蓮黃子復(fù)方對裸鼠膀胱癌T24細(xì)胞移植瘤的抑制作用*

任瑞鋒， 彭艷軍， 羅　英， 趙文艷， 趙連梅， 單保恩**

(1.華北油田總醫(yī)院， 河北 任丘　062552； 2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院， 河北 石家莊　050011)

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蓮黃子復(fù)方對裸鼠膀胱癌T24細(xì)胞移植瘤的抑制作用*

任瑞鋒1， 彭艷軍1， 羅英1， 趙文艷1， 趙連梅2， 單保恩2**

(1.華北油田總醫(yī)院， 河北 任丘062552； 2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院， 河北 石家莊050011)

目的： 研究蓮黃子(半邊蓮、大黃、五加皮、決明子)復(fù)方對膀胱癌T24細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用。方法： Nu/Nu裸鼠接種T24細(xì)胞構(gòu)建膀胱癌T24細(xì)胞移植瘤模型，15只模型裸鼠隨機(jī)分為蓮黃子復(fù)方低劑量治療組、高劑量治療組和對照組，每組5只；治療組裸鼠分別予2.5 mL/kg或5 mL/kg蓮黃子復(fù)方藥液灌胃治療，對照組予5 mL/kg生理鹽水灌胃，治療當(dāng)天定義為0天；其后，隔日灌胃，總計7次；治療后1天開始隔日測量裸鼠移植瘤的體積，末次治療后第2天處死裸鼠，稱量瘤體重量；采用ELISA法檢測裸鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、γ-干擾素(IFN-γ)含量；免疫組織化學(xué)法檢測裸鼠移植瘤組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl2和BaX及抑癌基因PTEN的表達(dá)。結(jié)果： 治療前各組模型裸鼠移植瘤體積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療結(jié)束時，兩種劑量治療組裸鼠的腫瘤體積和重量均明顯小于對照組(P<0.05)；同時，相比對照組，兩種劑量治療組裸鼠血清TNF-α含量均明顯升高，而GM-CSF、IFN-γ含量則明顯降低 (P<0.05)；移植瘤組織中Bcl2 表達(dá)在高劑量治療組、低劑量治療組及對照組間呈現(xiàn)遞增的趨勢，而Bax和PTEN表達(dá)則呈遞減趨勢，且組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。結(jié)論： 蓮黃子配方對膀胱癌T24細(xì)胞裸鼠移植瘤有明顯的抑制作用，其機(jī)制可能與其誘導(dǎo)PTEN和Bax的表達(dá)及抑制Bcl2的表達(dá)有關(guān)。

蓮黃子配方； 膀胱癌； T24細(xì)胞； 抑瘤率； 模型； 細(xì)胞凋亡

膀胱癌具有高復(fù)發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率的特點，在我國發(fā)病率有逐年上升的趨勢[1]。臨床治療膀胱癌常采用化學(xué)治療或手術(shù)治療，化學(xué)治療一直使用順鉑類化療藥物，但順鉑單藥化療的副作用較大，而采用手術(shù)治療效果也不理想[2]，從中草藥中尋找以天然抗癌活性成分為基礎(chǔ)的藥性強(qiáng)、作用獨特、毒性小的治療膀胱癌的新藥顯得尤其重要。單一的中藥半邊蓮、大黃，在細(xì)胞實驗及動物實驗中具有一定的抗腫瘤作用 ，決明子可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[3]。蓮黃子復(fù)方(半邊蓮、大黃、五加皮、決明子)是否能有效抑制膀胱癌T24細(xì)胞目前少見報道。本研究通過建立Nu/Nu裸鼠的膀胱癌T24細(xì)胞移植瘤模型，并給予不同劑量的蓮黃子復(fù)方藥液灌胃治療。通過測定裸鼠血清中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)含量，以及瘤體組織中凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(BaX)的表達(dá)及抑癌基因PTEN的表達(dá)，來深入探討蓮黃子復(fù)方對裸鼠膀胱癌T24細(xì)胞移植瘤的抑瘤效應(yīng)及機(jī)制。

1　材料及方法

1.1主要材料

Nu/Nu裸鼠(雄性，4～6周齡，體質(zhì)量15～20 g)18只，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部。膀胱癌T24細(xì)胞株，由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。所有裸鼠飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動物實驗中心無特定病原體級屏障系統(tǒng)中。蓮黃子復(fù)方藥劑由樂仁堂制備提供(成分主要為半邊蓮、大黃、五加皮及決明子)，常規(guī)煎煮水浴濃縮成相當(dāng)于原生藥材2 g/mL的藥液，4 ℃冰箱冷藏備有。RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，胎牛清購自杭州四季青工程材料有限公司。兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體及兔抗人PTEN多克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人膀胱癌癌細(xì)胞株T24培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長，隔日傳代1次。

1.2.2人膀胱癌移植瘤模型構(gòu)建及分組選取處于對數(shù)生長期的T24細(xì)胞，常規(guī)消化細(xì)胞，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌離心1次后，用無菌生理鹽水重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/L，取0.2 mL細(xì)胞懸液于裸鼠背部行皮下注射，隨后繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF環(huán)境。每日觀察接種部位，待出現(xiàn)質(zhì)地較硬結(jié)節(jié)時提示造模成功。本研究共移植裸鼠18只，成功15只。將造模成功的裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對照組、低劑量治療組及高劑量治療組，每組裸鼠5只。低劑量治療組與高劑量治療組分別給予2.5 mL/kg或5 mL/kg蓮黃子復(fù)方藥液灌胃，對照組以5 mL/kg生理鹽水灌胃，灌胃當(dāng)天定義為0天。其后隔日灌胃1次，共計7次。其間隔日測量裸鼠移植瘤體積。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1瘤體生長情況各組裸鼠在SPF條件下飼養(yǎng)，隔日定時用游標(biāo)卡尺測量移植瘤最大長徑(a)、短徑(b)，計算腫瘤體積，腫瘤體積=(a2×b)/2，并繪制腫瘤生長曲線。

1.3.2腫瘤抑制率、細(xì)胞因子測定末次灌胃次日處死裸鼠，稱量瘤體重量。計算抑制率，抑制率(%)= (對照組平均瘤體質(zhì)量-治療組平均瘤體質(zhì)量)/對照組平均瘤體質(zhì)量)×100%。ELISA檢測裸鼠血清中TNF-α、GM-CSF及IFN-γ含量。

1.3.3瘤體組織Bcl-2、BaX及PTEN的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)法檢測瘤體組織內(nèi)Bcl2、BaX及PTEN的表達(dá)。瘤體常規(guī)取材、制片，分別予兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體及兔抗人PTEN多克隆抗體(濃度1∶200)4 ℃ 冰箱孵育過夜，經(jīng)PBS反復(fù)漂洗3次后，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG(濃度1∶100)，于37 ℃孵育1 h，經(jīng)DBA顯色、蘇木素復(fù)染后，于顯微鏡下觀察。在光學(xué)顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)著色，呈棕黃色顆粒狀分布。隨機(jī)選取5 個高倍視野，每個視野計數(shù)500 個細(xì)胞。以陽性細(xì)胞所占百分率進(jìn)行評分：≤10%為0分，>10%～≤50%為1分，>50%～≤75%為2分，>75%為3分。再按染色強(qiáng)度進(jìn)行評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。上述2項評分相加，0 分為“-”，1～2 分為“+”，3 ～4 分為“++”，5～6 分為“+++”，將“ -”和“+”定義為陰性表達(dá)，“++”和“+++”定義為陽性表達(dá)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1移植瘤的體積、重量

T24細(xì)胞移植后4周，裸鼠移植部位可見明顯的移植瘤，直徑0.4～0.5 cm。在蓮黃子復(fù)方進(jìn)行治療前，各組裸鼠腫瘤體積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)蓮黃子復(fù)方灌胃治療的第13天，低劑量和高劑量治療組裸鼠的腫瘤體積和重量均明顯小于對照組(P<0.05)，提示蓮黃子復(fù)方對T24細(xì)胞得腫瘤生長具有明顯抑制作用。見圖1和表 1。

對照組　　低劑量治療組　　高劑量治療組圖1　用藥結(jié)束后3組裸鼠移植瘤Fig.1　Comparison of tumor volume in three groups after medication

灌胃移植瘤體積(mm3)對照組低劑量治療組高劑量治療組第1天56.58±15.3962.58±10.0956.03±12.57第3天63.93±16.0769.61±15.1062.12±13.87第5天82.74±24.1778.08±19.1269.93±17.16第7天106.07±23.1388.69±23.5377.05±20.13第9天132.76±43.24109.92±35.2491.76±29.67第11天242.52±82.23193.11±65.43156.65±54.96第13天381.44±113.53307.82±94.87(1)212.92±83.56(1)(2)

(1)與對照組比較，P<0.05，(2)與低劑量治療組比較，P<0.05

2.2蓮黃子復(fù)方對移植瘤抑制率的影響

治療結(jié)束后，低劑量治療組和高劑量治療組裸鼠的瘤體重量均明顯小于對照組 (P<0.05)，并且高劑量治療組的腫瘤抑制率高于低劑量治療組。見表2。

表2　3組裸鼠移植瘤瘤重和抑制率比較

(1)與對照組比較，P<0.05

2.3血清TNF-α、GM-CSF、IFN-γ含量及瘤體Bcl-2、Bax、PTEN的表達(dá)

與對照組比較, 治療組裸鼠血清TNF-α含量明顯升高，GM-CSF和IFN-γ的含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在高劑量治療組、低劑量治療組及對照組移植瘤組織，Bcl-2的表達(dá)呈逐漸升高的趨勢，而Bax和PTEN的表達(dá)則呈逐漸降低的趨勢，并且各組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表3及表4。

圖2　3組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、Bax、PTEN表達(dá)Fig.2　The expression of Bcl-2, Bax and PTEN of xenografted tumor tissue in three groups

指標(biāo)對照組低劑量治療組高劑量治療組TNF-α7.5±2.2717.17±6.32(1)17.28±10.60(1)GM-CSF81.63±37.3362.76±10.94(1)60.30±10.42(1)IFN-γ22.5±5.3216.83±3.12(1)17.9±2.83(1)

(1)與對照組比較，P<0.05

表4　3組裸鼠移植瘤組織Bcl-2、PTEN、BaX的陽性表達(dá)(n,%)

(1)與對照組比較，P<0.05

3　討論

膀胱癌是一種常見的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，占中國惡性腫瘤發(fā)病的2.5%，臨床上抗腫瘤藥物大多通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗癌作用的。作為中藥復(fù)方制劑的蓮黃子復(fù)方，其抗癌機(jī)制同樣有可能與某些凋亡蛋白有關(guān)，但目前尚未通過相關(guān)研究予以證實。作為促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞因子，GM-CSF在多種實體瘤中均有表達(dá)，可以顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，同時還能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)創(chuàng)面的愈合[4-6]。而作為一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，TNF-α可以通過介導(dǎo)抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。諸多研究提示，中藥的某些成份具有加速腫瘤病人的康復(fù)[7]。而蓮黃子復(fù)方中的有效成分即有可能通過促進(jìn)吞噬細(xì)胞中TNF-α的分泌而直接發(fā)揮抗膀胱癌的作用,也可能通過促進(jìn)TNF-α的分泌正反饋促進(jìn)吞噬細(xì)胞的增殖與分化, 間接發(fā)揮抗腫瘤的免疫功效[8-9]。本研究結(jié)果顯示，蓮黃子復(fù)方灌胃后裸鼠血清中的TNF-α含量明顯高于僅使用生理鹽水灌胃裸鼠，GM-CSF、IFN-γ含量反而降低(P<0.05)，說明蓮黃子復(fù)方中的中藥成分可以提高裸鼠血清中TNF-α含量，降低GM-CSF、IFN-γ含量，從而達(dá)到抑制膀胱癌T24細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長。

蓮黃子復(fù)方抑制膀胱癌T24裸鼠移植瘤的藥理作用和機(jī)制是其主要成分半邊蓮?fù)ㄟ^提高癌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[10-11]。蓮黃子復(fù)方中的大黃富含大黃素(emodin)，可能產(chǎn)生活性氧(ROS)，在多種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)凋亡的過程中起著介導(dǎo)和調(diào)節(jié)主要角色[12]。而復(fù)方中的五加皮對腫瘤細(xì)胞同樣具有抑制作用[13]。本課題組前期研究已經(jīng)明確，五加皮抗腫瘤活性物質(zhì)是一種分子量大小約64 kDa的蛋白質(zhì)，而復(fù)方中的決明子在免疫方面對巨噬細(xì)胞吞噬功能有一定的增強(qiáng)作用[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量蓮黃子復(fù)方治療后裸鼠移植瘤的體積和重量明顯低于對照組，高劑量蓮黃子復(fù)方更明顯，這提示，大黃、半邊蓮、五加皮、決明子的單體和聯(lián)合作用使得蓮黃子配方對膀胱癌T24裸鼠移植瘤的生長有明顯的抑制作用。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在高劑量、低劑量蓮黃子復(fù)方治療組及對照組的裸鼠移植瘤中Bcl-2的表達(dá)呈逐漸遞增的趨勢，而Bax和PTEN表達(dá)則逐漸遞減 (P<0.05)，這表明，蓮黃子復(fù)方的抗腫瘤作用機(jī)制可能是復(fù)方中的中藥成分在提高了某些促凋亡蛋白和抑癌基因的表達(dá)的同時降低了抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

然而，值得注意的是，癌癥的發(fā)生本身就是一個非常復(fù)雜的病理過程，涉及諸多的誘因及細(xì)胞信號通路。盡管本研究初步驗證了蓮黃子復(fù)方對膀胱癌T24細(xì)胞的抗腫瘤作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了淺嘗輒止的探索，然而距離其作為一種行之有效的治療方法在臨床廣泛應(yīng)用尚有很遠(yuǎn)的距離，對此，本課題組將在今后的研究工作中進(jìn)一步深入探討。

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(2016-05-10收稿，2016-08-19修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Inhibitory Effect of Lian-huang zi Compound on Human Bladder Cancer T24 Cells Xenografted Tumor in Nude Mice

REN Ruifeng1, PENG Yanjun1, LUO Ying1, ZHAO Wenyan1, ZHAO Lianmei2, SHAN Baoen2

(1.TheGeneralHospitalofHuabeiOil-fieldsCompany,Renqiu062552,Hebei,China; 2.TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,Hebei,China)

Objective: To investigate the inhibitory effects of lian-huang zi compound to human bladder cancer T24 cells xenografted tumor in nude mice. Methods: The Nu/Nu nude mice model of xenografted tumor was established by injection of human bladder cancer T24 cells. Fifteen model mice were randomly divided into 3 groups: low dose lian-huang zi compound treatment group, high dose lian-huang zi compound treatment group, and control group. Mice in treatment group received gastric feeding of 2.5 mL/kg lian-huang zi compound(low dose group), 5 mL/kg lian-huang zi compound(high dose group) while mice in control group received gastric feeding of 5 mL/kg 0.9% sodium chloride. The first administration day was termed as day 0. Then, mice received gastric feeding once every two days and totally received 7 times gastric feeding. The tumor volume of mice was measured once every two days from 1 day after administration. The mice were sacrificed after the next day of last administration, and the mice weight and the tumor weight were measured. The serum of mice in each group was collected, and the expression of TNF-α, GM-CSF and IFN-γ were analyzed by ELlSA. The expression of apoptosis associated protein bcl-2 and bax, associated antioncogene PENT in xenografted tumor were detected by immunocytochemistry. Results: There were no difference between the size of xenografted tumor in each group before administration (P>0.05). After treatment, the size or weight of xenografted tumor in the 2 treatment groups were significantly decreased compared with control group (P<0.05). Compared with control group, the content of serum TNF-α significantly increased in the treatment group (P<0.05) while the content of serum GM-CSF and IFN-γ significantly decreased (P<0.05). The expression of apoptosis associated protein Bcl-2 in xenografted tumor increased gradually from the high dose treatment group to the low dose treatment group and control group (P<0.05). The expression of Bax or PTEN in xenografted tumor declined from the high dose treatment group to the low dose treatment group and control group (P<0.05). Conclusions: The lian-huang zi compound can inhibit the growth of human bladder cancer T24 cells xenografted tumor on the nude mice, which may be correlated partly with its induced expression of PTEN and Bax, and its inhibitory effect on the expression of Bcl2.

Lian-huang zi compound; bladder cancer; T24 cells; tumor inhibition rate; models; cell apoptosis

河北省自然科學(xué)基金課題(H2015206376)

E-mail:shanbaoen@163.com

R737.14

A

1000-2707(2016)09-1042-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.012

**

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-09-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.008.html