葡萄籽提取物中原花青素含量測定

鄧耀，楊立亭，廖國周*（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明650201）

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葡萄籽提取物中原花青素含量測定

鄧耀，楊立亭，廖國周*
（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明650201）

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合葡萄籽提取物的實(shí)際情況， 并參照國內(nèi)外最新的檢測分析方法， 建立了用HPLC對原花青素的含量進(jìn)行定性定量分析的檢測方法。方法：采用A流動相乙腈，B流動相2%乙酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，A從0到30%，進(jìn)樣量10μL，流速0.5ml/min，柱溫30℃，檢測波長280nm。結(jié)果：尖峰葡萄籽提取物中各單體的含量沒食子酸為0.939mg/g，兒茶素為73.496mg/g，表兒茶素為17.071mg/g，表兒茶素沒食子酸酯為3.106mg/g，精確度RSD=2.9%，回收率為96%-109%，此法具有準(zhǔn)確、靈敏、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，該法必須具備所有被測組分的標(biāo)準(zhǔn)品才能定性定量。

HPLC；葡萄籽提取物；原花青素

多酚類物質(zhì)是一類含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，在苯環(huán)不同部位有羥基取代。葡萄中含有的豐富多酚類物質(zhì)是葡萄重要的次生代謝產(chǎn)物。葡萄的各個部位都含有不同程度的多酚類物質(zhì)。隨著研究的不斷深入，國內(nèi)外研究人員發(fā)現(xiàn)，葡萄籽里的多酚類物質(zhì)不論是含量還是種類都比其他部位豐富得多。

葡萄籽提取物（Grape Seed Extract）是從釀酒葡萄的種子中提取出來的一種多酚物質(zhì)混合物，其中的原花青素具有極強(qiáng)的抗氧化性，是一種極強(qiáng)的體內(nèi)活性功能因子。其產(chǎn)品最基本的用途是做抗氧化劑，用來清除體內(nèi)過多的氧自由基，從而起到保健和防病的作用。近期的一些研究表明葡萄籽提取物中原花青素在一定條件下能夠抑制燒烤羊肉中雜環(huán)胺［1］的形成，具體機(jī)理還在研究中。葡萄籽提取物中的原花青素主要由沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯等這些種單體組成。原花青素是具有不同聚合度的一類多酚物質(zhì)，聚合度不同，分子極性不一樣，用流動相洗脫出現(xiàn)峰的時間也不一樣，根據(jù)此原理可以把具有相同極性的物質(zhì)通過HPLC分離開來，葡萄籽提取物中所有的物質(zhì)在進(jìn)行HPLC分析的時候都有出峰，本次試驗(yàn)通過測定峰面積和校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定各單體的含量。

1 、材料與方法

1.1 材料

葡萄籽提取物：天津尖峰生物科技研究公司。

1.2 儀器

安捷倫1200液相色譜儀器，色譜柱：Nova-Pak C-18，4.6×150mm，5μm，離心機(jī)，Amberlite XAD-16柱。

1.3 試劑

乙腈：色譜純（美國天地公司）乙酸：色譜純（美國天地公司），超純水，無水乙醇，甲醇，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：sigma公司，純度99%；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品：sigma公司， 純度99%，表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品： sigma公司，純度99%；表兒茶素沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品： sigma 公司，純度99%。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品配制

葡萄籽提取物以70%乙醇在60℃下提取2次，合并提取液，提取液減壓濃縮后以6000r/min，離心40min得上清液，上清液通過Amberlite XAD-16柱進(jìn)行分離，以不同配比的乙醇-水溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液通過HPLC-DAD在線監(jiān)測，收集性質(zhì)相同的餾分。本試驗(yàn)中主要針對葡萄籽提取物中沒食子酸，（+）兒茶素，（-）表兒茶素，表兒茶素沒食子酸酯主要化學(xué)成分進(jìn)行分析和含量測定。

標(biāo)準(zhǔn)品配制：精確稱取沒食子酸22mg，兒茶素12mg，表兒茶素沒食子酸酯12mg，表兒茶素10mg，放入250ml的容量瓶，先加入150ml甲醇超聲溶解10min，用超純水定容。按1：2，1：4，1：8，1：16，1：32配制濃度梯度備用。

1.4.2 流動相條件

檢測波長：280nm，流速：0.5ml/min，進(jìn)樣量：10μL，柱溫：30℃，流動相A：乙腈，流動相B：2%乙酸水溶液，色譜柱型號：Nova-Pak C18，150×4.6mm，5μm，洗脫梯度條件如表1。

表1 洗脫梯度Table1 The elution gradient

得到的結(jié)果可用如下公式計(jì)算單體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）= （c×d×v）/w×100%。其中c表示濃度（mg/mL），d表示稀釋的倍數(shù)，v表示體積（mL），w表示質(zhì)量（mg）。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取沒食子酸22mg，兒茶素12mg，表兒茶素沒食子酸酯12mg，表兒茶素10mg，放入250ml的容量瓶，先加入150ml甲醇超聲溶解10min，用超純水定容，配制成不同濃度梯度，通過高效液相色譜進(jìn)行分析，測定結(jié)果以峰面積為縱坐標(biāo)，保留時間為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定及回歸方程

對四種單體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC檢測，得到標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜，如圖一所示

圖1 四種標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Figure 1 HPLC chromatogram of four standards

1.沒食子酸 2.兒茶素 3.表兒茶素 4.表兒茶素沒食子酸酯

從圖1看，根據(jù)單標(biāo)對比可知從左往右依次是溶劑峰，沒食子酸，兒茶素，表兒茶素，表兒茶素沒食子酸，保留時間分別為7.351，17.750，23.646，34.766. 以濃度c對峰面積A進(jìn)行回歸，所得4種單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1，4種單體在1μg-22μg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 回歸方程Table2 The regression equation

2.2 方法的精密度和回收率試驗(yàn)

2.2.1 精密度試驗(yàn)：取配制的樣品10μL連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積積分結(jié)果RSD.得RSD=2.9

2.2.2 回收率試驗(yàn)：分別稱取2份樣品各100mg放入10ml容量瓶，用甲醇溶解，向其中一瓶內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品1mg，分別測定樣品的含量并計(jì)算回收率，重復(fù)5次，得到的回收率為96%-109%。

2.3 葡萄籽中各單體種類及含量

圖2 GES液相色譜圖Figure 2 HPLC of GSE

圖1與圖2分別是標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的液相色譜圖，由圖1可知該方法可以準(zhǔn)確地分離和檢測原花青素中的幾種單體，且各組分峰尖銳、峰形對稱，40min左右原花青素可被全部洗脫。由圖2可知在與標(biāo)準(zhǔn)品相同的保留時間能均出現(xiàn)峰，分別對照1、沒食子酸2、兒茶素 3、表兒茶素4、表兒茶素沒食子酸酯。由圖2可知，在保留時間40分鐘后比較平穩(wěn)，無峰出現(xiàn)，取保留時間0-40min內(nèi)出現(xiàn)的峰圖表示該圖的結(jié)果是可靠的。

由圖1，圖2和表1可得到葡萄籽提取物中各單體的含量，沒食子酸為0.939mg/g，兒茶素為73.496mg/g，表兒茶素為17.071mg/g，表兒茶素沒食子酸酯為3.106mg/g。從圖2可以看出，葡萄籽提取物中多酚含量豐富，原花青素含量占總多酚含量的9.46%，與采用其他方法得出的結(jié)果相符合，樣品提取工藝和GSE的品種不同也會導(dǎo)致最后的結(jié)果有差異。

3 、結(jié)論與討論

原花青素的測定有很多種方法，其中鐵鹽催化比色法［6］次方法簡便適用，對原花青素的選擇性反應(yīng)較好，主要適用于批量樣品的檢測；香草醛法［7］，采用香草醛法時，一般以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)物，以甲醇為溶解劑；紫外分光光度法［8］，此方法雖然方便簡單，但只適用于原花青素含量純度特別高的產(chǎn)品。李奕［9］采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分離并測定了10余種葡萄籽中的主要4個兒茶素類化合物：兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、表兒茶素沒食子酸酯；此外還有鉬酸銨分光光度法［10，11］，流動注射-抑制化學(xué)發(fā)光法，F(xiàn)olin-Ciocalteu法等方法，其中Folin-Ciocalteu法主要測定總多酚的含量。

研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽多酚類物質(zhì)無論是含量還是種類都比葡萄皮和果肉豐富得多，并且這些多酚物質(zhì)有著極強(qiáng)的抗氧化能力。因此，以釀酒過程中產(chǎn)生的葡萄籽為原料，提取富含多酚類物質(zhì)的葡萄籽提取物（grape seed extract，GSE），不僅能為葡萄的綜合利用開辟新途徑，而且還可帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。葡萄籽中原花青素的含量在不同的廠家有著明顯差異，質(zhì)量也因?yàn)槠咸炎旬a(chǎn)地和加工方法的不同也存在差異，采用高效液相色譜法可以較快評定葡萄籽提取物中總多酚含量和主要單體含量，得出的結(jié)果與采用Folin-Ciocalteu法測定葡萄籽提取物中的總多酚有一定的差異，主要原因是由于品種和提取工藝的不同。

多酚類物質(zhì)的總量測定一般采用Folin-Ciocalteu法測定，此類方法操作簡單，價格低，精確度較高，但不能對單體進(jìn)行定量測定。采用液相高效色譜可以根據(jù)需要精確測定各個單體的含量，靈敏度高，精準(zhǔn)，能滿實(shí)驗(yàn)需求。

目前市面上的葡萄籽提取物因?yàn)槠贩N地方性特征而沒有統(tǒng)一規(guī)格，對里面的成分含量不明確，通過此方法不失為一種可行的方法。

［1］ 廖國周，王桂瑛，徐幸蓮，周光宏.葡萄籽提取物對烤羊肉中雜環(huán)胺形成的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（6）：248-251.

［2］ 李華，袁春龍，王蔚新；葡萄籽提取物（葡萄籽提取物）有效成分的分析［J］：1673-1689（2006）05-00010

［3］ 陳召桂，盧艷花，魏東芝；HPLC測定葡萄籽提取物中原花青素B2的含量［J］；中成藥，100121528 （2007） 1121645203

［4］ 馮建光， 陳利瓊；葡萄籽提取物中OPC的測定［J］；中國食品添加劑；1006-2513（2007） 04-0156-04

［5］ 左媛，王曉聞；葡萄籽提取物研究進(jìn)展綜述［J］；百業(yè)科技；1004—6429（2010）03-0138—02

［6］ 傅武勝，蔡一新，林明玉，等。鐵鹽催化比色法測定葡萄籽提取物中的原花青素［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27（10）：57-61

［7］ 孫蕓，谷問英。硫酸-香草醛法測定葡萄籽原花青素含量［J］食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（9）：43-46

［8］ 何強(qiáng)，呂遠(yuǎn)平，姚開，等。兒茶素的分析比較研究［J］，食品科學(xué)，2003，24（2）：114-116

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［10］ 馬亞軍.葡萄籽功效成分-原花青素分析測定方法的研究（D）.西北大學(xué)碩士論文，2003

［11］ 馬亞軍，楊秉勤，郎惠云.酸銨分光光度法測定葡萄籽提取物中的原花青素［J］.中國油脂，2003，28（3）：63-65

［12］ 盧翠英.流動注射-抑制化學(xué)發(fā)光法測定葡萄籽提取物中原花青素［J］.分析測試學(xué)報，2004，23（2）：75-77

Grape seed extract Determination of Proanthocyanidin

Deng-Yao Yang-Litin Liao-Guozhou*
（ College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming， 650201， China）

In this experiment， combined with the actual situation of grape seed extract， and the detection of the new analysis method， established the detection method of the qualitative and quantitative analysis of procyanidins content by HPLC. Method：Using A mobile phase acetonitrile and mobile phase B of 2% acetic acid solution by gradient elution， A from 0 to 30%， sample volume 10 L， rate of 0.5ml/min， column temperature of 30， the detection wavelength of 280nm. The results show that the gallic acid content in grape seed extract for 0.939mg/g，catechin is 73.496mg/g， catechin， epicatechin is 17.071mg/ g， epicatechin gallate is 3.106mg/g， the accuracy of RSD=2.9%， the average recovery was 96%-109%. This method is accurate，sensitive， the advantages of wide application range， it must have all the measured components of the standard to the qualitative and quantitative.

HPLC；Grape Seed Extract；Proanthocyanidins