SDS-PAGE電泳在鑒別用牛乳摻偽的新疆特種乳中的應(yīng)用

阿力木·吾布力， 楊 潔，蘇力坦·阿巴百克力

(新疆大學(xué)生命科與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830049)

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SDS-PAGE電泳在鑒別用牛乳摻偽的新疆特種乳中的應(yīng)用

阿力木·吾布力1， 楊 潔2，蘇力坦·阿巴百克力2

(新疆大學(xué)生命科與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830049)

[目的]采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒別一定比例摻偽的特種乳中所含的牛乳成分及確定最低檢測摻偽比例。[方法]按一定的比例(1∶1、1∶4、1∶10、1∶20、1∶100、1∶200和1∶400(V牛乳/V特種乳)) 摻偽，離心分離乳清蛋白，SDS-PAGE電泳，確定摻偽差異性蛋白并進(jìn)行灰度分析。[結(jié)果]SDS-PAGE可以快速、有效地分離各乳乳清蛋白以及摻偽的牛乳乳清蛋白。[結(jié)論]SDS-PAGE鑒別摻偽的最低比例為1∶10(V牛乳/V特種乳)。

SDS-PAGE電泳；特種乳；灰度分析

特種乳是指牛乳外的其他哺乳動(dòng)物的乳汁(駝乳、驢乳和山羊乳)，與牛乳相比，特種乳含有較多的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪和礦物質(zhì)，偏堿性，目前尚未發(fā)現(xiàn)過敏現(xiàn)象[1]?！毒S吾爾常用藥》記載：“駝乳大補(bǔ)益氣，補(bǔ)五臟七損，強(qiáng)壯脛骨。駝乳營養(yǎng)豐富，被認(rèn)為胰島素的替代品，治療哮喘、慢性腎衰竭和抗腫瘤[2-3]”。山羊乳富含各種維生素和礦物質(zhì)，所含的各類蛋白質(zhì)的量及種類與母乳中蛋白質(zhì)極其接近[4]。驢乳水分含量較高，全乳固體含量較低，與其他家畜乳相比，驢乳的蛋白質(zhì)、乳糖和灰分含量更接近人乳，但脂肪含量顯著低于人乳，富含各種維生素和礦物質(zhì)，被認(rèn)為是母乳的最佳替代品[5-6]。

新疆是我國最重要的畜牧基地，雙峰駝、驢、山羊等為新疆特色產(chǎn)乳家畜，已形成一定的養(yǎng)殖優(yōu)勢。因各特色乳間存在功效的差異且特種乳有限，特種乳市價(jià)遠(yuǎn)高于牛乳，已有商家為謀取暴利而將低價(jià)格的牛乳摻入高品質(zhì)的特種乳中，嚴(yán)重影響乳產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[7]。因此，在實(shí)地對(duì)于如何實(shí)現(xiàn)快速檢測原料乳是否摻偽是一個(gè)重要的項(xiàng)目。SDS-PAGE電泳具有分子篩效應(yīng)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量亞基的不同而分離蛋白，能夠有效地分離乳中的主要蛋白質(zhì)，可以進(jìn)行定性和定量分析。牛乳乳清主要包括乳鐵蛋白(Lf)、牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白(IgG)、β-乳球蛋白(β-Lg) 和ɑ-乳白蛋白(ɑ-La)[8]，對(duì)于摻偽的特種乳通過牛乳乳清具備而特種乳乳清缺失的蛋白進(jìn)行檢測。筆者采用SDS-PAGE鑒別一定比例摻偽的特種乳中所含的牛乳成分，并確定最低檢測摻偽比例。

1　材料與方法

1.1乳樣的采集、摻偽及乳清的分離

1.1.1乳樣的采集。牛乳采自新疆烏魯木齊市鴻雁池哈薩克村家養(yǎng)牛，牛胎次為第2胎；駝乳采自新疆烏魯木齊市鴻雁池哈薩克村家養(yǎng)新疆雙峰乳，駱駝胎次為3胎；驢乳采自新疆烏魯木齊市鴻雁池哈薩克村家養(yǎng)驢乳，驢胎次為1胎；山羊乳采自于新疆烏魯木齊市，山羊胎次為1胎。

1.1.2乳樣的摻偽。摻偽總體積為50 mL，準(zhǔn)備8個(gè)50 mL離心管，按順序各離心管(牛乳∶特種乳)體積比例為1∶1、1∶4、1∶10、1∶20、1∶100、1∶200和1∶400。共有3組，第一組為摻偽的駝乳，第二組為摻偽的山羊乳，第三組為摻偽的驢乳。

1.1.3乳清的分離。取純和摻偽的50 mL乳樣本振蕩混勻后放入離心機(jī)，4 ℃、12 000 r/ min離心30 min,棄去乳脂和沉淀層，收集上清，重復(fù)3次，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2SDS-PAGE電泳及定量分析用5%的濃縮膠和10%的分離膠，濃縮膠電泳15 min，分離膠電泳40 min。純?nèi)榍搴蛽絺稳榍逑♂?0倍后上樣，上樣量均為10μL，通過BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察SDS-PAGE電泳結(jié)果，利用imageJ和Quantity One軟件對(duì)電泳條帶及蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.3高靈敏度染色先純化考馬斯亮藍(lán)R-250,在250 mL 7.5%乙酸中溶解4 g染料,加熱至70 ℃,加入44 g硫酸銨,溶解后,3 000 r/ min離心10 min,去除上清使染液干燥，即為純化的考馬斯亮藍(lán)。然后在500 mL 2%磷酸中溶解30 g硫酸銨,待其完全溶解后,加入純化的考馬斯亮藍(lán)R-250,室溫保存。電泳后加入12.5%三氯乙酸,室溫振搖1 h,排干液體。將考馬斯亮藍(lán)R-250染液加至凝膠內(nèi)溫育過夜，用20%硫酸銨固定凝膠。

1.4乳清蛋白濃度測定配制濃度為0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液，稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 0.1 g，溶于95%乙醇50 mL，再加入85%的濃磷酸100 mL，用水稀釋至1 000 mL，混勻備用。

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制溶液

按表1分別向各支試管內(nèi)加入各種試劑，充分混勻，5 min后在595 nm波長處以0號(hào)管調(diào)零,測定各管吸光度(A)。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，用Excel 2007制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到回歸方程：Y=6.420X-0.008(X：質(zhì)量濃度，mg/mL;Y：吸光值)，r= 0.999。

1.5數(shù)據(jù)分析用Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1乳清濃度各動(dòng)物乳中乳清蛋白的濃度：牛乳乳清(6.08±0.07) mg/mL，駱駝乳清(5.53±0.14) mg/mL,山羊乳乳清(8.34±0.11) mg/mL，驢乳乳清(2.65±0.09) mg/mL。2.2乳清蛋白SDS-PAGE電泳由圖1、2可知，駝乳乳清共有9個(gè)條帶，駝乳乳清中缺失牛乳乳清中分子量大小為18.4 ku的β-乳球蛋白(β-Lg)。由圖1、3可知，驢乳乳清共有7個(gè)條帶，缺失牛乳乳清所含的14.1 ku的ɑ-乳白蛋白(ɑ-La)。由圖1、4可知，山羊乳乳清有5個(gè)條帶，與牛乳乳清相比缺失84.7 ku的乳鐵蛋白(Lf)。

采用Quantity One 軟件計(jì)算牛乳乳清蛋白的分子大小，結(jié)果表明，乳鐵蛋白(Lf)(84.7±0.85)ku,牛血清白蛋白(BSA)(69.5±0.48)ku,免疫球蛋白(IgG)(64.3±0.27)ku,β-乳球蛋白(β-Lg)(18.4±0.16)ku,ɑ-乳白蛋白(ɑ-La)(14.1±0.11)ku。

注：1、2. 駱駝乳乳清樣；3、6、9. 牛乳乳清樣；4、5. 驢乳乳清樣；7、8.山羊乳乳清樣。Note: 1,2. Camel whey samples; 3, 6, 9. Cow whey samples; 4,5. Donkey whey samples; 7, 8. Goat whey samples. 圖1　各特種乳和牛乳乳清蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1　The SDS-PAGE result of whey proteins of each non-bovine and bovine milk

2.3乳清差異性蛋白的定位由圖2可知，駱駝乳乳清缺失β-乳球蛋白，泳道3出現(xiàn)明顯的18.4 ku的β-乳球蛋白，泳道4和5也出現(xiàn)但顏色較淺，泳道6～9無此條帶。

注：1.駱駝乳乳清樣；2. 牛乳乳清樣；3. 牛乳∶駝乳 1∶1(V/V)；4. 牛乳∶駝乳 1∶4(V/V); 5. 牛乳∶駝乳 1∶10(V/V); 6. 牛乳∶駝乳 1∶20(V/V); 7. 牛乳∶駝乳 1∶1(V/100); 8. 牛乳∶駝乳 1∶200(V/V); 9. 牛乳∶駝乳 1∶400(V/V)。Note: 1. Camel whey samples; 2. Cow whey samples; 3. Cow milk∶camel milk 1∶1(V/V); 4. Cow milk∶camel milk 1∶4(V/V); 5. Cow milk∶camel milk 1∶10(V/V); 6. Cow milk:camel milk 1∶20(V/V); 7. Cow milk∶camel milk 1∶1(V/100); 8. Cow milk∶camel milk 1∶200(V/V); 9. Cow milk∶camel milk 1∶400(V/V)。 圖2　按一定比例用牛乳摻偽的駝乳乳清蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2　The SDS-PAGE result of whey proteins of camel milk adulterated with bovine milk

由圖3可知，山羊乳乳清缺失牛乳乳清所含的84.7 ku的乳鐵蛋白，泳道3和4分別為牛乳與山羊乳體積比例1∶1和1∶4，可以明顯地看出乳鐵蛋白，泳道5～9由于濃度低于檢出限無此條帶出現(xiàn)。

注：1.山羊乳乳清樣；2. 牛乳乳清樣；3. 牛乳∶山羊乳 1∶1(V/V)；4. 牛乳∶山羊乳 1∶4(V/V); 5. 牛乳∶山羊乳 1∶10(V/V); 6. 牛乳∶山羊乳 1∶20(V/V); 7. 牛乳∶山羊乳 1∶1(V/100); 8. 牛乳∶山羊乳 1∶200(V/V); 9. 牛乳∶山羊乳 1∶400(V/V)。Note: 1. Camel whey samples; 2. Cow whey samples; 3. Cow milk∶camel milk 1∶1(V/V); 4. Cow milk∶camel milk 1∶4(V/V); 5. Cow milk∶camel milk 1∶10(V/V); 6. Cow milk∶camel milk 1∶20(V/V); 7. Cow milk∶camel milk 1∶1(V/100); 8. Cow milk∶camel milk 1∶200(V/V); 9. Cow milk∶camel milk 1∶400(V/V)。圖3　 按一定比例用牛乳摻偽的山羊乳乳清蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig .3　The SDS-PAGE result of whey proteins of goat milk adulterated with bovine milk

由圖4可知，驢乳乳清缺失牛乳乳清所含的14.1 ku的ɑ-乳白蛋白。泳道3、4和5為牛乳與驢乳體積比例分別為1∶1、1∶4和1∶10，可以明顯地看出ɑ-乳白蛋白，但隨著濃度的減小顏色變淺，泳道6～9無此條帶出現(xiàn)。

注：1. 驢乳乳清樣；2. 牛乳乳清樣；3. 牛乳∶驢乳 1∶1(V/V)；4. 牛乳∶ 驢乳 1∶4(V/V); 5. 牛乳∶驢乳 1∶10(V/V); 6. 牛乳∶驢乳 1∶20(V/V); 7. 牛乳∶驢乳 1∶1(V/100); 8. 牛乳∶驢乳 1∶200(V/V); 9. 牛乳∶驢乳 1∶400(V/V)。Note： 1. Camel whey samples; 2. Cow whey samples; 3. Cow milk∶camel milk 1∶1(V/V); 4. Cow milk∶camel milk 1∶4(V/V); 5. Cow milk∶camel milk 1∶10(V/V); 6. Cow milk∶camel milk 1∶20(V/V); 7. Cow milk∶camel milk 1∶1(V/100); 8. Cow milk∶camel milk 1∶200(V/V); 9. Cow milk∶camel milk 1∶400(V/V).圖4　 按一定比例用牛乳摻偽的驢乳乳清蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig .4　The SDS-PAGE result of whey proteins of donkey milk adulterated with bovine milk

2.4摻偽檢測

2.4.1牛乳乳清所含的蛋白。由圖1、2、3、4和表2可知，牛乳乳清由乳鐵蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白、β-乳球蛋白和ɑ-乳白蛋白構(gòu)成(電泳時(shí)從上往下依次分離)。

2.4.2檢出限確定。根據(jù)限量要求，對(duì)0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)不同比例稀釋10個(gè)平行樣進(jìn)行電泳。得到的標(biāo)準(zhǔn)差，由LOD=3×SD得到檢出限，檢出限為19 mg/L 。

2.4.3摻偽的駝乳。利用imageJ軟件對(duì)圖2箭頭所示的β-乳球蛋白條帶進(jìn)行處理，泳道1～9中的β-乳球蛋白含量分別為(0.018 4±0.000 2)、(0.009 6±0.000 1)、(0.005 1±0.000 1)、(0.002 2±0.000 1)、0、0、0、0 mg。最低摻偽檢測比例為 1∶10(V牛乳/V駝乳)(圖5)。

2.4.4摻偽的山羊乳。利用imageJ軟件對(duì)圖3箭頭所示的乳鐵蛋白進(jìn)行處理，通過灰度分析確定能夠鑒別的最低摻偽比例及含量的減少程度。泳道1～9中乳白蛋白含量分別為(0.009 3±0.001)、(0.004 3±0.000 1)、(0.002 1±0.000 1)、0、0、0、0、0 mg。最低摻偽檢測比例為 1∶4(V牛乳/V山羊乳)(圖6)。

表2　 牛乳乳清所含的蛋白

注：1. 駱駝乳乳清樣；2. 牛乳乳清樣；3. 牛乳∶駝乳 1∶1(V/V)；4. 牛乳∶駝乳 1∶4(V/V); 5. 牛乳∶駝乳 1∶10(V/V); 6. 牛乳∶駝乳 1∶20(V/V); 7. 牛乳∶駝乳 1∶1(V/100); 8. 牛乳∶駝乳 1∶200(V/V); 9. 牛乳∶駝乳 1∶400(V/V)。Note： 1. Camel whey samples; 2. Cow whey samples; 3. Cow milk∶camel milk 1∶1(V/V); 4. Cow milk∶camel milk 1∶4(V/V); 5. Cow milk∶camel milk 1∶10(V/V); 6. Cow milk∶camel milk 1∶20(V/V); 7. Cow milk∶camel milk 1∶1(V/100); 8. Cow milk∶camel milk 1∶200(V/V); 9. Cow milk∶camel milk 1∶400(V/V).圖5　摻偽駝乳對(duì)β-乳球蛋白的灰度分析Fig.5　The gray analysis of β-Lg in adulterated camel milk

注：1.山羊乳清樣；2. 牛乳乳清樣；3. 牛乳∶山羊乳 1∶1(V/V)；4. 牛乳∶山羊乳 1∶4(V/V); 5. 牛乳∶山羊乳 1∶10(V/V); 6. 牛乳∶山羊乳 1∶20(V/V); 7. 牛乳∶山羊乳 1∶1(V/100); 8. 牛乳∶山羊乳 1∶200(V/V); 9. 牛乳∶山羊乳 1∶400(V/V)。Note： 1. Camel whey samples; 2. Cow whey samples; 3. Cow milk∶camel milk 1∶1(V/V); 4. Cow milk∶camel milk 1∶4(V/V); 5. Cow milk∶camel milk 1∶10(V/V); 6. Cow milk∶camel milk 1∶20(V/V); 7. Cow milk∶camel milk 1∶1(V/100); 8. Cow milk∶camel milk 1∶200(V/V); 9. Cow milk∶camel milk 1∶400(V/V).圖6　摻偽山羊乳對(duì)乳鐵蛋白的灰度分析Fig .6　 The gray analysis of Lf in adulterated goat milk

2.4.5摻偽的驢乳。利用imageJ軟件對(duì)圖4箭頭所示的ɑ-乳白蛋白進(jìn)行處理，通過灰度分析確定能夠鑒別的最低摻偽比例及含量的減少程度。1～9泳道中α-乳白蛋白含量分別為(0.014 2±0.000 1)、(0.007 7±0.000 1)、(0.002 4±0.000 1)、(0.001 9±0.000 1)、0、0、0、0 mg。最低摻偽檢測比例為 1∶10(V牛乳/V驢乳)(圖7)。

注：1.驢乳乳清樣；2. 牛乳乳清樣；3. 牛乳∶驢乳 1∶1(V/V)；4. 牛乳∶驢乳 1∶4(V/V); 5. 牛乳∶驢乳 1∶10(V/V); 6. 牛乳∶驢乳 1∶20(V/V); 7. 牛乳∶驢乳 1∶1(V/100); 8. 牛乳∶驢乳 1∶200(V/V); 9. 牛乳∶驢乳 1∶400(V/V)。Note： 1. Camel whey samples; 2. Cow whey samples; 3. Cow milk∶camel milk 1∶1(V/V); 4. Cow milk∶camel milk 1∶4(V/V); 5. Cow milk∶camel milk 1∶10(V/V); 6. Cow milk∶camel milk 1∶20(V/V); 7. Cow milk∶camel milk 1∶1(V/100); 8. Cow milk∶camel milk 1∶200(V/V); 9. Cow milk∶camel milk 1∶400(V/V).圖7　摻偽驢乳對(duì)ɑ-乳白蛋白的灰度分析Fig .7　The gray analysis of ɑ- Lg in adulterated donkey milk

3　 討論

3.1季節(jié)、攝取的飼料及身體健康狀況對(duì)乳蛋白的影響地理環(huán)境的不同意味著植被的不同，引起草食動(dòng)物攝取食物后所分泌的乳汁的量和所含的部分蛋白質(zhì)的差異，季節(jié)同樣引起類似的現(xiàn)象。乳產(chǎn)量除與季節(jié)、飼養(yǎng)環(huán)境、胎次、種群等因素有關(guān)外，主要的影響因素是日糧營養(yǎng)水平，特種乳中蛋白及灰分的含量與日糧中的蛋白及纖維水平密切相關(guān)[9]。家養(yǎng)時(shí)動(dòng)物攝取牧草的蛋白質(zhì)、粗纖維和礦物質(zhì)含量都較低。該試驗(yàn)采樣地點(diǎn)的牧民們飼養(yǎng)環(huán)境及營養(yǎng)方面未規(guī)范化，各動(dòng)物乳中相應(yīng)成分的含量也較低。

3.2電泳條件與分離檢測靈敏度不同濃度的膠遷移出不同長度的蛋白條帶，對(duì)于聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度越大分離蛋白分子量越小。分離膠濃度太大分子量大的蛋白分不開，分離膠濃度太小分子量小的蛋白分不開。30 ku的驢乳乳清蛋白未完全遷移開，可以通過這些蛋白譜帶上所代表的蛋白長度大小來選擇適合濃度比例的凝膠，以探知是否還有其他差異性蛋白條帶也可以用不同濃度的分離膠和濃縮膠。該試驗(yàn)利用5%的濃縮膠和10%的分離膠，提高濃度或者減少濃度可能分離出未被分離的蛋白亞基或者改進(jìn)方法采用雙向電泳技術(shù)遷移更多的蛋白條帶。電壓越大，電泳時(shí)間越短；另一方面，當(dāng)電壓超過120 V時(shí)，電泳產(chǎn)生的熱量引起介質(zhì)的溫度升高，這對(duì)分離效果造成潛在的影響，不利于檢測試驗(yàn)。綜合考慮選擇90～120 V 的電壓。染色采取提高靈敏度法與傳統(tǒng)染色方法比該方法所用時(shí)間短，清晰度高[10]。

3.3SDS-PAGE電泳與其他檢測技術(shù)比較目前關(guān)于檢測牛乳摻偽特種乳的研究較少。隨著乳品市場的發(fā)展和安全生產(chǎn)，我國檢測乳品摻偽的常用技術(shù)也逐漸從較淺的研究手段向尖端技術(shù)與科技發(fā)展。將低級(jí)乳摻入特種乳中，會(huì)對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生欺騙行為，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致過敏人群尤其是0～16月的嬰幼兒死亡。檢測特種乳摻偽牛乳的標(biāo)準(zhǔn)常以不同牛乳蛋白質(zhì)為主，檢測方法集中在電泳技術(shù)、色譜技術(shù)、免疫技術(shù)以及等質(zhì)譜方法。近幾年，通過PCR技術(shù)檢測食品摻偽研究證實(shí)該方法的可信度和精確性。雖然其他技術(shù)的靈敏度高又可靠但實(shí)際操作繁瑣，隨身攜帶不方便，在實(shí)地檢測時(shí)電泳法比較理想[11-12]，電泳技術(shù)基礎(chǔ)上研發(fā)檢測試紙具有潛在發(fā)展空間[13]。

4　結(jié)論

該研究按一定比例1∶1、1∶4、1∶10、1∶20、1∶100、1∶200和1∶400(V牛乳/V特種乳) 摻偽，離心分離乳清蛋白，SDS-PAGE電泳后確定特種乳缺失的蛋白。結(jié)果表明，新疆雙峰駝駝乳乳清缺失β-乳球蛋白，山羊乳乳清缺失乳鐵蛋白，驢乳乳清缺失ɑ-乳白蛋白。鑒別用牛乳摻偽的新疆特種乳的有效鑒別體積比例分別為1∶10、1∶4和1∶10 (V牛乳/V特種乳)。

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Use of SDS-PAGE in Detecting Bovine Milk Content in Adulterated Xinjiang Non-bovine Milk

Alm·UBUL1,YANG Jie2,Sultan·ABABEKRI2

(College of Life Science and Technology, Xinjiang University,Urumqi, Xinjiang 830049)

[Objective] The aim was to use SDS-PAGE to detect adulterated non-bovine milk and measure bovine milk content and confirm the lowest adulteration ratio. [Method]By using different ratio of(1∶1, 1∶4, 1∶10, 1∶20, 1∶100, 1∶200 and 1∶400(Vbovine milk/Vnon-bovine milk) )adulterated non-bovine milk, whey protein was isolated and SDS-PAGE was conducted to locate the indicating protein then use gray analysis to detect adulteration and calculate bovine milk content. [Result] The SDS-PAGE can efficiently separate each animal’s whey protein as well as bovine whey protein from adulterated whey. [Conclusion] The lowest adulterating ratio can be detected with SDS-PAGE as 1∶10 (Vbovine milk/Vnon-bovine milk).

SDS-PAGE; Non-bovine milk; Gray analysis

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“基于特種乳差異蛋白組分析建立乳間摻偽檢測方法研究”(31471645)。

阿力木·吾布力(1985- )，男，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，研究方向：分子與生物化學(xué)。

2016-07-04

S 851.34+7

A

0517-6611(2016)23-099-04