微量肉湯稀釋法檢測(cè)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)型克林霉素耐藥結(jié)果分析

江培濤,楊　健,楊正南,朱　俊

(南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇儀征 211900)

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·臨床研究·

微量肉湯稀釋法檢測(cè)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)型克林霉素耐藥結(jié)果分析

江培濤,楊健,楊正南,朱俊

(南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇儀征 211900)

目的檢測(cè)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)型克林霉素耐藥的情況，指導(dǎo)臨床合理用藥。方法用微量肉湯稀釋法檢測(cè)175株金黃色葡萄球菌對(duì)紅霉素、克林霉素及誘導(dǎo)型克林霉素耐藥的情況。結(jié)果175株金黃色葡萄球菌中，紅霉素和克林霉素均敏感的有29株；紅霉素和克林霉素均耐藥的有38株；紅霉素敏感而克林霉素中介的有2株；紅霉素敏感而克林霉素耐藥的有0株；紅霉素耐藥而克林霉素中介的有18株；紅霉素耐藥而克林霉素敏感的有72株；誘導(dǎo)型克林霉素耐藥試驗(yàn)陽(yáng)性的有55株。結(jié)論誘導(dǎo)型克林霉素耐藥的發(fā)生率較高，臨床微生物室在發(fā)現(xiàn)紅霉素耐藥而克林霉素非耐藥的金黃色葡萄球菌時(shí)，必須檢測(cè)其誘導(dǎo)型耐藥性，指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥。

微量肉湯稀釋法；金黃色葡萄球菌；誘導(dǎo)型克林霉素耐藥

金黃色葡萄球菌是臨床常見(jiàn)的病原性葡萄球菌，主要引起局部化膿性感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染性疾病。以紅霉素和克林霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和林可霉素類(lèi)抗菌藥物是臨床用于治療金黃色葡萄球菌感染的重要藥物?？肆置顾啬退幘哂薪Y(jié)構(gòu)型和誘導(dǎo)型兩種耐藥表型，紅霉素耐藥具有誘導(dǎo)克林霉素耐藥的作用[1-2]。美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2004年將D試驗(yàn)列入葡萄球菌屬克林霉素誘導(dǎo)型耐藥的檢測(cè)。D試驗(yàn)雖操作簡(jiǎn)單，但為紙片法，這給采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)了一些問(wèn)題。目前已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)微量肉湯稀釋法檢測(cè)誘導(dǎo)型克林霉素耐藥進(jìn)行了詳細(xì)的研究[3-6]，證實(shí)稀釋法與D試驗(yàn)具有很好的一致性。本研究采用肉湯稀釋法檢測(cè)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)型克林霉素耐藥的情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1菌株來(lái)源收集2014年1月至2015年12月本院門(mén)診及住院患者標(biāo)本中分離的金黃色葡萄球菌175株，剔除同一患者同種標(biāo)本重復(fù)分離株。所有菌株均經(jīng)血漿凝固酶試驗(yàn)和細(xì)菌鑒定分析儀確認(rèn)。質(zhì)控菌株為ATCC29213，購(gòu)自江蘇省臨床檢驗(yàn)中心。

1.2儀器與試劑Microscan-AS4細(xì)菌鑒定藥敏分析儀為德國(guó)西門(mén)子公司產(chǎn)品，CAMHB肉湯、PC33型葡萄球菌鑒定藥敏復(fù)合板均為西門(mén)子公司配套產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1藥敏試驗(yàn)微量肉湯稀釋法檢測(cè)紅霉素、克林霉素的耐藥性。所有操作和判斷標(biāo)準(zhǔn)按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)和2012版CLSI標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[7-8]。紅霉素敏感的判斷折點(diǎn)為≤0.5 μg/mL,中介折點(diǎn)為1～4 μg/mL,耐藥折點(diǎn)為≥8 μg/mL；克林霉素敏感的判斷折點(diǎn)為≤0.5 μg/mL,中介折點(diǎn)為1～2 μg/mL,耐藥折點(diǎn)為≥4 μg/mL。

1.3.2克林霉素誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)在復(fù)合藥敏孔中含有4 μg/mL紅霉素和0.5 μg/mL克林霉素，并將菌液濃度配制為5×105CFU/mL,置35 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育18～24 h。以復(fù)合藥敏孔中有細(xì)菌生長(zhǎng)為誘導(dǎo)型耐藥試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。

1.4耐藥表型判斷紅霉素和克林霉素均耐藥為結(jié)構(gòu)型耐藥；紅霉素耐藥而克林霉素敏感且誘導(dǎo)試驗(yàn)陽(yáng)性為誘導(dǎo)型耐藥。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，計(jì)量資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1金黃色葡萄球菌對(duì)紅霉素、克林霉素的耐藥表型175株金黃色葡萄球菌中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)88株，占50.3%，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)87株，占49.7%。結(jié)構(gòu)型耐藥的發(fā)生率為21.7%(38株)。誘導(dǎo)型克林霉素耐藥試驗(yàn)陽(yáng)性2014年有21株(6株MRSA，15株MSSA)，2015年有34株(19株MRSA，15株MSSA)，發(fā)生率為31.4%。見(jiàn)表1。

表1　　金黃色葡萄球菌對(duì)紅霉素、克林霉素的耐藥表型(n)

注：EM為紅霉素；CM為克林霉素；S為敏感；I為中介；R為耐藥。

2.2誘導(dǎo)型克林霉素耐藥發(fā)生率比較88株MRSA中，結(jié)構(gòu)型耐藥的發(fā)生率為33.0%(29株)，誘導(dǎo)型耐藥的發(fā)生率為28.4%(25株)；87株MSSA中，結(jié)構(gòu)型耐藥的發(fā)生率為10.3%(9株)，誘導(dǎo)型克林霉素耐藥的發(fā)生率為34.5%(30株)。兩者誘導(dǎo)型克林霉素耐藥試驗(yàn)陽(yáng)性率比較的，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.749，P>0.05)。

3　討　　論

紅霉素主要用于治療包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的革蘭陽(yáng)性球菌引起的各種感染，臨床常用作對(duì)青霉素過(guò)敏者的替代藥物?？肆置顾刂饕糜诟锾m陽(yáng)性球菌及厭氧菌引起的呼吸道、軟組織、膽道、腹腔及婦科等感染，是金黃色葡萄球菌骨髓炎的首選治療藥物[9]。然而，隨著近年來(lái)MRSA檢出率的逐年增高[10-11]，葡萄球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物也呈現(xiàn)出不同程度的耐藥，其耐藥機(jī)制主要表現(xiàn)為藥物泵出和核糖體藥物結(jié)合靶位的改變。泵出型耐藥由msrA基因編碼，表型為紅霉素耐藥而克林霉素敏感，且誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)陰性；核糖體藥物結(jié)合靶位改變是由erm基因調(diào)控的，分為自身結(jié)構(gòu)的變異和紅霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生的變異[12]，其中前者的耐藥表型為紅霉素和克林霉素同時(shí)耐藥，又稱(chēng)為結(jié)構(gòu)型耐藥，后者的耐藥表型為紅霉素耐藥克林霉素敏感，經(jīng)紅霉素誘導(dǎo)后克林霉素耐藥[13]。這種菌株體外藥敏試驗(yàn)克林霉素表現(xiàn)為敏感，但實(shí)際使用中治療無(wú)效。

上述三種耐藥表型中，結(jié)構(gòu)型耐藥易于檢測(cè)，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室需要區(qū)分泵出型和誘導(dǎo)型耐藥，即對(duì)紅霉素耐藥而克林霉素敏感或中介的情況進(jìn)行克林霉素誘導(dǎo)型耐藥檢測(cè)并報(bào)告給臨床相應(yīng)的結(jié)果。目前CLSI推薦的檢測(cè)方法有D試驗(yàn)和微量肉湯稀釋法，前者簡(jiǎn)單直觀，適用于手工檢測(cè)，后者易于與微生物鑒定板條整合并一體化，適用于儀器檢測(cè)。有研究表明這兩種方法檢測(cè)誘導(dǎo)型克林霉素耐藥試驗(yàn)具有很好的一致性[3-6]。本研究用微量肉湯稀釋法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的誘導(dǎo)型克林霉素耐藥試驗(yàn)，結(jié)果顯示在175株金黃色葡萄球菌中，結(jié)構(gòu)型耐藥的發(fā)生率為21.7%(38株)，誘導(dǎo)型克林霉素耐藥的發(fā)生率為31.4%(55株)，比國(guó)內(nèi)關(guān)幼華等[14]報(bào)道略低。MRSA的檢出率為50.3%(88株)。在88株MRSA中，結(jié)構(gòu)型耐藥的發(fā)生率為33.0%(29株)，誘導(dǎo)型克林霉素耐藥的發(fā)生率為28.4%(25株)；在87株MSSA中，結(jié)構(gòu)型耐藥的發(fā)生率為10.3%(9株)，誘導(dǎo)型克林霉素耐藥的發(fā)生率為34.5%(30株)，低于國(guó)內(nèi)徐洪偉等[15]的報(bào)道。造成這些差異的原因可能與因地區(qū)差異的耐藥基因不同，以及與該類(lèi)抗菌藥物在不同地區(qū)的使用頻度甚至各個(gè)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)的操作水準(zhǔn)有關(guān)，還有待進(jìn)一步探索。

本研究顯示，金黃色葡萄球菌的誘導(dǎo)型克林霉素耐藥發(fā)生率很高，微生物實(shí)驗(yàn)室在給臨床報(bào)告紅霉素耐藥而克林霉素敏感或中介的藥敏試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，還應(yīng)該報(bào)告誘導(dǎo)型克林霉素耐藥試驗(yàn)的結(jié)果，以免林可霉素類(lèi)抗菌藥物被濫用，造成患者的經(jīng)濟(jì)損失和耐藥菌株的流行。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.047

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1673-4130(2016)17-2467-03

2016-02-21

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