茶多酚抑菌作用的研究

楊航宇

(甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 甘肅 天水　741020)

?

茶多酚抑菌作用的研究

楊航宇

(甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 甘肅 天水741020)

以食品行業(yè)常見(jiàn)細(xì)菌和真菌為研究對(duì)象，采用平板稀釋法和濾紙片法測(cè)定了茶多酚對(duì)一些細(xì)菌和真菌的抑菌活性。結(jié)果表明：茶多酚對(duì)供試細(xì)菌有較強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、奇異變形桿菌、肺炎鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC100)均為0.9 μg/mL，而對(duì)銅綠假單胞桿菌的最低抑菌濃度(MIC100)為1.3 μg/mL；而茶多酚對(duì)供試的黃曲霉、點(diǎn)青霉和黑根霉均無(wú)明顯的抑菌作用。

茶多酚；平板稀釋法；濾紙片法; 抑菌作用

我國(guó)是世界上主要的茶葉生產(chǎn)國(guó)之一，茶葉資源非常豐富。茶葉中的有效成分——茶多酚，作為一種天然的抗氧化劑，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。茶多酚又名茶單寧、茶鞣質(zhì),是茶葉中所含有的一類多羥基酚類化合物的總稱，簡(jiǎn)稱為T(mén)P。其中主體兒茶素類為2-苯基苯并吡喃的衍生物，包括表兒茶素(EC)、沒(méi)食子兒茶素(GC)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)[1]?，F(xiàn)代研究已證實(shí)，茶多酚有止渴提神、延緩衰老[2-3]、抗腫瘤和抗輻射[4]等多種作用。而且，茶多酚的抑菌譜廣，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌均有抑制作用，如對(duì)肉制品中常見(jiàn)的致病菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌都有抑菌活性[5-6]；因此，茶多酚已大量應(yīng)用于食品、醫(yī)療、日用化工和輕工等領(lǐng)域[7-11]。但迄今為止，有關(guān)茶多酚對(duì)食品行業(yè)常見(jiàn)的細(xì)菌和真菌抑菌作用的研究較少。通過(guò)茶多酚對(duì)食品行業(yè)常見(jiàn)的細(xì)菌和真菌的抑菌活性，確定它在食品行業(yè)抑菌的最佳濃度，以期為食品行業(yè)無(wú)害防腐劑的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1菌種來(lái)源

供試細(xì)菌有大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠色假單桿菌(pseudomonasaeruginosa)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)和肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)； 供試霉菌為點(diǎn)青霉(Penicilliumnotatum)、黃曲霉(Aspergilluflaws)和黑根霉(Rhizopusnigricans)。

1.2培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基按標(biāo)準(zhǔn)方法配制，分裝滅菌備用。

1.3茶多酚

供試茶多酚由天水維康生物工程有限公司提供。茶多酚>950 mg/g,兒茶素>800 mg/g，EGCG>400 mg/g，咖啡堿<2 mg/g。使用時(shí),用無(wú)菌水配制成所需濃度的溶液。

1.4方法

1.4.1菌懸液的制備細(xì)菌菌懸液的制備:用接種環(huán)挑取3～4環(huán)在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠色假單桿菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌,用無(wú)菌生理鹽水將其制成含菌量105～106cfu/mL菌懸液，備用。

霉菌孢子懸液的制備：用接種環(huán)挑取4～5環(huán)28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d的點(diǎn)青霉、黃曲霉和黑根霉孢子置于無(wú)菌水中制成孢子濃度為1011～12cfu/L的孢子懸液。

1.4.2茶多酚抑菌效果試驗(yàn)采用濾紙片法[11]將茶多酚配成質(zhì)量濃度為2.1，1.3和0.5 μg/mL的水溶液(表1)，將已滅菌烘干的圓濾紙片(直徑為9 mm)浸入茶多酚溶液中10 h，撈出瀝干，貼于含菌平板中。每平板貼3片濾紙片，重復(fù)3次，細(xì)菌和真菌分別培養(yǎng)24和96 h，測(cè)定抑菌圈大小,以無(wú)菌水作為對(duì)照。

1.4.3最低抑菌濃度(MIC100)的測(cè)定采用平板稀釋法[12-13]，將茶多酚配成質(zhì)量濃度為2.1、1.7、1.3、0.9、0.5、0.1 μg/mL移取0.5 mL各質(zhì)量濃度的茶多酚溶液于滅菌平板中,再滴入0.5 mL的菌懸液,傾入15 mL融化后冷卻至45℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,讓其充分混勻,待含菌培養(yǎng)基凝固后，倒置培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，重復(fù)3次。以只加菌懸液為對(duì)照。

1.4.4抑菌率的計(jì)算根據(jù)平板菌落數(shù)計(jì)算抑菌率，抑菌率=(對(duì)照皿菌落數(shù)-試驗(yàn)皿菌落數(shù)) /對(duì)照皿菌落數(shù)×100%[13]。

1.5試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

采用二因素多水平方差分析，其中A因素(試驗(yàn)所需供試菌)設(shè)9個(gè)水平；B因素 (茶多酚濃度)設(shè)7個(gè)水平(含對(duì)照組)。運(yùn)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)抑菌試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，不同試驗(yàn)菌及茶多酚不同濃度之間的差異顯著性均采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1茶多酚抑菌作用

茶多酚對(duì)供試的黃曲霉、點(diǎn)青霉和黑根霉均無(wú)明顯的抑菌作用,而對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠色假單桿菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌6種細(xì)菌有較明顯的抑菌作用(表1)。被抑制的細(xì)菌中既有革蘭氏陽(yáng)性菌又有革蘭氏陰性菌,既有球菌,又有桿菌,可見(jiàn)，茶多酚對(duì)細(xì)菌有著廣譜的抑菌作用。

2.2茶多酚對(duì)6種細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC100)

不同質(zhì)量濃度的茶多酚均對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌和肺炎鏈球菌、銅綠假單桿菌有明顯的抑菌作用，其與對(duì)照之間差異顯著(P<0.05)。隨著茶多酚濃度的增加,對(duì)6種細(xì)菌的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度增加到0.9 μg/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌和肺炎鏈球菌完全抑制其生長(zhǎng)，因此，其MIC100為0.9 μg/mL；而當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度增加到1.3 μg/mL時(shí)，可以100%抑制銅綠假單桿菌的生長(zhǎng)，因此，其MIC100為1.3 μg/mL(表2)。

表1　茶多酚的抑菌作用

表2　不同濃度茶多酚處理下細(xì)菌的生長(zhǎng)

注：0表示無(wú)菌落生長(zhǎng)；P<0.05

2.3不同濃度茶多酚對(duì)6種細(xì)菌的抑菌率

當(dāng)供試濃度為0.9 μg/mL時(shí)，茶多酚對(duì)6種細(xì)菌均有抑菌作用，抑菌率均到97.5%。對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠色假單桿菌、奇異變形桿菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌的抑制率分別為100%、100%、97.5%、100%、100%、100%，與0.5、0.1 μg/mL的供試濃度差異顯著。供試濃度0.5 μg/mL，茶多酚對(duì)6種供試細(xì)菌的抑菌率減小,對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠色假單桿菌、奇異變形桿菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌的抑制率分別為68.6%、57.5%、58.1%、67.1%、50%、76.6%。供試濃度0.1 μg/mL，茶多酚對(duì)6種供試細(xì)菌的抑菌率小，均小于36.7%。表明在一定的濃度范圍，隨著茶多酚質(zhì)量濃度的減小，茶多酚的抑菌活性減小。茶多酚濃度0.1～0.5 μg/mL，供試細(xì)菌對(duì)藥液的作用不敏感；且在同一濃度下，6 種供試細(xì)菌對(duì)茶多酚的敏感性也有所差異。

表3　茶多酚對(duì)6 種供試細(xì)菌的抑菌率

注：P<0.05；A、B、C、D為不同濃度之間的差異性；a、b、c、d為不同菌種之間的差異性

3　討論

錢(qián)麗紅等[16]的研究表明，茶多酚對(duì)一些病原細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、變形桿菌、綠膿桿菌、肉毒桿菌等)有明顯的抑制和殺滅作用,其主要機(jī)理是茶多酚可以阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的正常表達(dá),以致影響其細(xì)胞的結(jié)構(gòu)組成以及酶的催化活性,終導(dǎo)致細(xì)菌正常生理功能的喪失。研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚對(duì)黃曲霉、點(diǎn)青霉和黑根霉無(wú)明顯的抑制作用，這與唐裕芳等[17]的報(bào)道茶多酚對(duì)一些霉菌(橘青霉、黃曲霉、總狀毛霉、米根霉)無(wú)明顯抑制作用的結(jié)論基本相似，這些相似的結(jié)論說(shuō)明，霉菌對(duì)茶多酚不敏感，茶多酚對(duì)食品中常見(jiàn)的霉菌并沒(méi)有明顯抑制作用。因此，茶多酚可運(yùn)用于食品中來(lái)防治細(xì)菌的污染。

茶多酚廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、輕工業(yè)等領(lǐng)域，在使用過(guò)程中，如果其濃度過(guò)低，起不到抑菌作用,但是濃度過(guò)高又會(huì)造成浪費(fèi)。所以，本研究以節(jié)約成本為出發(fā)點(diǎn)，確定茶多酚抑菌的合適濃度為1.3 μg/mL，此濃度對(duì)常見(jiàn)的食品污染細(xì)菌有明顯的抑制作用，這為生產(chǎn)中開(kāi)發(fā)和利用茶多酚奠定了理論基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

以茶多酚為原料，測(cè)定了茶多酚對(duì)6種細(xì)菌和3種霉菌的抑菌活性,研究發(fā)現(xiàn)：茶多酚有對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠色假單桿菌、奇異變形桿菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌有明顯的抑制作用,而且隨著茶多酚濃度的增加,其抑菌率隨之增加。

[1]楊彩霞，朱宇匯，張繼.常見(jiàn)茶多酚純化工藝探究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2011,32(1):169-171.

[2]陳為鈞,萬(wàn)圣勤.茶葉中多酚類物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),1994,6(3):75-80.

[3]傅錦坤，于臘佳.茶多酚對(duì)自由基抑制效應(yīng)[J].廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1998,37 (5):727-731.

[4]方若瑩,方國(guó)明,俞越漢,等.茶多酚和槲皮素對(duì)全血吞噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的抑制作用[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào),1998,32 (2):163-167.

[5]白傳記,孔德榮,張淑偉,等.茶多酚抑菌活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].肉品衛(wèi)生,1997(5):3-5.

[6]Almajano M P,Carbó R,Jiménez J A L,etal.Antioxidant and antimicrobial activities of tea infusions[J].Food Chemistry,2008,108(1):55-63.

[7]董金莆,李瑤卿,洪紹梅.茶多酚對(duì)8種致病菌最低抑制濃度的研究[J].食品科學(xué),1995,16(1):6-12.

[8]楊賢強(qiáng).天然抗氧化劑-茶多酚的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[J].福建茶葉,1990(3):9-13.

[9]董士林.茶葉天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J].茶葉通訊,1991(1):21-24.

[10]舒慶齡.茶多酚在化妝品中的應(yīng)用研究[J].茶葉通報(bào),1996(2):39-40.

[11]錢(qián)存柔.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京:北京大學(xué)出版社,1999.

[12]張文治.新編食品微生物學(xué)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1995.

[13]陳海波.幾種殺菌劑對(duì)草坪草腐霉枯萎病的防治試驗(yàn)[J].草原與草坪，2009(2):18-20

[14]趙強(qiáng)，王廷璞，余四九，等.紅茂草生物堿抑菌活性的測(cè)定[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2008,38(12)：1098-1101

[15]Lennette E H,Schmidt N.Diagnostic procedures for viral and rickettsial infections,5th edition[M].Washington：American Public Health Association,1979.

[16]錢(qián)麗紅，陶妍，謝晶.茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010,37(11):1628-1633

[17]唐裕芳，張妙玲，馮 波，等.茶多酚的抑菌活性研究[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005,22(5):553-557

Study of antimicrobial activities of tea polyphenol

YANG Hang-yu

(GansuForestryTechnologyCollege,Tianshui741020,China)

To understand the antimicrobial activities of tea polyphenol in food industry,some bacteria and fungi of food industry were selected as the objects in the study.The effects of tea polyphenols on these bacteria and fungi were determined by plate dilution and filter paper method.The results showed that the antimicrobial activity of tea polyphenols was strong to bacteria.Minimal inhibitory concentration (MIC100) of tea polyphenols toEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,Bacillussubtilis,ProteusmirabilisandStreptococcuspneumoniaewas 0.9 μg/mL,while MIC100of tea polyphenols to Pseudomonas aeruginosa was 1.3 μg/mL.The antimicrobial activity of tea polyphenols against Penicillium notatum,Aspergillu flaws and Rhizopus nigricans was not obvious.

tea polyphenols；plate dilution method；filter paper method；antimicrobial activity

2015-10-16；

2016-04-12

國(guó)家自然科學(xué)基金(41261014，41001025)；甘肅省高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2013); 2014年中央財(cái)政林業(yè)防災(zāi)減災(zāi)項(xiàng)目(2130234)資助

楊航宇(1978-)，男，甘肅隴南人，副教授，碩士，主要從事植物源農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)研究。

E-mail：yhy-780601@163.com

TS 201

A

1009-5500(2016)04-0078-04