桑葉中黃酮類成分在大鼠體內分布特征研究

王冰，孫艷濤

(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連　116600)

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桑葉中黃酮類成分在大鼠體內分布特征研究

王冰，孫艷濤

(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連116600)

目的研究桑葉中黃酮類成分的歸經(jīng)特征。方法采用有效成分的組織分布分析桑葉中黃酮類成分與歸經(jīng)的關系。結果蘆丁和總黃酮在大鼠各組織中分布廣泛，蘆丁在胃中分布最多，其余臟器中大部分有二次分布特點；總黃酮在肝中分布最多，在大腸中分布較多。結論桑葉總黃酮的分布特征與桑葉歸肝、肺經(jīng)相符合。

桑葉/藥代動力學;黃酮類;蘆丁;大鼠,Sprague-Dawley

桑葉為?？浦参锷orusalbaL.的干燥葉，甘，苦，寒，歸肺、肝經(jīng)。具有疏散風寒，清肺潤燥，清肝明目的作用[1]?，F(xiàn)代研究表明桑葉富含多糖、黃酮、生物堿、蛋白質、氨基酸、維生素、微量元素等活性成分，具有降血糖、調血脂抗應激、抗衰老、抗凝血等功效[2-6]。目前關于桑葉研究較多，但多集中于食品和保健品類研究，作為桑葉中的黃酮類成分——蘆丁研究較多[7]；關于桑葉有效成分的體內研究報道較少，如蔣立娣[8]以木犀草素為內標，對口服桑葉提取物后大鼠血漿中的槲皮素、山奈酚和異鼠李素進行了分析，結果三者在大鼠體內分布迅速，消除緩慢。曹旭等[9]采用灌胃給藥方式，分析了桑葉總生物堿中1-脫氧野尻霉素在大鼠體內的藥動學研究，結果該成分在大鼠體內符合二房室模型。為深入分析桑葉中黃酮類成分在大鼠體內的代謝特征，本研究以黃酮類成分為研究對象，分析桑葉中黃酮類成分單體與總成分在各組織中的分布差異，探索黃酮類成分的分布特征。

1　實驗材料

1.1儀器Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm,5 μm)色譜柱；高效液相色譜儀( LC-10AT型雙泵，配有二元梯度泵，在線脫氣機,配有SPD-10AVP紫外檢測器，微量進樣針；日本島津公司)；UV-mini-1240紫外分光光度計(SHIMADZU)，循環(huán)AS3120A超聲波清洗機；MA110型電子天平(上海第三分析儀器廠)，F(xiàn)S-2型可調高速分散器(江蘇省金壇市榮華儀器制造),80-2型離心機，XK96型快速混勻器(新康制造)。

1.2試藥蘆丁對照品(購于中國藥品生物制品檢定所,批號:10080-9504)；純凈水(娃哈哈純凈水)；乙醇(天津市科密歐化學試劑有限公司,色譜純),水為重蒸餾水,甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司,色譜純),乙腈；桑葉藥材(市售)經(jīng)鑒定為藥典所載種。

1.3動物SD大鼠,雌雄各半，體質量(200±20)g，購于遼寧長生生物科技有限公司，資質號：SYXK(遼)2013-0009。

1.4對照品儲備液的制備取蘆丁對照品適量，精密稱定，用甲醇制成每1 mL含0.98 mg的溶液，即得。

2　桑葉中黃酮類成分歸經(jīng)分析

2.1桑葉提取液的制備取桑葉粉末(過3號篩)約50 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入1 500 mL 90%乙醇，加熱回流1 h，冷卻后濾過,揮干乙醇,殘渣用純凈水稀釋至50 mL,即得。

2.2動物組織的處理方案取大鼠組織0.35 g精密稱定，加入0.35 mL 0.9%生理鹽水溶液，勻漿；轉移至生理鹽水潤洗過的樣品管中，精密加入3 mL甲醇，渦旋1 min，4 000 r·min-1離心20 min，精密吸取上清液2 mL，備用。

2.3桑葉中蘆丁的分布特征

2.3.1色譜條件Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)色譜柱；流動相：乙腈-水溶液(20∶80)；檢測波長：330 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。

2.3.2組織處理方案按“2.2”項目處理后，于40 ℃水浴吹干上清液，精密加入50 μL甲醇，渦旋1 min，精密吸取10 μL進樣分析。

2.3.3線性關系和專屬性考察取空白肝組織5份，分別按“2.2”項目處理后，精密加入蘆丁對照品儲備溶液10、20、30、40、50 μL，于40 ℃水浴吹干，精密加入50 μL甲醇，渦旋1 min，精密吸取10 μL進樣分析。以峰面積Y為縱坐標，濃度X(mg·L-1)為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=0.000 005 1X+0.019 3，r=0.993 2。符合中藥藥代動力學研究r>0.99的要求[10]，色譜圖見圖1。

2.3.4方法學考察取不同大鼠臟器分別進行精密度考察、加樣回收率和絕對回收率、凍融次數(shù)、短期穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性關系考察，結果RSD<2%，符合中藥藥代動力學要求。

2.3.5大鼠各組織中的蘆丁含量差異SD大鼠4只，3只鼠按灌胃桑葉提取液4 mL，在相應時間點處死，按“2.3.2”項目處理，在“2.3.1”色譜條件下分析，結果見表1。

2.4桑葉中總黃酮的分布特征

2.4.1樣品及空白組織處理方案按“2.2”項目處理后，吸取上清液用甲醇稀釋至10 mL。

2.4.2對照組樣品制備按“2.2”項目處理后，吸取上清液,加入對照品儲備液50 μL用甲醇稀釋至10 mL，即為對照品溶液。

2.4.3大鼠各組織中總黃酮的含量分析4只大鼠隨機分成4組,其中2只灌胃供試品4 mL,1.5 h后取出心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃用生理鹽水清洗干凈,作為給藥組,另外2只不灌胃,同樣處理分別作為空白組和對照組。在500 nm波長下采用分光光度計采用外標一點法分析各組織中總黃酮的含量,結果見表2。

A.空白肝組織

B.灌胃給藥2 h肝

C.對照品

D.空白肝加對照品

3　討論

在進行實驗之前，對乙醇濃度、提取時間、溶劑量和提取次數(shù)進行了考察，以總黃酮為考察指標經(jīng)過正交實驗分析，確定桑葉中總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇濃度為90%，提取時間為1 h，固液比為1∶30，提取次數(shù)為2次。

表1　不同時間點大鼠各組織中的蘆丁含量結果表

表2　總黃酮測定結果

桑葉總黃酮提取實驗經(jīng)驗證性實驗測得的吸光度值為0.449 9，計算得總黃酮含量為423.97 g·L-1。與正交實驗結果比較，符合最佳工藝要求。

2 h蘆丁分布結果與1、3 h分布結果存在一定特異性?？赡茉蚴翘J丁為蕓香苷，可在酸性條件下水解為槲皮素。胃中含有大量胃酸可能為蘆丁轉化的主要器官，2 h的分布結果顯示蘆丁在胃中大量分布，在其他臟器分布顯著降低可能與此有關。

根據(jù)桑葉中蘆丁在大鼠各組織中的分布特征，可見蘆丁在各組織中分布廣泛。1 h分布結果顯示在心、肝中分布較少，其他臟器相差不大。3 h除心、肝外蘆丁在各臟器中分布顯著增加，在脾中最高，胃中含量有所下降，可能3 h開始是蘆丁在各臟器中分布增加的開始。總的來看，蘆丁各臟器中均有分布，1～3 h內在各臟器中含量均有所增加，但肝、肺與其他臟器中蘆丁含量相比較低，這與桑葉歸肝、肺經(jīng)不符。其原因可能是采樣時間不當，應對多個時間點的蘆丁分布進行分析；也可能是蘆丁為蕓香苷，在酸性及酶條件下，可能水解，當對大鼠口服給藥后，藥液經(jīng)胃、小腸和大腸等消化道時，其中的酸和酶會導致蘆丁的水解，進而導致在各組織中蘆丁含量降低，對蘆丁的體內分布產(chǎn)生影響；更可能蘆丁僅為桑葉中多種成分中的一種，無法全面體現(xiàn)桑葉歸經(jīng)的特征。

根據(jù)桑葉總黃酮的體內分布實驗數(shù)據(jù)可見，總黃酮在大鼠體內分布廣泛，大鼠的心，肝，脾，肺，腎，大腸，小腸，胃都有分布，其中肝中分布最多，大腸分布也較多，大腸和肺互為表里，上述數(shù)據(jù)與桑葉歸肝、肺經(jīng)相符合?？傸S酮在胃和小腸分布較多，可能與胃和小腸為主要吸收器官有關。

[1]國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:279.

[2]林天寶,李有貴,呂志強,等.桑樹資源綜合利用研究進展[J].蠶桑通報,2008,39(3):1-4.

[3]汪少發(fā).桑葉的藥理價值與綜合利用[J].蠶桑茶葉通報,2008(1)：11-12.

[4]原愛紅,黃哲,馬駿，等.桑葉黃酮的提取及其降糖作用的研究[J].中草藥，2004,35(11):1242-1243.

[5]丁盈,蔣梅香,周應軍,等.桑葉降糖活性成分研究[J].中國藥物化學雜志,2007,17(6):386-389.

[6]應芝,孟磊,閻超,等.桑葉的降糖活性成分和藥理作用[J].中草藥,2002,35(5):471-473.

[7]鄭芳,朱雪松,李鵬,等.HPLC-DAD法測定“武當三號金銀花”不同部位中蘆丁和木犀草苷的含量[J].安徽醫(yī)藥,2015,19(12)：2302-2305.

[8]蔣立娣.桑葉提取物中黃酮類化合物在大鼠體內的藥動學研究[D].杭州：浙江大學，2011.

[9]曹旭，歐陽臻，趙明，等.桑葉總生物堿中1-脫氧野尻霉素在大鼠體內的藥物動力學研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2012,23(4)：449-452.

[10] 張振秋.體內中藥分析[M].沈陽：遼寧大學出版社，2008：23.

Distribution characteristics of total flavonoids in mulberry leaves

WANG Bing，SUN Yantao

(CollegeofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Dalian,Liaoning116600,China)

ObjectiveTo explorethe channel tropism characteristics of total flavonoids from Mulberry leaves.MethodsWe analyzed the relationship between total flavonoids from Mulberry leaves and channel tropism based on tissue distribution of effective components.ResultsRutin and total flavonoids were widely distributed in various tissues of rats.Rutin was most widely distributed in the stomach and had the characterstics of twice distribution in other organs.Total flavonoids were most widely distributed in the liver,followed by the large intestine.ConclusionsThe distribution characteristics of total flavonoids in mulberry leaves are in accordance with channel tropisms of the liver and lung.

Folium mori/pharmacokinetics;Flavones;Rutin;Rats,sprague-dawley

孫艷濤,男，博士，副教授,研究方向:中藥分析，E-mail:sunyt_ky@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.014

2015-11-26，

2016-06-20)