應(yīng)用通用熒光引物篩選裸鼴鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)方法的建立

林麗芳， 李 莉， 肖 邦， 程繼帥， 楊文靜， 叢 薇， 趙善民， 湯 球， 崔淑芳（. 第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 上海 00433； . 第二軍醫(yī)大學(xué)教學(xué)保障處， 上海 00433）

應(yīng)用通用熒光引物篩選裸鼴鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)方法的建立

林麗芳1， 李 莉2， 肖 邦1， 程繼帥1， 楊文靜1， 叢 薇1， 趙善民1， 湯 球1， 崔淑芳1
（1. 第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 上海 200433； 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)教學(xué)保障處， 上海 200433）

目的 建立使用通用熒光引物分步PCR法篩選裸鼴鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)的方法。方法 在特異性引物F鏈的5’端連接通用引物，先以特異引物R鏈和加長引物F鏈進(jìn)行PCR，再加入通用熒光引物進(jìn)行第二步PCR，最后使用瓊脂糖電泳和毛細(xì)管電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)以傳統(tǒng)的熒光引物PCR為對(duì)照。結(jié)果 瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，通用熒光引物PCR產(chǎn)生的目的片段清晰，引物特異性強(qiáng)，目的片段多態(tài)性與傳統(tǒng)PCR產(chǎn)生的多態(tài)性一致，且片段大小均比傳統(tǒng)PCR產(chǎn)生的目的片段大15 bp左右，與預(yù)期一致。毛細(xì)管電泳結(jié)果也顯示，通用引物PCR結(jié)果檢測(cè)的等位基因數(shù)與傳統(tǒng)熒光引物PCR方法產(chǎn)生的數(shù)量完全一致，無雜帶，擴(kuò)增效率高，具有較強(qiáng)的可操作性。結(jié)論 使用通用熒光引物分步PCR法結(jié)果可應(yīng)用于裸鼴鼠基因組大量微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選。

裸鼴鼠； 微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選； 通用熒光引物； PCR

裸鼴鼠作為一種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物， 近年來得到國際上廣泛重視［1-5］， 但對(duì)其遺傳學(xué)研究目前報(bào)道較少。遺傳背景清晰是裸鼴鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的重要前提，因此，裸鼴鼠的遺傳學(xué)研究迫在眉睫，尤其是分子遺傳學(xué)研究。但至今為止報(bào)道［6］的關(guān)于裸鼴鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)僅12個(gè)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足裸鼴鼠的遺傳多態(tài)性鑒定需要。因此近年來本實(shí)驗(yàn)室在建立裸鼴鼠封閉群并進(jìn)行一系列生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)上［7-10］，進(jìn)一步篩選裸鼴鼠高度多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，以期建立裸鼴鼠的遺傳學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，為裸鼴鼠的遺傳學(xué)檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)方法目前有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳。其中毛細(xì)管電泳最為靈敏， 且可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)， 操作過程相對(duì)簡單， 結(jié)果可靠， 是判斷的最終標(biāo)準(zhǔn)。但是篩選高度多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)以及鑒別個(gè)體的基因多態(tài)性過程中， 需要標(biāo)記每對(duì)熒光引物，產(chǎn)生巨額的費(fèi)用。此外，若位點(diǎn)的多態(tài)性低不具代表性，該引物將被淘汰，造成一定的浪費(fèi)。因此， Schuelke［11］采用通用熒光引物PCR的方法解決了基因分型的問題。

通用引物PCR的原理是: 在特異性引物F鏈的5’端加一段通用序列， 經(jīng)過多個(gè)PCR循環(huán)后， 目的片段將帶有通用序列及其互補(bǔ)序列。此時(shí)， 再將產(chǎn)物與通用熒光引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，終產(chǎn)物片段將標(biāo)記上熒光， 因此可以通過該熒光信號(hào)進(jìn)行PCR檢測(cè)。該方法很大程度上節(jié)省了實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，但已報(bào)道的研究主要針對(duì)物種的基因分型，未涉及通用熒光引物在微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選的應(yīng)用。本研究在應(yīng)用通用熒光引物的基礎(chǔ)上，調(diào)整PCR循環(huán)， 使用分步PCR方法，可操作性強(qiáng)，且具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，適用于裸鼴鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年裸鼴鼠由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖。

1.2 儀器及試劑

主要儀器有毛細(xì)管電泳儀、PCR儀、高速低溫離心機(jī)、恒溫干燥箱、分光光度計(jì)等。主要試劑有基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN，美國），PCR試劑盒（TAKARA，大連寶生物），毛細(xì)管檢測(cè)試劑盒（Beckman，美國），DL2000 DNA Marker、瓊脂糖等均購自上海生工生物公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及基因組DNA提取 隨機(jī)從裸鼴鼠群落中抽樣10只裸鼴鼠， 雌性各半， 年齡為7～10月齡， 各剪取約1 cm長尾尖部， 使用基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取， 作為下一步的PCR模板。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 引物由通用引物和特異性引物兩部分構(gòu)成。通用引物U為: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'（5'標(biāo)記FAM熒光）； 特異性引物則通過NCBI的Genbank，隨機(jī)查找具有多重復(fù)核苷酸序列的位點(diǎn)，以重復(fù)核苷酸序列為核心區(qū)域，使用PRIMER5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)， 在特異F鏈引物5'端連接通用引物U: U-F（無需標(biāo)記熒光）。同時(shí)對(duì)照組為傳統(tǒng)PCR，引物為特異性引物F鏈和R鏈。所有引物委托上海生工生物公司合成（表 1）。

1.3.3 通用熒光引物PCR檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)使用兩步的PCR進(jìn)行檢測(cè)。第一步將裸鼴鼠基因組DNA作為PCR模板， 以特異性引物R鏈和U-F鏈為引物進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為25 μL， 各組分的終濃度為: 0.05 U Taq 多聚酶/μL， 250 μmol/L dNTP， 50 mmol/L KCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 特異性引物（R鏈，U-F鏈）0.2 μmol/L， 0.5 μL DNA模板（30～60 ng）。PCR反應(yīng)程序: 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s， 退火溫度30 s， 72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min。第二步，PCR結(jié)束后在PCR反應(yīng)液中加入0.4 μL的通用引物U（10 μmol/L）， 混勻后進(jìn)行第二步的PCR。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃30 s，8個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min。

同時(shí)以普通PCR為對(duì)照，引物為特異性引物R鏈和F鏈。反應(yīng)體系為25 μL，各組分的終濃度為：0.05 U Taq 多聚酶/μL，250 μmol/L dNTP，50 mmol/L KCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 特異性引物（R鏈，F(xiàn)鏈）0.4 μmol/L， 0.5 μL DNA模板（30～60 ng）。PCR反應(yīng)程序: 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 本研究將10個(gè)基因組DNA樣本混合作為PCR模板，分別使用通用引物PCR和傳統(tǒng)PCR檢測(cè)不同位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物5-7、58-1、57-1、54-2、4-8，終產(chǎn)物分別于3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，上樣量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 μL，電泳條件為: 30 min，120 V。

1.3.5 毛細(xì)管電泳檢測(cè) 基于前期的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)裸鼴鼠位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物3-81，分別以5個(gè)不同裸鼴鼠個(gè)體的基因組DNA為模板，使用傳統(tǒng)熒光引物PCR方法（F鏈5'端標(biāo)記FAM熒光）和通用熒光引物PCR法進(jìn)行位點(diǎn)擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測(cè)分析。具體檢測(cè)步驟為: 將PCR產(chǎn)物稀釋10倍，稀釋后的PCR產(chǎn)物加入加樣板，在每個(gè)樣中加入上樣緩沖液（SLS，甲酰胺）以及分子量內(nèi)標(biāo)， 使用毛細(xì)管電泳儀（Beckman P/ACEMDQ）進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)定STR方法（溫度50 ℃； 進(jìn)樣2.0 kV， 30 s； 電泳5.0 kV， 62 min）進(jìn)行電泳檢測(cè)。熒光信號(hào)收集完畢后，用CEQ分析軟件自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析，并讀取峰值大小和峰值位置。

表 1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果

以基因組DNA混合樣本為模板，以引物5-7、58-1、57-1、54-2、4-8分別進(jìn)行通用熒光引物PCR和傳統(tǒng)PCR。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，通用熒光引物PCR產(chǎn)生的目的片段清晰，條帶數(shù)量與傳統(tǒng)PCR產(chǎn)生的片段數(shù)量一致，引物特異性強(qiáng)， 目的片段大小均比傳統(tǒng)PCR產(chǎn)生的目的片段大15 bp左右，結(jié)果可靠，具有較強(qiáng)的可操作性，該方法可應(yīng)用于裸鼴鼠基因組大量微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選（圖 1）。

2.2 毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)裸鼴鼠位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物3-81， 分別使用傳統(tǒng)熒光引物PCR方法（F鏈5'端標(biāo)記FAM熒光）和通用熒光引物PCR法對(duì)5個(gè)不同裸鼴鼠個(gè)體的基因組進(jìn)行位點(diǎn)擴(kuò)增后， 毛細(xì)管電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示， 通用引物PCR產(chǎn)生的等位基因數(shù)與傳統(tǒng)熒光引物PCR方法產(chǎn)生的數(shù)量完全一致， 無雜帶， 擴(kuò)增效率較高， 可用于裸鼴鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選（圖2）。

3 討論

本研究建立的分步通用熒光引物PCR方法從PCR反應(yīng)體系以及PCR反應(yīng)程序上都進(jìn)行了調(diào)整，與Schuelke［11］報(bào)道的方法比較，更適用于裸鼴鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選。同時(shí)，一條通用熒光引物可用于所有的位點(diǎn)篩選，避免了大量熒光引物的合成，可節(jié)約大量費(fèi)用。

通用熒光引物的設(shè)計(jì)，決定了該P(yáng)CR方法的可行性。通用熒光引物設(shè)計(jì)的原則為: 與裸鼴鼠基因組無同源性、引物長度在15～30 bp范圍內(nèi)、引物自身不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及二聚體等［12］。本實(shí)驗(yàn)引用Schuelke于2000年報(bào)道的通用引物［11］，經(jīng)驗(yàn)證，該通用引物與裸鼴鼠基因組無同源性，適用于裸鼴鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選。

本實(shí)驗(yàn)使用分步的PCR循環(huán)，結(jié)果比連續(xù)的PCR循環(huán)更為穩(wěn)定可靠。本實(shí)驗(yàn)先根據(jù)特異引物的最佳退火溫度進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR后，再加入通用引物，進(jìn)行8個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。瓊脂糖電泳和毛細(xì)管電泳結(jié)果都與預(yù)期一致，結(jié)果穩(wěn)定可靠。Schuelke［11］報(bào)道的通用熒光引物PCR方法中，將特異性引物和通用引物置于同一體系，兩次的PCR循環(huán)連續(xù)進(jìn)行。本研究顯示將特異性引物和通用引物置于同一體系檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性較差，部分引物的特異性降低，可能是通用引物的退火溫度與特異性引物的退火溫度較為接近，影響特異性引物的特異性擴(kuò)增。而裸鼴鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選由于位點(diǎn)數(shù)量多、引物退火溫度范圍廣、引物長度多樣性高，對(duì)通用熒光引物PCR的體系及PCR程序要求較高。

圖 1 不同微衛(wèi)星位點(diǎn)的通用熒光引物和傳統(tǒng)熒光引物PCR的瓊脂糖電泳

本研究中瓊脂糖電泳及毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果均表明，通用熒光引物分步PCR法對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性的分析結(jié)果與傳統(tǒng)熒光引物PCR方法一致。理論上，通用引物長為18 bp，因此，通用引物PCR產(chǎn)生的片段大小比傳統(tǒng)PCR產(chǎn)生的片段大18 bp。從瓊脂糖電泳的結(jié)果可見兩者產(chǎn)生的片段多態(tài)性、條帶清晰度一致，前者產(chǎn)生的片段比后者片段大約15 bp，符合預(yù)期。而進(jìn)一步的毛細(xì)管電泳結(jié)果也顯示，兩種方法檢測(cè)同一樣本的同一位點(diǎn)，產(chǎn)生的片段多態(tài)性一致，通用引物PCR產(chǎn)生的4個(gè)等位基因片段比傳統(tǒng)PCR產(chǎn)生的片段長度均長16 bp，與預(yù)期的18 bp小，可能是PCR過程結(jié)束時(shí)末端加堿基A所導(dǎo)致或者不同批次檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的差異引起，但是不影響對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性的分析及篩選。

圖 2 傳統(tǒng)熒光引物和通用熒光引物PCR方法的毛細(xì)管電泳

通用熒光引物PCR法節(jié)省了大量的實(shí)驗(yàn)成本，具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。檢測(cè)成本高是目前制約實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微衛(wèi)星遺傳檢測(cè)方法廣泛應(yīng)用的制約因素之一，其中熒光引物合成費(fèi)用在檢測(cè)費(fèi)用中占很大的比例。因此，通用熒光引物PCR方法的使用將在很大程度上降低檢測(cè)成本。

本研究建立的通用熒光引物PCR法結(jié)果表明，熒光通用引物分步PCR法結(jié)果穩(wěn)定可靠，能真實(shí)反映位點(diǎn)的多態(tài)性，檢測(cè)效率高、很大程度地節(jié)省了熒光引物的合成費(fèi)用，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，適用于裸鼴鼠多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選。

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Establishment of PCR Method Using Fluorescence Labeled Universal Primers for Screening Microsatellite Loci in Naked Mole Rat

LIN Li-fang1， LI Li2， XIAO Bang1， CHENG Ji-shuai1， YANG Wen-jing1，CONG Wei1， ZHAO Shan-min1， TANG Qiu1， CUI Shu-fang1
（1. Laboratory Animal Center， 2. Teaching Guarantee Department，Second Military University， Shanghai 200433， China）

Objective Fluorescent labeled universal primers PCR in two-steps was established to screen microsatellite loci of naked mole rat. Methods A fusion of the forward primer and universal primers in 5' end was created. The first PCR was conducted with reverse primers and forward primer extended with universal primers. The second PCR was initiated after the adding of fluorescent labed universal primers. With conventional fluorescent labeled primers PCR as a control， PCR product was detected by agarose gel electrophoresis and capillary electrophoresis. Results Fluorescent labeled universal primer PCR had strong specificity and bands in agarose gel electrophoresis was sharp. Furthermore， the product had high consistent polymorphism with those in traditional PCR， with size being about 15 bp. They were in line with expectations. After analysis of capillary electrophoresis， it also showel equal number of allele with these two different method. As well， this fluorescent labeled universal primer PCR had high amplification efficiency and being specific， operational. Conclusion The fluorescent labed universal primers PCR in two-steps was applicable to screen a high-flux of microsatellite loci in naked mole rat.

Naked mole rat； Screening microsatellite loci； Fluorescent labeled universal primers； PCR

Q95-33

A

1674-5817（2016）01-0076-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.016

2015-12-14

上海市科技發(fā)展基金項(xiàng)目（12140900400）與國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAI09B02）聯(lián)合資助

林麗芳（1986-）， 女， 助教。E-mail: linlifang2012@126.com

崔淑芳， 教授。E-mail: youngstar_sf@163.com