草莓皺縮病毒（SCV）外殼蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)、編碼片段的克隆及表達(dá)

李云春 楊菊梅 馬建忠** 王永剛 魏艷 呂貴雪（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院）本研究工作受甘肅啟明星節(jié)能科技有限公司和國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目的資助

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草莓皺縮病毒（SCV）外殼蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)、編碼片段的克隆及表達(dá)

李云春 楊菊梅 馬建忠** 王永剛 魏艷 呂貴雪
（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院）
本研究工作受甘肅啟明星節(jié)能科技有限公司和國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目的資助

應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAStar、DNAMAN及Bepipred線(xiàn)性表位預(yù)測(cè)（http：//tools.immunee pitope.org/tools/bcell/ iedb-input）在線(xiàn)工具對(duì)草莓皺縮病毒（Strawberry Crinkle Virus， SCV） 78kDa外殼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了分析，選擇了一段抗原表位預(yù)測(cè)較強(qiáng)的27氨基酸殘基的區(qū)段（S3）。依據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性化學(xué)合成了編碼S3區(qū)段的DNA片段并克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pET32a（+）中，序列分析確定了含正確插入片段的重組質(zhì)粒pET32a（+）-S3。轉(zhuǎn)化上述重組質(zhì)粒至大腸桿菌菌株BL21（DE3）中并誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析表明，受IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白與所構(gòu)建的重組蛋白的分子量一致。

草莓皺縮病毒；抗原表位預(yù)測(cè)；基因克隆；基因表達(dá)

草莓（Fragaria spp.）是薔薇科草莓屬多年生草本植物，也是一種廣受歡迎的水果類(lèi)經(jīng)濟(jì)作物。隨著栽培面積的不斷擴(kuò)大，病毒對(duì)其危害日益嚴(yán)重。在我國(guó)草莓種植區(qū)，草莓皺縮病毒（Strawberry Crinkle Virus， SCV）是造成草莓產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失的主要病毒之一。SCV屬于彈狀病毒科、細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒屬［1］。SCV的基因組長(zhǎng)14547個(gè)核苷酸殘基，有7個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼4個(gè)蛋白質(zhì)，其外殼蛋白（Coat Protein，CP）由3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白組成，其大小分別為 78、47、25kDa［2］。利用DNAMAN和DNAStar等多個(gè)生物信息學(xué)軟件、綜合分析SCV的78kDa外殼蛋白氨基酸殘基序列，確定了一段抗原表位較強(qiáng)的區(qū)段S3，實(shí)現(xiàn)了S3編碼區(qū)段DNA的克隆和大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)。

1 、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒pET32a（+），大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α和菌株BL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室所保存。

1.2 DNA合成及表達(dá)載體的構(gòu)建

依據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性，設(shè)計(jì)了S3區(qū)段的DNA編碼序列并委托上海生工生物工程有限公司化學(xué)合成，合成后的片段插入pET32a（+）表達(dá)載體的XhoI位點(diǎn)［3］。

1.3 pET32a（+）-S3的轉(zhuǎn)化及其表達(dá)分析

序列分析正確的重組質(zhì)粒pET32a（+）-S3轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）菌株并誘導(dǎo)表達(dá)［3］。表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE分析［3］。

2 、結(jié)果

圖1 預(yù)測(cè)出的抗原表位較強(qiáng)的區(qū)段S3及合成的DNA編碼序列

應(yīng)用DNAMAN、DNAStar及在線(xiàn)預(yù)測(cè)工具Bepipred（http：//tools.immune epitope.org/tools/bcell/iedb-input） 等生物信息學(xué)軟件，對(duì)SCV的78kDa的外殼蛋白的抗原表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)，抗原表位較強(qiáng)的區(qū)段S3及其編碼序列如圖1所示。DNA編碼序列合成后插入了表達(dá)載體pET32a（+）。重組質(zhì)粒pET32a（+）-S3在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié)果如圖2所示。經(jīng)0.5mM IPTG誘導(dǎo)后，在24.0kDa附近出現(xiàn)了一條誘導(dǎo)蛋白帶，這一誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的分子量與預(yù)期的重組蛋白一致。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，目的蛋白表達(dá)量也增加。BandScan分析表明，誘導(dǎo)4h后該蛋白條帶可占到總蛋白的57.9%。

圖2 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析（M泳道為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)志，1號(hào)泳道為誘導(dǎo)前菌體總蛋白條帶，2-5號(hào)泳道分別為0.5mM IPTG誘導(dǎo)1、2、4、6h的總蛋白條帶，上樣量為10μl，箭頭所指為誘導(dǎo)表達(dá)蛋白條帶）

3 、結(jié)論

在本文中，對(duì)SCV的78kDa外殼蛋白的抗原表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)，合成了編碼該抗原表位的DNA片段，克隆并實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，獲得了與預(yù)期分子量一致的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白條帶。

［1］ Leone， G， Lindner， J. L， Schoen， C， D. Attempts to purify strawberry virus by non-conventional separation methods， 1992.

［2］ Khrks， M. M， Lindner， J. L， Vaskova， D. Detection and tentative grouping of Strawberry crinkle virus isolates. European Journal of Plant pathology. 2004， 110： 45-52.

［3］ J. 薩姆布魯克， D. W. 拉塞爾 著， 黃培堂等 譯. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］. 科學(xué)出版社， 第三版.