝配3C蛋白酶的必要性；孫普（2007）和其他專(zhuān)家也指出，腺病毒免疫豬體分別在第7天的重組，14d和21d的病毒攻擊相同的類(lèi)型，也有的很好的保護(hù)作用。

2.3口蹄疫合成肽疫苗

口蹄疫合成肽疫苗是一種完全的行列式的氨基酸序列或病原體的抗原表位開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的一類(lèi)疫苗，不存在毒力的反彈或滅活不全等這些問(wèn)題。根據(jù)天然氨基酸序列的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)化學(xué)方法人工合成的含有小肽表位，通常包含一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。特別是那些不能在體外培養(yǎng)病原微生物從而來(lái)得到足夠數(shù)量的抗原，但在免疫病理作用和潛在的致病性病原體等關(guān)系到安全性和有效性的問(wèn)題上有巨大的意義。合成肽疫苗的研究最早的就是在口蹄疫病毒上研究的，合成肽疫苗單獨(dú)的T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位的組合是研究合成肽疫苗的最主要研究方向要點(diǎn)，雖然在進(jìn)度上獲得了一些進(jìn)展，但是沒(méi)有找出一種滿意的合成肽疫苗。合成肽疫苗免疫研究沒(méi)有獲得成功最主要的問(wèn)題就出在組織相容性復(fù)合體（MHC）的限制上面，口蹄疫病免疫主要是依賴(lài)體液免疫來(lái)完成整個(gè)免疫過(guò)程的，單一的靠B細(xì)胞保護(hù)機(jī)體的作用是很小的，許多專(zhuān)家學(xué)者開(kāi)始想辦法從引進(jìn)T細(xì)胞表位提高免疫原性的多肽入手，這樣來(lái)研究應(yīng)該具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義的。但被限制由MHC病毒蛋白的T細(xì)胞表位的鑒定，TLL的特定的抗原決定簇或引入非選擇性T11抗原表位的不同部分可以在很大程度上解決這個(gè)問(wèn)題。要評(píng)價(jià)合成肽疫苗的效果好還是不好，必須從各個(gè)不同的角度著手，如疫苗本身完全不像蛋白質(zhì)抗原，可誘導(dǎo)各種免疫反應(yīng)的免疫原性，缺乏集體的多種免疫反應(yīng)，B細(xì)胞和T細(xì)胞表位的協(xié)同作用困難：因?yàn)樗狈ψ銐蚨嗟腂細(xì)胞表位抗原的刺激。DOEL（1990）用A型、O型、C型口蹄疫病的病毒在VPL序列200-213和141-158肽40個(gè)氨基酸組成的合成肽，實(shí)驗(yàn)在每個(gè)牛和豚鼠動(dòng)物，可以產(chǎn)生很高滴度的特異性病毒中和抗體，C型保護(hù)較差，同源病毒O型和A型肽可以完全保護(hù)豚鼠免受各種攻擊。Wang等（2002）使用大量的側(cè)翼序列和VPL GH作為實(shí)驗(yàn)框架，然后把常見(jiàn)的殘留物進(jìn)入該地區(qū)的高整合位點(diǎn)的VPL合成肽疫苗，Th位點(diǎn)設(shè)計(jì)和引入外源性在豬體內(nèi)進(jìn)行免疫，可以有效地得到20/21臺(tái)灣株口蹄疫病攻毒的保護(hù)率。

總之，在口蹄疫防控方面疫苗免疫是至關(guān)重要，研究疫苗工作還有很大提升空間，學(xué)術(shù)界科學(xué)家正在研究新型疫苗來(lái)解決現(xiàn)階段現(xiàn)有疫苗免疫缺陷問(wèn)題，我們相信通過(guò)各方面的努力，一定會(huì)達(dá)到凈化消滅該病。

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.09.001