實時熒光PCR法同時檢測食物中大豆和芹菜致敏原成分

汪永信 程瀟 安虹 聶磊 張波 劉娟娟

（國家農(nóng)副加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心 安徽省食品藥品檢驗研究院，合肥 230051）

實時熒光PCR法同時檢測食物中大豆和芹菜致敏原成分

汪永信 程瀟 安虹 聶磊 張波 劉娟娟

（國家農(nóng)副加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心 安徽省食品藥品檢驗研究院，合肥 230051）

大豆、芹菜等食品原料是一些特殊人群的致敏原。根據(jù)大豆atp A基因和芹菜mtd基因設(shè)計特異性引物，利用不同熒光素標(biāo)記的TaqMan探針，建立了一種實時熒光PCR檢測方法，可同時檢測食物中大豆和芹菜致敏原成分。分別以大豆、芹菜、大米、小麥、大麥、花生、芝麻、玉米、馬鈴薯、蕃茄、核桃、開心果、腰果、葵花籽、杏仁、蘋果、梨、草莓、豬肉、牛肉、羊肉及魚肉等材料的基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法僅能特異性擴(kuò)增大豆和芹菜致敏原成分。靈敏度測試結(jié)果表明大豆和芹菜成分的檢出限均達(dá)0.01%。因此，本方法可以作為同時檢測食品中大豆和芹菜致敏原成分的特異性方法。

實時熒光PCR；大豆；芹菜；致敏原檢測

食物過敏是食品安全面臨的嚴(yán)峻問題［1］，是由食物中致敏物質(zhì)引起的免疫介導(dǎo)不良反應(yīng)。食物過敏性疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，據(jù)統(tǒng)計全球約有3%-5% 的成年人和5%-8% 的兒童受過敏性疾病的困擾［2，3］。為保障公眾健康，美國和歐盟從2007年開始執(zhí)行新的食品致敏原標(biāo)簽法規(guī)，要求生產(chǎn)企業(yè)明確標(biāo)明其產(chǎn)品中是否含有8大類和12 種主要的食物致敏原，包括小麥、大豆、花生、芝麻、芥末、芹菜、堅果、畜禽產(chǎn)品和水產(chǎn)品等，我國國家標(biāo)準(zhǔn)《預(yù)包裝食品中的致敏原成分》和《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》也對預(yù)包裝食品中的主要致敏原成分及對這些成分進(jìn)行標(biāo)識標(biāo)注的要求作了具體規(guī)定［4，5］。大豆和芹菜含有多種復(fù)雜致敏成分［6-10］，其食用致敏癥狀主要表現(xiàn)為過敏性皮炎、鼻炎等，嚴(yán)重的可能導(dǎo)致休克、甚至危及生命［1，11］。而目前尚沒有食物過敏的特效療法，嚴(yán)格避免食入含這類成分的食物是過敏患者的最佳選擇，這很大程度上依賴于標(biāo)簽標(biāo)注。因此評價和檢測食物致敏原日益受到重視。

致敏原的體外檢測技術(shù)主要集中于依賴蛋白的免疫學(xué)方法和依賴于核酸的PCR方法等［12］。而基于時效性與準(zhǔn)確性方面的優(yōu)勢，實時熒光PCR方法已成為食品中致敏原檢測的首選［13］，針對不同種類的致敏成分，很多學(xué)者在此領(lǐng)域作過深入細(xì)致的研究［14-16］。不過多數(shù)研究集中在傳統(tǒng)PCR法或單重實時熒光PCR法，每個反應(yīng)僅能檢測出一種致敏原成分，而在一個PCR反應(yīng)中同時檢測出大豆和芹菜兩種致敏原成分的研究尚未見報道。而如何選擇合適的靶基因是進(jìn)行PCR反應(yīng)的前提，研究表明編碼大豆凝集素的核基因lectin［17］，編碼線粒體ATP合成酶亞單位的atp A基因［18］都可以達(dá)到此目的，相比核基因組DNA，線粒體DNA是真核細(xì)胞核外遺傳物質(zhì)，基因組中無間隔系列、無組織特異性、種內(nèi)遺傳穩(wěn)定、種間高度變異、個體不同組織中均含有大量的線粒體，可以獲得較高的拷貝數(shù)［18，19］，已作為此類研究的首選。編碼甘露醇脫氫酶的芹菜管家基因mtd以其種類高度保守性一直受到此類研究者的青睞［20］。因此，本研究特選擇大豆atp A基因和芹菜mtd基因作為研究對象，通過對反應(yīng)條件優(yōu)化及方法參數(shù)評價等，建立能同時檢測食品中大豆和芹菜致敏原成分的實時熒光PCR方法，旨為食品致敏原的標(biāo)簽監(jiān)管、檢測提供可靠的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣本 大豆、芹菜及各種動、植物樣本購自合肥市農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 主要試劑和儀器 Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR緩沖液購自TaKaRa生物工程公司，DNA提取試劑盒購自基因科技（上海）有限公司（Cat No：526-050）。實時熒光PCR儀為ABI公司7500系列產(chǎn)品。

1.1.3 引物與探針序列 根據(jù)GenBank中公布的大豆atp A基因（atp A，GenBank No. Z14031）和芹菜mtd（mtd，GenBank No. AF067082）基因序列，運(yùn)用ABI Primer Express 軟件，設(shè)計引物和探針序列（表1），引物和探針由上海生工生物工程公司合成。待測片段長度，如圖1所示。

表1 引物和探針序列

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA的提取 采用DNA提取試劑盒（離心柱型）進(jìn)行，提取方法詳見試劑盒使用說明書。

1.2.2 實時熒光PCR反應(yīng)條件的建立 通過普通PCR方法，優(yōu)化大豆atp A基因和芹菜mtd基因兩個單重PCR反應(yīng)的退火溫度。在此基礎(chǔ)上建立單重實時熒光PCR方法，反應(yīng)體系：10×Taq Buffer（含Mg2+）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，探針（5 μmol/L）1 μL，Taq酶（5 U/μL）1.25 U，模板DNA（1-100 ng/μL）2.5 μL，補(bǔ)水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：37℃ 5 min；95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，適宜的退火溫度退火延伸50 s，同時收集熒光，進(jìn)行40個循環(huán)。

在上述反應(yīng)體系基礎(chǔ)上采用等量模板，引物與探針兩兩組合（濃度同上），建立能同時擴(kuò)增大豆和芹菜成分的雙重實時熒光PCR反應(yīng)體系。以Ct 值、熒光增量為考察依據(jù)，優(yōu)化dNTP、Taq酶在雙重體系中的最適濃度，其中dNTP 的用量采用4 μL、5μL和6 μL進(jìn)行試驗，Taq酶的用量采用1.25 U、2.5 U和5 U進(jìn)行試驗，每次只改變一個變量。

1.2.3 大豆atp A基因和芹菜mtd基因特異性檢測 選取大豆、芹菜、大米、小麥、大麥、花生、芝麻、玉米、馬鈴薯、蕃茄、核桃、開心果、腰果、葵花籽、杏仁、蘋果、梨和草莓等植物類樣本和豬肉、牛肉、羊肉和魚肉等動物類樣本的基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板，以去離子水作為陰性對照模板，進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增。

1.2.4 大豆atp A基因和芹菜mtd基因靈敏度檢測 提取大豆、芹菜、大米基因組DNA后將濃度調(diào)整為100 ng/μL，然后將1 μL大豆DNA、1 μL芹菜DNA與8 μL大米DNA混合得到10%的大豆和10%芹菜DNA混和樣本。用TE將10%的大豆和芹菜DNA混和樣本進(jìn)行10倍系列稀釋從而獲得同體積條件下絕對含量相當(dāng)于1%、0.1%、0.01%和0.001%的大豆或芹菜DNA樣本，作為PCR反應(yīng)的模板，以去離子水作為陰性對照模板。

1.2.5 模擬實物樣品檢測 本研究采取摸擬實物樣本，以盲樣的方式進(jìn)行試驗。按照大豆、芹菜制品加工配方，制備含有大豆或芹菜的樣本4組，每組4個平行，樣本配方如表2所示。

圖1 大豆（A）和芹菜（B）基因擴(kuò)增片段

表2 摸擬實物樣本配方

2 結(jié)果

2.1 實時熒光PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與建立

為了獲得滿意的退火溫度，通過普通PCR方法，發(fā)現(xiàn)大豆atp A基因在60℃、58℃、芹菜mtd基因在62℃、60℃時均能有效擴(kuò)增，所以選擇60℃為兩個單重反應(yīng)適宜的退火溫度。在此基礎(chǔ)上，按1.2.2的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增，分別收集FAM熒光和HEX熒光，兩個單重反應(yīng)都能出現(xiàn)穩(wěn)定的擴(kuò)增曲線。

同時經(jīng)優(yōu)化篩選，在等量模板，兩對引物和探針濃度均一致的前提下，dNTP的用量為5 μL、Taq酶的用量為2.5 U時，雙重體系中的每個基因均能穩(wěn)定擴(kuò)增，且FAM熒光增量和HEX熒光增量相接近。其中陽性樣本以大豆和芹菜基因組DNA作為模板，陰性對照以去離子水作為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

圖2 大豆和芹菜致敏原成分實時熒光PCR擴(kuò)增曲線

2.2 方法特異性研究評價

為了獲得待選序列的特異性情況，按1.2.3進(jìn)行特異性實驗，結(jié)果表明，僅大豆atp A基因和芹菜mtd基因的DNA作為模板的陽性對照品能收集到明顯的熒光擴(kuò)增曲線，而其余20種常見動植物種類樣本的DNA及去離子水作為模板時，F(xiàn)AM和HEX熒光擴(kuò)增均為陰性（Ct＞40）。擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。因此本研究選擇的引物和探針序列特異性符合要求。

圖3 方法特異性研究擴(kuò)增曲線

2.3 方法靈敏度研究評價

為了獲得方法的最低檢出限，按1.2.4進(jìn)行靈敏度實驗，結(jié)果表明，以含10%、絕對含量相當(dāng)于1%、0.1%和0.01%的大豆atp A基因和芹菜mtd基因DNA樣本作為模板時，能收集到明顯的FAM熒光和HEX熒光擴(kuò)增曲線，而以絕對含量相當(dāng)于0.001%的大豆和芹菜的DNA樣本和去離子水作為模板時，F(xiàn)AM熒光和HEX熒光擴(kuò)增為陰性（圖4）。因此本方法的最低檢出限達(dá)0.01%。

圖4 方法靈敏度研究擴(kuò)增曲線

2.4 實際樣品檢測情況

為了對方法的實際結(jié)果進(jìn)行評價，采取摸擬實物樣本，以盲樣的方式進(jìn)行試驗。結(jié)果表明，樣本1四個平行均檢出大豆和芹菜成分，樣本2四個平行均檢出大豆成分，樣本3四個平行均檢出芹菜成分，樣本4四個平行均未檢出大豆或芹菜成分，檢測結(jié)果與實際情況完全吻合。

3 討論

傳統(tǒng)的依賴于蛋白質(zhì)的食品致敏原免疫學(xué)檢測方法，因食物在生產(chǎn)加工過程中蛋白質(zhì)易變性和降解而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，使得依賴于核酸的檢測方法，尤其是PCR法已成為當(dāng)前食品安全檢測機(jī)構(gòu)的主流檢測方法［13］。本研究運(yùn)用雙重實時熒光PCR技術(shù)，首次將大豆和芹菜兩種食品致敏原成分在同一個體系中實現(xiàn)同時檢測。方法主要從靶基因的選擇，雙重體系的優(yōu)化等方面著手，選擇大豆atp A基因和芹菜mtd基因作為靶基因，設(shè)計兩對具有相近的Tm值和熔解溫度的引物，擴(kuò)增片段長度分別為113 bp和150 bp；同時對雙重體系中dNTP、Taq酶濃度進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定dNTP的用量為5 μL、Taq酶的用量為2.5 U時在雙重體系中兩個反應(yīng)都能達(dá)到較好的效果。后續(xù)研究表明建立的方法行之有效。

當(dāng)然每種方法都有各自的優(yōu)越性，在致敏原檢測領(lǐng)域，一些新技術(shù)新方法的應(yīng)用，也是對 PCR 等常規(guī)檢測方法的豐富和發(fā)展。如以核酸為研究對象，Mustorp等［21］應(yīng)用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA），一次性從食品樣本中檢測出花生、芝麻等多種致敏原成分，該技術(shù)結(jié)合了DNA探針雜交和PCR技術(shù)，反應(yīng)的通量更大，特異性更強(qiáng)。劉昊等［22］應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）建立了一種食品中開心果致敏原的快速檢測方法，操作簡便，不需要通過昂貴的儀器用肉眼就能觀察到反應(yīng)結(jié)果。當(dāng)然因這些方法對樣本的純度要求高，操作不慎易受污染等因素目前還沒有得到廣泛應(yīng)用。同時以核酸為研究對象的檢測方法如PCR 等無法檢測到過敏蛋白，某些食品生產(chǎn)加工程序可能導(dǎo)致蛋白和 DNA分離，因此檢測結(jié)果不能與食物的真正致敏性相關(guān)，使得這類檢測方法也有一定的局限性。Cucu等［23］利用質(zhì)譜的方法快速檢測并篩選胰蛋白酶酶解的大豆片段的穩(wěn)定性，研究說明來自大豆球蛋白的G1401Val-Arg410和β-伴大豆球蛋白α'鏈518Gln-Arg528最穩(wěn)定，這些多肽可用來作為研發(fā)大豆過敏原檢測方法的靶肽。表明以致敏蛋白為研究對象的質(zhì)譜方法在未來致敏原檢測領(lǐng)域?qū)⒂泻艽蟮陌l(fā)展空間，它能彌補(bǔ)單純依賴核酸檢測方法的局限性和不足。

4 結(jié)論

本研究基于雙重實時熒光PCR技術(shù)，根據(jù)大豆atp A基因和芹菜mtd基因設(shè)計特異性引物，利用不同熒光素標(biāo)記的TaqMan探針，建立了一種實時熒光PCR檢測方法，可同時檢測食物中大豆和芹菜致敏原成分。并對方法的特異性和靈敏度等參數(shù)進(jìn)行評價，測試結(jié)果表明方法特異好，靈敏度高，對大豆和芹菜成分的檢出限均達(dá)0.01%。同時應(yīng)用本方法對摸擬實物樣本進(jìn)行試驗，檢測結(jié)果與實際情況完全吻合。因此本方法可以作為同時檢測食品中大豆和芹菜致敏原成分的高效檢測方法。

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（責(zé)任編輯狄艷紅）

Synchronously Detecting the Allergenic Ingredients of Soybean and Celery in Food by Real-time Fluorescent PCR

WANG Yong-xin CHENG Xiao AN Hong NIE Lei ZHANG Bo LIU Juan-juan
（National Center for Quality Supervision and Test of Agricultural-avocation Processed Food，Anhui Institute for Food and Drug Control，Hefei 230051）

Soybean and celery as food ingredients are allergen for some special groups of people. Designing the specific primers based on atp A gene of soybean and mtd gene of celery and utilizing TaqMan probes with different fluorescents， we set up a fluorescent real-time PCR method allowing the simultaneous detection of allergenic constituents of soybean and celery in food. The specificity of the method was evaluated using template DNAs from soybean or celery and other 20 species such as rice， wheat， barley， peanut， sesame， maize， murphy， tomato， walnut，pistachio， cashew nut， sunflower seeds， almond， apple， pear， strawberry， pork， beef， mutton and fish， only the specific amplifications of soybean and celery were observed. The limit of quantification was 0. 01% through sensitivity tests. In conclusion， the developed real-time PCR method is a specific， sensitive and efficacious assay for the simultaneous detection of allergenic soybean and celery in food.

fluorescent real-time PCR；soybean；celery；allergenic detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.012

2015-03-29

安徽省質(zhì)監(jiān)局科研項目（13zj37003）

汪永信，男，碩士，工程師，研究方向：分子生物學(xué)與食品安全檢測；E-mail：yxw118952@163.com