氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測程序的測量不確定度評估

張道杰,田明新,王小慧,孫佳惠,計娓娓,常海濤,盧東裕

(北京圣元惠仁醫(yī)學(xué)檢驗所生化遺傳室　101101)

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·論著·

氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測程序的測量不確定度評估

張道杰,田明新△,王小慧,孫佳惠,計娓娓,常海濤,盧東裕

(北京圣元惠仁醫(yī)學(xué)檢驗所生化遺傳室101101)

目的對Waters公司ACQUITY TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀及其配套試劑檢測氨基酸、肉堿的程序進(jìn)行測量不確定度評估，探討評估的意義。方法按照《醫(yī)學(xué)實驗室——測量不確定度的評定與表達(dá)》提供的方法，用兩種不同批號的試劑盒檢測室內(nèi)質(zhì)控品各20個工作日，每個工作日在常規(guī)標(biāo)本檢測前、后各檢測一次質(zhì)控品，隨機(jī)更換檢測者，計算測量復(fù)現(xiàn)性引入的測量不確定度；統(tǒng)計原衛(wèi)生部臨床檢驗中心2014年和2015年進(jìn)行的20次新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查中的氨基酸室間質(zhì)評數(shù)據(jù)、16次?；鈮A室間質(zhì)評數(shù)據(jù)，計算偏倚引入的測量不確定度；根據(jù)測量復(fù)現(xiàn)性引入的測量不確定度和偏倚引入的測量不確定度計算相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對擴(kuò)展不確定度。以原衛(wèi)生部臨床檢驗中心新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查中的氨基酸和酰基肉堿室間質(zhì)評的允許總誤差指標(biāo)作為目標(biāo)擴(kuò)展不確定度。結(jié)果瓜氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丙酰肉堿、辛酰肉堿、十二碳酰肉堿、十六碳酰肉堿、十八碳酰肉堿的相對合成擴(kuò)展不確定度為19.1%～26.1%(k=2)，小于目標(biāo)不確定度；亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、游離肉堿的相對合成擴(kuò)展不確定度為31.0%～43.3%(k=2)，大于目標(biāo)不確定度；異戊酰肉堿的不確定度需另行評估。結(jié)論通過氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法配套檢測程序的測量不確定度的評估，不僅可以為持續(xù)改進(jìn)檢測質(zhì)量提供機(jī)會，而且有助于實驗技術(shù)人員正確解讀檢測數(shù)據(jù)及臨床醫(yī)師正確使用檢驗報告。

串聯(lián)質(zhì)譜；非衍生化；氨基酸；肉堿；不確定度

按照ISO15189：2012《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力的要求》，實驗室應(yīng)為檢驗過程中用于報告樣品被測量值的每個測量程序測量不確定度。目前血常規(guī)項目、臨床化學(xué)檢驗常規(guī)項目已有測量不確定度評估的文獻(xiàn)報道[1-2]，但對濾紙干血斑氨基酸及肉堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測程序的測量不確定度評估報道較少。為使臨床正確理解和應(yīng)用濾紙干血斑氨基酸及肉堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測程序，提高遺傳代謝病的實驗診斷水平，本研究對濾紙干血斑氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法配套檢測程序的測量不確定度進(jìn)行了評估，評估對象包括瓜氨酸(CIT)、亮氨酸(LEU)、蛋氨酸(MET)、苯丙氨酸(PHE)、酪氨酸(TYR)、纈氨酸(VAL)和游離肉堿(C0)、丙酰肉堿(C3)、異戊酰肉堿(C5)、辛酰肉堿(C8)、十二碳酰肉堿(C12)、十六碳酰肉堿(C16)和十八碳酰肉堿(C18)，共13個原衛(wèi)生部臨檢中心開展室間質(zhì)評的檢測項目?，F(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源均為濾紙干血斑標(biāo)本。測量復(fù)現(xiàn)性引入的測量不確定度評估標(biāo)本來源于美國Perkin Elmer公司的非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測定試劑盒(下文稱PE試劑盒，包括氨基酸內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品、?；鈮A內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品、干血斑質(zhì)控品、V型底耐熱微孔板、V型截底潔凈微孔板、鋁箔制微孔板封套、黏性微孔板封套中的質(zhì)控品)。偏倚引入的測量不確定度評估標(biāo)本來源于原衛(wèi)生部臨床檢驗中心新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查中的氨基酸和?；鈮A室間質(zhì)評標(biāo)本。

1.2儀器與試劑儀器為美國Waters公司的串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(包括串聯(lián)質(zhì)譜儀ACQUITY TQD、高效液相色譜儀1525μ、自動進(jìn)樣器2777C)；試劑為PE試劑盒和溶劑包(包括萃取液和流動相)。輔助儀器及試劑包括孵育振蕩器(Thermo IEMS Incubator/Shaker HT)、甲醇，均為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.3合成不確定度根據(jù)《醫(yī)學(xué)實驗室——測量不確定度的評定與表達(dá)》提供的方法計算相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucrel和相對擴(kuò)展不確定度urel。相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucrel計算式為ucrel=[ucrel(bias)2+urel(Rw)2]1/2。相對擴(kuò)展不確定度urel計算式為urel=k×ucrel，式中k包含因子，采用k=2，包含概率P=0.954 5。

1.3.4目標(biāo)不確定度選擇標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[3]，將原衛(wèi)生部臨床檢驗中心新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查中的氨基酸和?；鈮A室間質(zhì)評的允許總誤差指標(biāo)作為目標(biāo)擴(kuò)展不確定度[4-5]。

2　結(jié)　　果

氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測程序的測量不確定度評估結(jié)果見表1。與目標(biāo)不確定度相比，CIT、MET、PHE、C3、C8、C12、C16、C18的相對合成擴(kuò)展不確定度滿足要求，而LEU、TYR、VAL、C0、C5的相對合成擴(kuò)展不確定度不滿足要求，但LEU、C0的相對合成擴(kuò)展不確定度接近目標(biāo)不確定度，只有TYR、VAL、C5的相對合成擴(kuò)展不確定度超過目標(biāo)不確定度較多。

表1　　氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測程序的測量不確定度評估結(jié)果

續(xù)表1　　氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測程序的測量不確定度評估結(jié)果

3　討　　論

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)用于遺傳代謝病的篩查與診斷，將實驗診斷模式由“一種檢測、一個參數(shù)、一種疾病”轉(zhuǎn)為“一種檢測、多個參數(shù)、多種疾病”，一次檢測能同時提供50種氨基酸和肉堿參數(shù)，篩查或診斷幾十種遺傳代謝病，極大地推動了新生兒遺傳代謝病篩查的發(fā)展。但該檢測程序標(biāo)本類型為濾紙干血斑，上機(jī)前需標(biāo)本處理，儀器檢測原理明顯不同于常規(guī)臨床化學(xué)檢測系統(tǒng)，檢測方法有衍生、非衍生之分，所用試劑也有自配、配套之別[6]，其性能特征、質(zhì)量管理尚無明確標(biāo)準(zhǔn)，因此用于遺傳代謝病篩查與診斷的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)也存在不少問題與挑戰(zhàn)[7]，也會出現(xiàn)假陰性和假陽性。因此筆者認(rèn)為，對串聯(lián)質(zhì)譜檢測系統(tǒng)的性能特征、質(zhì)量指標(biāo)，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行系統(tǒng)的研究和評估，以便實驗技術(shù)人員正確解讀檢測數(shù)據(jù)及臨床醫(yī)師正確使用檢驗報告。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量值分散性的非負(fù)參數(shù)，表達(dá)了測量值的可靠程度，因此對串聯(lián)質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進(jìn)行測量不確定度評估有助于上述問題的解決。本研究表明氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法配套檢測程序的測量不確定度因不同的檢測項目而不同，CIT、MET、PHE、C3、C8、C12、C16、C18的相對合成擴(kuò)展不確定度為19.1%～26.1%，LEU、TYR、VAL、C0的相對合成擴(kuò)展不確定度為31.0%～43.3%。利用這些項目的測量不確定度，實驗室可以更全面地分析檢測數(shù)據(jù)，發(fā)出更恰當(dāng)?shù)臋z驗報告。比如新生兒濾紙干血斑PHE參考范圍為22～120 μmol/L,高苯丙氨酸血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)為PHE大于120 μmol/L、苯丙氨酸與酪氨酸的比值大于2[8]。若新生兒的PHE檢測值為140 μmol/L，結(jié)合其相對合成擴(kuò)展不確定度為24.5%，則該新生兒本次檢測的PHE值的分布范圍為106～174 μmol/L，可理解為該新生兒本次檢測的PHE值也可能不大于120 μmol/L，因此該檢驗報告應(yīng)該建議重新采血復(fù)查，不可輕易下高苯丙氨酸血癥的實驗診斷意見。若另一新生兒的PHE檢測值為160 μmol/L，則該新生兒本次檢測的PHE值的分布范圍為121～199 μmol/L，可理解為該新生兒本次檢測的PHE值95%的可能大于120 μmol/L，若苯丙氨酸與酪氨酸的比值也大于2，則該檢驗報告就應(yīng)該明確提示高苯丙氨酸血癥，指導(dǎo)臨床進(jìn)一步確診。

既然測量不確定度對實驗技術(shù)人員正確解讀檢測數(shù)據(jù)及臨床醫(yī)師正確使用檢驗報告有指導(dǎo)作用，那么測量不確定度的評估就要從實驗室的實際出發(fā)，不可死搬教條。比如本研究中的C5，偏倚引入的相對測量不確定度已達(dá)37.59%，相比目標(biāo)不確定度(30.0%)而言太大，說明當(dāng)前C5檢測程序的正確度不好，應(yīng)該進(jìn)行性能驗證，查找原因，待正確度問題解決后，再評估其測量不確定度。故本次C5的測量不確定度評估結(jié)果作廢。

當(dāng)然，本研究評估的氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法配套檢測程序的測量不確定度相比臨床生物化學(xué)檢驗常規(guī)項目的測量不確定度而言[1]，數(shù)值較大，究其原因：首先，氨基酸及肉堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測程序所用的標(biāo)本類型為濾紙干血斑，需要打孔取樣進(jìn)行前處理后再上機(jī)檢測。由于血斑上血量存在不同程度的分布不均勻情況，勢必造成重復(fù)打孔取樣誤差，而且前處理過程中還有轉(zhuǎn)移加樣操作，還存在加樣誤差。因此，相對于臨床生物化學(xué)檢驗常規(guī)項目的直接用血清(血漿)上機(jī)檢測，氨基酸及肉堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測程序的前處理過程加大了測量復(fù)現(xiàn)性引入的測量不確定度；其次，原衛(wèi)生部臨床檢驗中心新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查中的氨基酸和?；鈮A室間質(zhì)評活動(從2014年正式開始)發(fā)放的標(biāo)本中[9]，有些標(biāo)本的?；鈮A濃度過低(低于檢測系統(tǒng)的功能靈敏度，且酰基肉堿濃度降低對診斷遺傳代謝病意義不大)，容易造成偏倚過大，這也可能加大偏倚引入的測量不確定度。基于此，本次評估酰基肉堿的偏倚引入的測量不確定度未選擇濃度過低的標(biāo)本的檢測數(shù)據(jù)。

此外，本研究表明，參照衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)建議的臨床生物化學(xué)檢驗常規(guī)項目目標(biāo)不確定度設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)[3]，將原衛(wèi)生部臨床檢驗中心新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查中的氨基酸和?；鈮A室間質(zhì)評的允許總誤差指標(biāo)作為目標(biāo)擴(kuò)展不確定度是可行的，大部分氨基酸和?；鈮A的相對合成擴(kuò)展不確定度小于允許總誤差。對于大于目標(biāo)不確定度的檢測項目，應(yīng)該查找原因，改進(jìn)檢測程序，提高檢驗質(zhì)量，從而提高遺傳代謝病實驗診斷水平。

綜上所述，通過對氨基酸及肉堿非衍生

化串聯(lián)質(zhì)譜法配套檢測程序的測量不確定度的評估，不僅可以客觀地認(rèn)識檢測系統(tǒng)的性能，發(fā)現(xiàn)檢測系統(tǒng)存在的問題[10]，為持續(xù)改進(jìn)提供機(jī)會[11-12]，而且有助于實驗技術(shù)人員正確解讀檢測數(shù)據(jù)及臨床醫(yī)師正確使用檢驗報告。

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Evaluation on measurement uncertainty of detecting procedure of amino acids and carnitines by using non-derivatized tandem mass spectrometry method

ZHANGDaojie,TIANMingxin△,WANGXiaohui，SUNJiahui，JIWeiwei，CHANGHaitao，LUDongyu

(DepartmentofBiochemicalGenetics,BeijingShengyuanHuirenMedicalLaboratoryInstitute,Beijing101101,China)

ObjectiveTo evaluate the measurement uncertainty of the detecting procedure of amino acids and carnitines by the Waters ACQUITY TQD tandem mass spectrometer and PerkinElmer NeoBaseTMnon-derivatized MSMS kit,and to discuss the meaning of evaluation.MethodsAccording to the method provided by the Medical Laboratories-Evaluation and Expression of Measurement Uncertainty,the internal quality control was detected by using two different batch codes of kit for 20 d,once before and after the routine sample detection on each working day,the detector were randomly changed,and then the measurement uncertainty introduced by measurement reproducibility was calculated;the amino acid external assessment quality control data in 20 times of neonatal hereditary metabolic disease tandem mass spectrometry screening provided by the National Center for Clinical Laboratory in 2014 and 2015,and the same and 16 times of carnitines external assessment quality control data were performed the statistics,and then the measurement uncertainty introduced by bias was calculated.Next the relative standard uncertainty and the relative expanded uncertainty according to the measurement uncertainty introduced by bias and measurement reproducibility were calculated.The allowed total error indicators of amino acid and carnitines external quality assessment in the neonatal hereditary metabolic disease tandem mass spectrometry screening by the National Center for Clinical Laboratory were used as the target expanded uncertainty.ResultsThe relative expanded uncertainties of citrulline,methionine,phenylalanine,propionyl carnitine,octanoyl carnitine,dodecanoyl carnitine，palmitoyl carnitine and octadecanoyl carnitine were 19.1%-26.1%(k=2)，which were smaller than the target uncertainty.The relative expanded uncertainties of leucine,tyrosine,valine,free carnitine were 31.0%-43.3%(k=2)，which were greater than the target uncertainty.The uncertainty of isovaleryl carnitine needed to be estimated separately.ConclusionAssessing the measurement uncertainty of the detecting procedure of amino acids and carnitines by the non-derivatized tandem mass spectrometer method can not only provide an opportunity for continuously improving the detection quality，but also can help the experimental technique staffs to interpret the test data correctly and the clinician to use the detection reports correctly.

tandem mass spectrometer；non-derivatized；amino acid；carnitine；measurement uncertainty

張道杰，男，副主任技師，主要從事實驗室管理及遺傳代謝病的實驗診斷研究。△

，E-mail：tianmingxin@shengyuan.com.cn。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.026

A

1673-4130(2016)17-2423-04

2016-03-23

2016-05-29)