免疫球蛋白重鏈基因重排檢測在原發(fā)性胃腸道B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤中的應(yīng)用研究

姜黃　鄭麗華　楊金花

[摘要]目的探討多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測免疫球蛋白重鏈基因重排在原發(fā)性胃腸道淋巴組織增生性疾病中的良惡性鑒別中的應(yīng)用價(jià)值。方法選取存檔蠟塊45例，采用HE常規(guī)染色及SP免疫組化方法進(jìn)行組織學(xué)分類，運(yùn)用PCR半巢式擴(kuò)增免疫球蛋白重鏈基因重排，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。結(jié)果IgH FR3A和IgH FR3A+FR2A在MALT淋巴瘤的陽性檢測率分別為60.7%（17/28）和75.0%（21/28），在DLBCL中的陽性檢測率分別為60.0%（9/15）和73.3%（11/15），在MCL中的陽性檢測率分別為100.0%（1/1）和100.0%（1/1）。IgH FR3A在胃腸道淋巴瘤中的陽性檢測率為60.0%。IgH FR3A聯(lián)合IgH FR2Ad在胃腸道淋巴瘤中的陽性檢出率為73.3%（33/45）。結(jié)論采用PCR方法檢測免疫球蛋白重鏈基因重排能夠作為淋巴瘤診斷的有效輔助手段，有助于對原發(fā)性胃腸道淋巴組織增生性疾病的良惡性做出正確的診斷。

[關(guān)鍵詞]胃腸道淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；基因重排；多聚酶鏈反應(yīng)；免疫球蛋白重鏈基因

[中圖分類號]R733

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]2095-0616（2016）03-29-04

淋巴瘤是起源于淋巴組織及淋巴結(jié)的惡性腫瘤，原發(fā)性胃腸道淋巴瘤是結(jié)外淋巴瘤的最好發(fā)部分。原發(fā)性胃腸道淋巴瘤占結(jié)外淋巴瘤的30%～45%。原發(fā)性淋巴瘤由于其臨床表現(xiàn)無特殊性，尤其在早期的惡性淋巴瘤由于其更缺乏特異性，因此臨床較難做出正確診斷，易造成誤診。病理診斷淋巴瘤較為可靠，借助形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)能對大部分淋巴瘤做出明確的診斷，但對一些疑難病例仍然不能做出正確診斷，未能得到及時(shí)的正確診斷不利于臨床醫(yī)生做出最佳的治療方案和進(jìn)行必要的預(yù)后評估。近年來，針對淋巴瘤免疫球蛋白重鏈（immunoglobulin heavy chain，IgH）基因重排檢測已經(jīng)成為臨床上診斷淋巴瘤的一項(xiàng)必要手段，成為鑒別診斷淋巴瘤的一種新的有力工具，

本研究對此進(jìn)行初步研究。

1.資料與方法

1.1一般資料

收集2008年10月～2014年10月鄭州人民醫(yī)院收治胃腸道B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（Bcell non-Hodgkin lymphoma，B-NHL）45例，來自內(nèi)鏡活檢和手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。男27例，女18例，年齡21-77歲（中位年齡52歲）。陽性對照為Raii細(xì)胞株，陰性對照為1例淋巴組織反應(yīng)性增生。

1.2臨床表現(xiàn)

45例胃腸道B-NHL患者中出現(xiàn)腹痛37例（82.2%），腹脹10例（22.2），血便10例（22.2%），發(fā)熱8例（17.8%），腹部包塊7例（15.6%），黑便6例（13.3%），消瘦5例（11.1%），黏液便5例（11.1%），腹瀉2例（4.4%）。45例病變累及胃21例（46.7%），小腸2例（4.4%），回盲部3例（6.7%），結(jié)腸10例（22.2%），直腸3例（6.37%），小腸合并結(jié)腸1例（2.7%）。其中表現(xiàn)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例（57.8%），未查見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例（42.3%）。

1.3方法

1.3.1免疫組化所有標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、4-5um連續(xù)組織切片，除進(jìn)行常規(guī)HE染色以外，采用免疫組化S-P法進(jìn)行免疫表型標(biāo)記：LCA（2B11，DAKO）、CD3（F7.2.38，DAKO），CD45RO（OPD4，DAKO）、CD20（L26，DAKO）、CDIO（MX002，DAKO）、CDl5（Carb-3，DAKO）、CD30（Ber-2、DAKO）、Bcl-2（SP66，DAKO）、Bcl-6（LN22，DAKO）、CyclinD-1（DCS-6，DAKO）、PAX-5（SP34，DAKO）、kappalight chain（L1C1，DAKO）

和lambda light chain（LAM03+HP6054，DAKO）標(biāo)記輕鏈。依據(jù)不同免疫表型表達(dá)情況并根據(jù)2008年WHO淋巴及造血系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對所有病例進(jìn)行分類。

1.3.2組織分型常規(guī)HE制片，結(jié)合免疫組化結(jié)果，所有病例經(jīng)由2位以上病理學(xué)專家共同閱片確診為非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤，其中胃腸道黏膜相關(guān)淋巴瘤（mucosa associated lymphoid tissuelymphoma，MALT）28例，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）15例，濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，F(xiàn)L）1例，套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）1例。

1.3.3DNA提取及半巢式PCR反應(yīng)石蠟組織10um連續(xù)切片5張，常規(guī)酚一氯仿法抽提DNA。采用半巢式PCR。一致性v區(qū)引物（FR2A）：5TGGA/GTC CGC/A CAG G/CCT/C T/CCN GG 3一致性V區(qū)引物（FR3A）：5ACA CGG C（C/T）（G/C）TGT ATT ACT GT 3，（J區(qū)引物）LJH：5TGAGGA GAC GGT GAC C 3，（J區(qū)引物）VLJH：5GTG ACC AGG GT（A/G/C/T）CCT TGG CCCCAG 3。進(jìn)行半巢式反應(yīng)，第一輪PCR用引物FR3A（FR2A）+LJH，其產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，F(xiàn)R3A（FR2A）+VLJH進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)?？傮w積25uL：10×buffer 2.5uL，MgCl，1.8uL（終濃度1.8mM），dNTP 1.5uL（終濃度10uM），引物各0.2uL終濃度200nM），TaqPlus酶0.2uL（1u），模板DNA 1UL，體積不足部分雙蒸水補(bǔ)足。所有PCR反應(yīng)均在94℃預(yù)變性6min，94℃變性lmin，55℃退火lmin，72℃延伸lmin，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后在72℃延伸10min，然后4～C放置。產(chǎn)物長度70-130bp。已知陽性病例做陽性對照，反應(yīng)性淋巴組織增生做陰性對照，緩沖液做空白對照。擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。所需引物和試劑均購自上海生工公司。