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    水通道蛋白1在膽囊黏膜中的表達(dá)及臨床意義

    2016-10-11 06:13:44朱春富張京平
    實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志 2016年17期
    關(guān)鍵詞:南京醫(yī)科大學(xué)膽囊炎膽汁

    高 源, 朱春富, 張京平

    (南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院 普外科, 江蘇 常州, 213000)

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    水通道蛋白1在膽囊黏膜中的表達(dá)及臨床意義

    高源, 朱春富, 張京平

    (南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院 普外科, 江蘇 常州, 213000)

    水通道蛋白1; 膽囊黏膜; 表達(dá)

    膽囊炎是肝膽外科常見疾病,其主要病因?yàn)槟懩医Y(jié)石形成。膽囊炎主要病理表現(xiàn)為膽囊壁水腫,膽囊內(nèi)膽汁淤積或結(jié)石形成[1]。水通道蛋白-1(AQP-1)主要參與黏膜內(nèi)外水分的轉(zhuǎn)運(yùn),有報(bào)道[2]稱其表達(dá)同炎癥、腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。本研究探討AQP-1與膽囊結(jié)石的相關(guān)性,現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 資料與方法

    1.1一般資料

    選取2015年10—12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院普外科接受膽囊手術(shù)切除的患者64例,其中膽囊結(jié)石45例,膽囊息肉19例。45例膽囊結(jié)石中,急性膽囊炎20例,慢性膽囊炎25例。男21例,女43例,平均年齡(39.15±14.65)歲。

    1.2方法

    免疫組化: 6 μm切片,石蠟固定標(biāo)本,經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度酒精水化。經(jīng)0.01 mol/L檸檬酸, 100℃下10 min抗原修復(fù)。3%的雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,一抗(1∶500 稀釋, Abcam 公司,美國(guó))4℃ 孵育過夜, PV9000 室溫孵育, DAB顯色,蘇木素復(fù)染。5%胎牛血清代替一抗為陰性對(duì)照。

    蛋白提取及 Western blot 檢測(cè):參照蛋白提取試劑盒(碧云天公司)說明書進(jìn)行。40 μg蛋白上樣后 80 V電泳,蛋白彌散后改為100 V繼續(xù)電泳,約 2 h。250 mA, 恒流濕轉(zhuǎn),65 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后 5%BSA 封閉 2 h, 加入一抗(Abcam公司,美國(guó))后4℃冰箱過夜。TBST洗膜3遍,每次15 min。 然后加入二抗后37℃恒溫箱孵育, TBST 洗膜 3 遍,每次15min。顯影液顯影,凝膠成像儀獲取圖像。

    PT-PCR: 總 RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(大連寶生物公司)。反轉(zhuǎn)錄PCR引物由英濰捷基公司合成。AQP-1上游引物: 5-CTGTGGGATTAACCCTGCTC-3; 下游引物: 5- GGTCTGTGAGGTCACTGCTG-3; GAPDH 上游引物: 5- ACAACTTTGGCATTGTGGAA -3; 下游引物: 5- GATGCAGGGATGATGTTCTG -3。由Labnet PCR儀完成擴(kuò)增。反應(yīng)條件: 95℃ 15 s 預(yù)變性,PCR 反應(yīng), 60℃ 20 s, 60℃ 20 s, 共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用相對(duì)定量法分析。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析,各組間AQP-1及AQP-8表達(dá)陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)。 Western blot 圖片用Image-J測(cè)灰度值; Western blot結(jié)果和RT-PCR結(jié)果均采用 Graphpad Prism5軟件,行單因素方差分析檢驗(yàn)作圖。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    免疫組化顯示,有結(jié)石形成的膽囊黏膜中AQP-1表達(dá)陽(yáng)性率為84%(38/45), 而在單純膽囊息肉的膽囊黏膜中AQP-1未見明顯表達(dá)。進(jìn)一步Western Blot檢驗(yàn)結(jié)果顯示,結(jié)石形成的膽囊黏膜中AQP-1表達(dá)顯著高于正常膽囊(圖1)。針對(duì)AQP-1的mRNA檢測(cè)同樣存在上述表達(dá)差異(圖2)。

    3 討 論

    有報(bào)道[2-5]稱AQP-1同時(shí)還表達(dá)于膽囊、多種腫瘤組織中,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中,其主要機(jī)制為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)淋巴、血管等。Verkman等[6-10]通過對(duì)正常小鼠膽囊黏膜中AQP-1表達(dá)的研究闡述AQP-1廣泛存在于小鼠黏膜層,其主要作用是向膽囊腔內(nèi)分泌水分,然而這樣的水分未改變膽汁成分,故認(rèn)為AQP-1對(duì)膽囊結(jié)石形成無(wú)意義。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)正常狀態(tài)、結(jié)石形成狀態(tài)下膽囊黏膜內(nèi)AQP-1的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)分析,結(jié)果顯示結(jié)石形成的膽囊黏膜內(nèi)AQP-1表達(dá)顯著高于正常膽囊組,且慢性炎癥組同急性炎癥膽囊黏膜組之間無(wú)顯著差異。針對(duì)AQP-1的mRNA表達(dá)測(cè)定同樣存在上述表達(dá)差異。

    A. 在膽囊結(jié)石的膽囊黏膜表面表達(dá)陽(yáng)性; B. 在膽囊息肉的膽囊黏膜表達(dá)陰性。圖1 AQP-1及AQP-8在不同狀態(tài)膽囊黏膜中的表達(dá)差異

    AQP-1、AQP-8同時(shí)表達(dá)于膽囊黏膜內(nèi)[11-12],AQP-1主要承載水的分泌功能,而AQP-8則充當(dāng)水分的重吸收功能。AQP-1在結(jié)石性膽囊黏膜中到表達(dá)增多的可能機(jī)制如下: ① 當(dāng)膽汁逐步黏稠層積,膽汁濃度增加,誘導(dǎo)黏膜內(nèi)AQP-1表達(dá)增強(qiáng),促進(jìn)水分分泌,以達(dá)到稀釋膽汁,減緩結(jié)石形成。② AQP-1表達(dá)增強(qiáng)、促進(jìn)水分的分泌,使膽囊腫脹,膽囊收縮功能下降,致使膽汁層積,進(jìn)而演變?yōu)榻Y(jié)石形成。上述可能機(jī)制均表明AQP-1同膽囊結(jié)石形成存在一定的聯(lián)系。

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    2016-04-15

    江蘇省常州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(CJ20140037)

    張京平, E-mail: zjpcz2016@126.com

    R 575.6

    A

    1672-2353(2016)17-193-02

    10.7619/jcmp.201617074

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