糖化白蛋白酶法測定試劑研制與評價

連國軍，潘利琴，李寶青，陳青松

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)　環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江　溫州　325035；2.溫州市人民醫(yī)院　檢驗科，浙江　溫州325000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院　檢驗科，浙江　溫州　325027；4.浙江夸克生物科技有限公司，浙江　紹興　312500）

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·技術(shù)與方法·

糖化白蛋白酶法測定試劑研制與評價

連國軍1，潘利琴2，李寶青3，陳青松4

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江溫州325035；2.溫州市人民醫(yī)院檢驗科，浙江溫州325000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，浙江溫州325027；4.浙江夸克生物科技有限公司，浙江紹興312500）

目的：研發(fā)糖化白蛋白（GA）酶法測定試劑并進行方法學(xué)評價。方法：利用特異性的蛋白酶（PR）在3 min內(nèi)裂解GA并釋放出糖化氨基酸，然后利用酮胺氧化酶進行氧化并釋放出過氧化氫，過氧化氫經(jīng)Trinder’s反應(yīng)顯色后，與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)溶液比較求得GA含量。結(jié)果：該試劑批內(nèi)、批間不精密度（CV）分別為0.84%～1.88%和1.14%～2.35%；線性范圍為1.3～1 200 μmol/L，血清樣本2～16倍稀釋范圍與原倍血清的百分偏差在99.3%～108.6%之間，平均回收率為101.8%；血清中膽紅素＜35 mg/dL，甘油三酯（TG）＜750 mg/dL，血紅蛋白＜200 mg/dL，膽汁酸＜8 mg/dL，尿酸＜33 mg/dL，葡萄糖＜1 800 mg?dL-1，維生素C 15 mg/dL，EDTA?K22.5 mg/dL，肝素鈉80 U/L，枸櫞酸鈉8.0 mg/dL，對550 μmol/L GA的檢測干擾＜±5%。與日本ASAHI公司提供的GA測定試劑方法進行比較，回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為Y=0.9991X+ 0.0809，r=0.9958；試劑置4 ℃開蓋儲存至少穩(wěn)定30 d，置4 ℃加蓋儲存至少穩(wěn)定12個月。結(jié)論：GA酶法測定試劑精密度良好，線性范圍寬，稀釋準(zhǔn)確性滿足臨床需要，回收率較高，抗干擾能力較強，與進口試劑相關(guān)性好，具有推廣應(yīng)用價值。

糖化白蛋白；酶法檢測；試劑

糖化白蛋白（glycated albumin，GA）是血清白蛋白被葡萄糖糖化之后的產(chǎn)物，即血清白蛋白的賴氨酸殘基上的ε-氨基基團被糖化。GA半衰期較短，測定GA的濃度可有效反映患者過去2～3周內(nèi)平均血糖的水平，并不受臨時血糖濃度波動的影響，因此，測定GA可更靈敏、更確切地反映較短期內(nèi)糖尿病的控制程度［1-4］。目前國內(nèi)臨床主要應(yīng)用日本ASAHI公司推出的酮胺氧化酶法檢測試劑進行GA含量測定，該測定試劑無需調(diào)配即可直接使用，置2～8 ℃保存可穩(wěn)定12個月，但該檢測試劑依賴進口、價格昂貴，限制了其在臨床的進一步推廣應(yīng)用。本研究參考有關(guān)文獻［5-7］，在國內(nèi)率先建立了酮胺氧化酶法測定GA的新方法，該法首選利用特異性的蛋白酶（PR）在3 min內(nèi)裂解GA并釋放出糖化氨基酸，然后利用酮胺氧化酶進行氧化并釋放出過氧化氫，過氧化氫經(jīng)Trinder’s反應(yīng)顯色后，與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)溶液比較求得GA含量。依據(jù)該方法研發(fā)的液體即用型GA檢測試劑，可應(yīng)用于目前廣泛使用的各類型全自動生化分析儀，方法快速、準(zhǔn)確，具有臨床推廣應(yīng)用價值，報告如下。

1　材料和方法

1.1材料 收集溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科40份健康體檢者臨床血液標(biāo)本每份5 mL作為檢測對象，并另選男女各90名體檢合格成年人，年齡18～60歲，空腹靜脈采血5 mL，共采集180份血清標(biāo)本用于參考值測定；GA校準(zhǔn)品：同時期收集肝功能正常，HBsAg陰性，無脂濁、黃疸、溶血的健康體檢者的新鮮血清200份，混勻，3 000 r/min離心30 min，取上清，每瓶1 mL分裝，凍干，使用時每瓶加去離子水1 mL復(fù)溶，用HPLC法定值［8］。試劑I：含pH 7.5 Tris-HCl 50 mmol/L緩沖液、20 KU/L PR （XXVI I）、1.0 mL/L TritonX-100、5 mmol/L CaCl2、2 g/L聚乙二醇6 000、2.0 mmol/L 4-氨基安替比林、球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑、適量穩(wěn)定劑；試劑I I：含pH 7.5 Tris-HCl 50 mmol/L緩沖液、30 KU/L酮胺氧化酶、50 KU/L過氧化物酶、2.0 mmol/L TOOS、1.0 mL/L TritonX-100、適量穩(wěn)定劑。所用試劑從上海國藥采購，純度為分析純，水為去離子水。UV-2201紫外可見分光光度計（日本島津株式會社），OLYMPUS AU5400全自動生化分析儀（日本OLYMPUS光學(xué)株式會社），pHS-3C酸度計（上海雷磁分析儀器廠）。

1.2方法

1.2.1全自動生化分析儀參數(shù)：反應(yīng)類型：雙波長終點法；波長：（主）550 nm/（次）700 nm；反應(yīng)溫度：37 ℃；樣品5 μL加試劑I 200 μL，反應(yīng)3～5 min后讀取第1點吸光度A1，然后加試劑II 50 μL繼續(xù)反應(yīng)5 min讀取第2點吸光度A2，計算ΔA=A2-A1，與標(biāo)準(zhǔn)比較后定量。計算過程由儀器自動計算完成。

1.2.2精密度評價：依據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）EP15-A2［9］文件所提供方案，用本法試劑分別測定低、中、高3份混合血清樣本，1 d內(nèi)連續(xù)測定20次用于計算批內(nèi)不精密度（CV），每天測定1次、連續(xù)測定12 d用于計算批間CV。

1.2.3線性范圍評價：用0.9%氯化鈉溶液（B）和一份高濃度混合血清（H），按0.9B∶0.1H、0.8B∶0.2H、0.7B∶0.3H、0.6B∶0.4H、0.5B∶0.5H、0.4B∶0.6H、0.3B∶0.7H、0.2B∶0.8H、0.1B∶0.9H、1.0H的比例，配成10個濃度梯度的混合血清，其預(yù)期濃度按公式X=（CH×VH）/（VB+VH）進行計算。測試時按照低濃度到高濃度的順序?qū)γ總€標(biāo)本各測定5次，按照CLSI EP6-A文件［10］提供的方案檢查數(shù)據(jù)，以測定值為Y、預(yù)期濃度為X，繪制校準(zhǔn)曲線，求得線性方程和相關(guān)系數(shù)r。

1.2.4最低檢出限（LOD）和最低定量限（LOQ）驗證：通過重復(fù)10次檢測空白溶液獲得的空白值和標(biāo)準(zhǔn)差s來估計LOD和LOQ。計算公式為：LOD=+3s，LOQ=+10s。

1.2.5稀釋驗證試驗：取1份混合血清用0.9%氯化鈉溶液進行1∶2、1∶4、1∶8、1∶16倍比稀釋，稀釋后的樣本各測定5次，計算測定均值乘以稀釋倍數(shù)的結(jié)果與原倍血清測定結(jié)果的Diff%。

1.2.6回收率驗證：在1份已測得GA濃度的混合血清樣本中分別加入低、中、高GA標(biāo)準(zhǔn)液，得到標(biāo)準(zhǔn)品混合血清工作液；另取混合血清樣本和校準(zhǔn)品加0.9%氯化鈉溶液至標(biāo)準(zhǔn)品混合血清工作液同樣體積，測試回收率?；厥章?［（標(biāo)準(zhǔn)品混合血清工作液實測濃度-混合血清實測濃度）/校準(zhǔn)品實測濃度］×100%。

1.2.7干擾實驗：根據(jù)CLSI EP7-A2文件［11］提供的方案，將膽紅素、甘油三酯（TG）、血紅蛋白、膽汁酸、尿酸、葡萄糖、維生素C、EDTA?K2、肝素鈉、枸櫞酸鈉干擾物按要求進行配制，制成含特定量干擾物的血清，含有的膽紅素終濃度為35 mg/dL，TG為750 mg/dL、血紅蛋白為200 mg/dL、膽汁酸為8 mg/dL、尿酸為33 mg/dL、葡萄糖為1 800 mg/ dL、維生素C 15 mg/dL、EDTA?K22.5 mg/mL、肝素鈉80 U/L、枸櫞酸鈉8.0 mg/mL，同時以樣品中加入相同體積的0.9%氯化鈉溶液作基礎(chǔ)樣品，用本法試劑測定每個混合血清各3次，求均值，計算添加各干擾物后血清GA測定值與干擾物濃度為0時的Diff%，以±5%為標(biāo)準(zhǔn)判斷是否存在干擾。

1.2.8方法比對試驗：參考CLSI EP9-A2文件［12］提供的方案，用本法試劑和日本ASAHI公司提供的GA測定試劑分別測定100例血清標(biāo)本，以本法測得的結(jié)果為X，ASAHI公司測定的結(jié)果為Y，進行線性回歸，求得線性方程和相關(guān)系數(shù)r。

1.2.9試劑穩(wěn)定性驗證：將新配的GA測定試劑分成A、B 2組，A組在全自動生化分析儀4 ℃試劑倉中開蓋儲存30 d，B組在4 ℃冰箱加蓋儲存12個月，測定2組試劑空白管及濃度為800 μmol/L的GA標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值、含量為（855±90.5）μmol/L的GA質(zhì)控品測定值，每個樣本重復(fù)測定3次，求均值，用于判斷試劑穩(wěn)定性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用Excel 2003和SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。相關(guān)分析采用線性相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1精密度評價 按本法測定3份不同GA含量的混合血清標(biāo)本，批內(nèi)CV（每個樣品用本法平行測定20次）在0.84%～1.88%之間，批間CV（每個樣品用本法連續(xù)測定12 d）在1.14%～2.35%之間，精密度良好，可滿足臨床應(yīng)用，見表1。

表1　血清GA檢測精密度

2.2線性范圍、LOD和LOQ評價結(jié)果 取濃度1 200μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液1份，按本研究所述方法進行校準(zhǔn)曲線繪制，所得線性回歸方程為Y（理論值）= 1.014X（測量值）-5.54，r=0.9999，表明線性可達1 200 μmol/L。按本研究所述LOD和LOQ評價方法，測定試劑的LOD為1.3 μmol/L，LOQ為3.8 μmol/L。2.3 稀釋驗證試驗 取一份濃度為1 025 μmol/L的混合血清，用本研究所述方法進行稀釋驗證，用去離子水在2～16倍稀釋范圍與原倍血清的百分偏差在99.3%～108.6%之間，滿足臨床需要。

2.4回收率驗證 取1份濃度為275 μmol/L的混合血清，加入不同量的GA標(biāo)準(zhǔn)液進行回收試驗，見表2。GA檢測平均回收率為101.8%。

表2　血清GA檢測回收率

2.5干擾實驗 用本法試劑測定含不同濃度干擾物的混合血清，以±5%為標(biāo)準(zhǔn)判斷是否存在干擾，對于GA濃度為550 μmol/L的血清檢測，各干擾物質(zhì)的最大允許濃度為：膽紅素35 mg/dL，TG 750 mg/dL、血紅蛋白200 mg/dL、膽汁酸8 mg/dL、尿酸33 mg/dL、葡萄糖1 800 mg/dL、維生素C 15 mg/dL、EDTA?K22.5 mg/dL、肝素鈉80 U/L、枸櫞酸鈉8.0 mg/dL。

2.6方法比對實驗 取100例血清標(biāo)本，用本法試劑和日本ASAHI公司提供的GA測定試劑分別測定，本法（X）測得的GA平均值為104.2 μmol/L（6.93 g/L），日本ASAHI公司試劑（Y）測定的GA平均值105.3 μmol/L（7.00 g/L），回歸方程為Y=0.9991X+ 0.0809，r=0.9958，經(jīng)t檢驗，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.7試劑穩(wěn)定性驗證 按本研究所述方法進行試劑穩(wěn)定性驗證，見表3。2組試劑到達儲存時間后，空白管及標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值基本恒定，質(zhì)控品測定值相對偏差＜10%，說明本法GA測定試劑具有良好的穩(wěn)定性。

表3　GA測定試劑穩(wěn)定性試驗

2.8 參考值 用本研究所述方法測定180名體檢合格成年人（男90名，女90名，年齡18～60歲）血清GA濃度，測得結(jié)果血清GA（±s）為（85.5±14.6）μmol/L，參考范圍（±2s）：56.3～114.7 μmol/L。

3　討論

糖尿病是現(xiàn)代疾病中的第二殺手，其對人體的危害僅次于癌癥。臨床診斷糖尿病的常用指標(biāo)有血清（漿）葡萄糖和糖化血紅蛋白A1c（HbA1c）。血清（漿）葡萄糖受飲食影響較大，很難準(zhǔn)確反映糖尿病的控制程度，HbA1c雖受飲食影響較小，但日變化幅度小，反映過去2～3個月的總血糖水平，不能及時反映糖尿病的控制程度。GA半衰期較短，測定GA的濃度可有效反映患者過去2～3周內(nèi)平均血糖的水平，并不受臨時血糖濃度波動的影響。因此，GA可更靈敏、更確切地反映較短期內(nèi)糖尿病的控制程度［1-4］。

在建立酶法測定GA方法學(xué)及試劑前，臨床通常采用NBT法測定GSP（果糖胺）代替GA反應(yīng)過去2～3周內(nèi)平均血糖的水平，存在易受血清還原性物質(zhì)干擾、特異性差的缺點。本研究在有關(guān)文獻［5-7］的基礎(chǔ)上，通過特異性PR和球蛋白抑制劑的使用，研發(fā)了液體型GA酶法檢測試劑，該試劑精密度良好，線性范圍寬，稀釋準(zhǔn)確性滿足臨床需要，回收率較高，抗膽紅素、TG等內(nèi)源性干擾物和維生素C、EDTA?K2等外源性干擾物干擾能力較強，與日本ASAHI公司提供的GA測定試劑方法進行比對，兩者檢測結(jié)果無顯著性差異，但試劑成本僅為進口試劑銷售價格的1/8左右，具有實際推廣應(yīng)用價值。

本研究在全自動生化分析儀上的對所研發(fā)的GA測定試劑分析性能進行了驗證，測試結(jié)果表明，方法的批內(nèi)CV和批間CV分別在0.84%～1.88%和1.14%～2.35%之間，GA濃度在5～1 200 μmol/L之間線性良好，用去離子水在2～16倍稀釋范圍與原倍血清的百分偏差在99.3%～108.6%之間，方法平均回收率為101.8%，試劑抗膽紅素等物質(zhì)干擾的能力較強，與ASAHI公司提供的GA測定試劑進行對比相關(guān)性好，測定試劑置4 ℃加蓋保存至少穩(wěn)定12個月，各項方法學(xué)指標(biāo)均能滿足臨床需求。限于實驗條件，本研究僅在全自動生化分析儀上進行了各項方法學(xué)指標(biāo)測試，在不同實驗室、不同分析儀上的性能與本研究結(jié)果是否相同，尚有待進一步工作確認(rèn)。

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（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

The development and evaluation of glycated albumin enzymatic determination reagent

LIAN GuojunPAN Liqin2, LI Baoqing3, CHEN Qingsong4.1, 1.School of Environmental Science and Public Health, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Laboratory Tests, the Wenzhou People’s Hospitol, Wenzhou, 325000; 3.Department of Laboratory Tests, the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 4.Zhejiang Kuake Bioscience Co.Ltd, Shaoxing, 312500

Objective: To develop and evaluate the serum glycated albumin enzymatic determination reagent. Methods: The analysis was based on the fact that the glycated albumin glycated albumin was hydrolyzed to glycated amino acids by special proteinase digestion， and glycated amino acids were oxidized to produce hydrogen peroxide， which was quantitatively measured through the Trinder's chromogenic reaction， compared with the same treatment of the standard solution. Results: The within-run and between-run CVs of this reagent were 0.84%～1.88% and 1.14%～2.35%， respectively； the method was liner in the range of 1.3～1 200 μmol·L-1， percent deviation of the measured results of diluted serum samples diluted by 2 to 16 times compared to the results of the original samples ranged from 99.3%～108.6%， the average rate of recovery was 101.8%； No signifi cant interference （bias%≤±5%） was found in the test of 550 μmol·L-1GA analysis when bilirubin ＜35 mg·dL-1， triglyceride＜750 mg·dL-1， hemoglobin ＜200 mg·dL-1， bile acid ＜8 mg·dL-1， uric acid ＜33 mg·dL-1，glucose ＜1800 mg·dL-1， Vitamin C ＜15 mg·dL-1， EDTA·K2＜2.5 mg·mL-1， Heparin Sodium ＜80 U·L-1， Sodium citrate ＜8.0 mg·mL-1. Comparing this methods （Y） with the ASAHI method （X）， the regression equations is Y=0.9991X+0.0809， r=0.9958. The reagent was stable at least 30 days when it was open cover stored and at least 12 months when it was sealed stored at 4 ℃. Conclusion: This reagent shows high precision， wide linear range，and the dilution accuracy can meet the clinical needs. It also shows high recovery， good anti-interference capability， good correlation with imported reagent， and suitable for clinical application.

glycated albumin； enzymatic determination； reagent

R446

B DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.07.011

2015-05-12

浙江省科技廳公益技術(shù)研究社會發(fā)展項目（2013C33240）。

連國軍（1976-），男，浙江上虞人，副教授。