人工合成靶序列快速構(gòu)建多靶標(biāo)RNAi表達(dá)載體

張秀春，吳坤鑫，趙平娟，劉志昕（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101）

人工合成靶序列快速構(gòu)建多靶標(biāo)RNAi表達(dá)載體

張秀春，吳坤鑫，趙平娟，劉志昕
（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101）

番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV）正引起番木瓜毀滅性嚴(yán)重病害，番木瓜葉扭曲花葉病毒（PLDMV）也在威脅著目前轉(zhuǎn)基因番木瓜的推廣和應(yīng)用。通過(guò)人工合成包含PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro基因多個(gè)保守區(qū)域的靶序列作為模板，擴(kuò)增兩條長(zhǎng)短不同但大部分重疊的靶序列，并通過(guò)引物設(shè)計(jì)時(shí)添加的特定酶切位點(diǎn)兩個(gè)靶序列反向連接，形成以長(zhǎng)靶序列的5’一部分序列作為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)，不需要另外插入內(nèi)含子序列的反向重復(fù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi表達(dá)載體pPTN-LS。該方法構(gòu)建的RNAi表達(dá)載體，不僅具有快速、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，還能同時(shí)靶標(biāo)PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro基因多個(gè)保守區(qū)域的靶序列，能有效提高沉默效率，為利用RNAi技術(shù)培育廣譜、高效、穩(wěn)定且安全性高，同時(shí)抗PRSV和PLDMV病毒病的轉(zhuǎn)基因番木瓜新種質(zhì)的奠定基礎(chǔ)。

人工合成靶序列；番木瓜環(huán)斑病毒；番木瓜葉扭曲花葉病毒；RNAi表達(dá)載體

張秀春，吳坤鑫，趙平娟，等. 人工合成靶序列快速構(gòu)建多靶標(biāo)RNAi表達(dá)載體［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（7）：81-86.

番木瓜（Carica papaya L.）主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是人們喜愛(ài)的果蔬兼藥用的熱帶水果，在我國(guó)南方有“萬(wàn)壽果”和“嶺南佳果”的美譽(yù)。番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ring spot virus，PRSV）嚴(yán)重影響著番木瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展［1］。隨著基因工程抗病分子育種的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究人員先后將PRSV外殼 蛋白、復(fù)制酶等基因?qū)敕竟汐@得不同的抗PRSV的轉(zhuǎn)基因株系［2-4］。由于轉(zhuǎn)基因番木瓜對(duì)病毒的抗性有株系專(zhuān)化性，但研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于各地區(qū)PRSV病毒株存在差異，導(dǎo)致一個(gè)地區(qū)的轉(zhuǎn)基因植物在另一個(gè)地區(qū)種植表現(xiàn)出的抗病能力減弱，甚至抗性喪失，因而限制了抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜的推廣和應(yīng)用。此外，番木瓜畸形花葉病毒?。≒apaya leaf-distortion mosaic virus，PLDMV）是另一種嚴(yán)重危害番木瓜的病原，最早出現(xiàn)在日本，給當(dāng)?shù)氐姆竟戏N植業(yè)造成很大的損失［5］，20世紀(jì)90年代在巴西、臺(tái)灣等地也有發(fā)現(xiàn)［6-7］?？筆RSV轉(zhuǎn)基因番木瓜品種不具備對(duì)PLDMV的抗性，雖然2001年對(duì)我國(guó)華南地區(qū)番木瓜PLDMV發(fā)病情況的調(diào)查表明尚未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)病例，但2013年楊勇等［8］、張雨良等［9］相繼報(bào)道在海南發(fā)現(xiàn)該病毒，對(duì)番木瓜生產(chǎn)構(gòu)成潛在威脅。因此，培育穩(wěn)定、高抗、譜抗且安全性好的新品種對(duì)我國(guó)番木瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

RNA沉默是利用siRNA指導(dǎo)同源RNA降解或抑制其翻譯或修飾同源DNA抑制其轉(zhuǎn)錄。由于不需要產(chǎn)生新的蛋白，因此應(yīng)用RNA沉默技術(shù)在育種中具有高效、特異和安全等特點(diǎn)。另外，由于反向重復(fù)序列片段小，有利于構(gòu)建含多個(gè)病毒基因的嵌合基因，獲得同時(shí)抗多種病毒的轉(zhuǎn)基因植株。RNA沉默技術(shù)的應(yīng)用，為我們提供了一條更為有效、安全的抗病毒新策略。目前利用RNA沉默技術(shù)已成功獲得高抗、穩(wěn)定且安全性高的抗病毒轉(zhuǎn)基因大豆、馬鈴薯、番木瓜等作物［10-11］。本研究通過(guò)比對(duì)GenBank中危害番木瓜的兩種主要病毒PRSV和PLDMV的多條基因組全長(zhǎng)序列，人工合成包含PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro基因多個(gè)保守區(qū)域的靶序列。以人工合成靶序列為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)短不同但大部分重疊的兩對(duì)引物，最后通過(guò)引物設(shè)計(jì)時(shí)添加的特定酶切位點(diǎn)使長(zhǎng)短不同的兩個(gè)靶序列反向連接，形成以長(zhǎng)靶序列的5’一部分序列作為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)，不需要另外插入內(nèi)含子序列的反向重復(fù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi表達(dá)載體。該方法構(gòu)建RNAi表達(dá)載體，不僅具有快速、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，而且較短的序列就能包含更多的保守序列，具有反向重復(fù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNAi載體產(chǎn)生dsRNA的效率更高，并且非反向重復(fù)部分的序列也是病毒來(lái)源的保守序列，在轉(zhuǎn)基因植物中也能產(chǎn)生dsRNA，因此能有效地提高RNAi載體的抗病毒效率。本研究構(gòu)建的RNAi表達(dá)載體同時(shí)靶標(biāo)PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro基因多個(gè)保守區(qū)域的靶序列，能有效提高沉默效率，為利用RNAi技術(shù)培育廣譜、高效、穩(wěn)定且安全性高、同時(shí)抗PRSV 和PLDMV病毒病的轉(zhuǎn)基因番木瓜新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

菌株與質(zhì)粒：大腸桿菌 Escherichia coli DH5α 菌株、克隆載體pRTL-SalI和植物表達(dá)載體pPTN200 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

酶與試劑：各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Ferments公司，PCR Mix購(gòu)自TaKaRa公司，克隆載體pMD18、pMD19及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1合成序列設(shè)計(jì) 搜索 GenBank中PRSV和PLDMV兩種病毒的基因組序列，用DNAMAN軟件分別進(jìn)行序列比對(duì)后選取PRSV 和PLDMV的Nib和Hc-Pro基因的多個(gè)保守區(qū)域，總長(zhǎng)為621 bp（圖 1）。靶序列由TaKaRa 公司合成。

1.2.2靶序列克隆 根據(jù)上述人工合成的靶序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物（表1），分別擴(kuò)增長(zhǎng)短不同但大部分序列重疊的兩個(gè)靶序列，在合成靶序列中的位置如圖1所示，引物由TaKaRa 公司合成。

圖1 人工合成靶序列

表1 引物序列及擴(kuò)增片段

以上述合成靶序列為模板，用LF/LR和SF/SR為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小分別為598 bp和530 bp的靶序列L和S。PCR擴(kuò)增體系：5 ng/μL合成靶序列1 μL，10 X Pfu Buffer，dNTP Mix 4 μL（2.5 μmol/L），上游和下游引物各1 μL，Pfu 0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至總體積50 μL。擴(kuò)增條件：98℃，30 s；98℃，8 s，65℃，10 s，72℃，30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。PCR產(chǎn)物L(fēng)和R分別與克隆載體pMD19和 pMD18連接，具體操作方法參照QIAGEN公司連接試劑盒說(shuō)明書(shū)。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ecoil DH5α，提取質(zhì)粒，獲得pMD19-L和pMD18-S重組子。用LF/SR為引物進(jìn)行菌PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系30 μL，PCR擴(kuò)增條件：94℃，3 min；94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。PCR檢測(cè)陽(yáng)性的pMD19-L重組子進(jìn)一步用EcoRⅠ/KpnⅠ雙酶切和測(cè)序鑒定。PCR檢測(cè)陽(yáng)性的pMD18-S重組子用EcoR Ⅰ/NcoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，由于pMD18-T載體5’端有EcoRⅠ位點(diǎn)而靶序列S正向引物已添加NcoⅠ位點(diǎn)，如果靶序列S是反向插入，則pMD18-S重組子中EcoRⅠ和NcoⅠ分別位于靶序列兩側(cè)，EcoRⅠ/NcoⅠ雙酶切能切下約500 bp的目的片段；而如果靶序列S是正向插入，則pMD18-S重組子中EcoRⅠ和NcoⅠ位于靶序列同一側(cè)，EcoRⅠ/NcoⅠ雙酶切只能將載體線性化。選取靶序列S為反向插入的pMD18-S重組子進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3RNAi克隆載體pMD18-LS構(gòu)建 選擇靶序列S為反向插入的克隆pMD18-S，并利用pMD18載體上5’端自帶的EcoRⅠ和KpnⅠ將pMD18-S質(zhì)粒DNA線性化。將EcoRⅠ/KpnⅠ酶切pMD19-L質(zhì)粒DNA，回收靶序列L并與線性化的pMD18-S連接，使靶序列L定向插入pMD18-S構(gòu)建成靶序列L和S反向連接的RNAi克隆載體pMD18-LS，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒用EcoRⅠ/NcoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.4RNAi中間表達(dá)載體構(gòu)建 pMD18-LS質(zhì)粒DNA經(jīng)EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切，切出約1 100 bp靶序列LS，回收目的片段并與EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切線性化后的中間表達(dá)載體pRTL-SalⅠ連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建RNAi中間表達(dá)載體pRTL-LS。重組質(zhì)粒用PstⅠ單酶切鑒定。

1.2.5 RNAi表達(dá)載體構(gòu)建 PstⅠ單酶切pRTLLS質(zhì)粒DNA，切出約1 600 bp的片段，回收目的片段，將其插入同樣經(jīng)PstⅠ單酶切的表達(dá)載體pPTN200，構(gòu)建RNAi表達(dá)載體pPTN-LS。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用LF和SR為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)后再用PstⅠ單酶切鑒定。

2　結(jié)果與分析

2.1靶序列設(shè)計(jì)、合成

搜索GenBank中PRSV和PLDMV兩種病毒的基因組序列，用DNAMAN軟件分別進(jìn)行序列比后選定兩種病毒的Nib和Hc-Pro基因多個(gè)共同保守區(qū)域，具體序列見(jiàn)表2。然后按PRSVNib1、PRSV-Nib2、PLDMV-Nib1、PLDMVNib2、PRSV-Hc-Pro、PLDMV-Hc-Pro順序排列，人工合成總長(zhǎng)為621 bp的靶序列。

表2 合成靶序列的詳細(xì)信息

2.2靶序列克隆

圖2 靶序列L和S PCR 擴(kuò)增

以人工合成靶序列為模板，分別以LF、LR 和SF、SR為引物，用高保真Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與靶序列L和S預(yù)期大小的目的條帶，分別為598、530 bp（圖2）；靶序列L和S分別與克隆載體pMD19和pMD18連接后，用LF和SR為引物進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，均獲得預(yù)期大小約為500 bp的目的片段（圖3），說(shuō)明靶序列L和S克隆成功。由于靶序列L的擴(kuò)增引物中分別含有EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)，重組質(zhì)粒pMD19-L進(jìn)一步用EcoRⅠ/KpnⅠ酶切，切下一條大約600 bp預(yù)期大小的目的條帶（圖4），證明pMD19-L克隆成功，測(cè)序后通過(guò)DNAMAN比對(duì)證明目的片段為合成靶序列的部分序列。由圖4可知，3、4號(hào)pMD18-S重組子切下一條大約500 bp預(yù)期大小的目的片段，說(shuō)明靶序列S為反向插入；而5、6號(hào)pMD18-S重組子只是線性化，說(shuō)明靶序列S為正向插入。取靶序列S為反向插入的pMD18-S重組子進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)DNAMAN比對(duì)證明目的片段為合成靶序列的部分序列，并且插入方向?yàn)榉聪颉?/p>

圖3 靶序列克隆

圖4 酶切鑒定

2.3RNAi克隆載體pMD18-LS酶切鑒定

由于靶序列L和S是反向連接的，并且引物設(shè)計(jì)時(shí)靶序列L的上游引物已添加EcoRⅠ位點(diǎn)，而在靶序列S上游引物添加NcoⅠ位點(diǎn)，因此，用EcoRⅠ /NcoⅠ酶切pMD18-LS重組子，應(yīng)切下包含靶序列S和L、大小約1 100 bp的片段。結(jié)果（圖5）顯示RNAi克隆載體pMD18-LS構(gòu)建成功。

圖5 發(fā)夾結(jié)構(gòu)克隆載體pMD18-LS酶切鑒定

2.4RNAi中間表達(dá)載體pRTL-LS的鑒定

用EcoRⅠ/SalⅠ酶切中間表達(dá)載體pRTLLS，切出一條預(yù)期大于2 000 bp包含插入片段、啟動(dòng)子和終止子的目的條帶，而對(duì)照pRTL-SalⅠ切下小于2 000 bp僅包含啟動(dòng)子和終止子的目的條帶（圖 6），說(shuō)明中間表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖6 發(fā)夾結(jié)構(gòu)中間載體pRTL-LS酶切鑒定

2.5RNAi表達(dá)載體pPTN-LS的鑒定

以SF為上游引物、SR為下游引物，以pPTN-LS表達(dá)載體質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約500 bp的目的條帶（圖7）。進(jìn)一步用PstⅠ進(jìn)行酶切鑒定，切出一條大于5 000 bp的目的條帶（圖8），證明已成功構(gòu)建pPTN-LS RNAi載體。

3　討論

圖7 RNAi載體pPTN-LS構(gòu)建

圖8 pPTN-LS酶切鑒定

RNAi是指雙鏈RNA（dsRNA）或帶部分雙鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hpRNA）被切割加工成小的干擾RNA（siRNA），siRNA利用堿基互補(bǔ)的原則指導(dǎo)RNA沉默誘導(dǎo)復(fù)合物（RISC）的Argnaute蛋白降解同源RNA或抑制它們的翻譯或者修飾同源DNA，從而抑制其表達(dá)。在植物中，除了能調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育，RNA沉默在植物抵抗病毒的入侵同樣起著非常重要的作用［1，12］。由于不需要產(chǎn)生新的蛋白，運(yùn)用RNAi進(jìn)行抗病毒育種具有高效、特異和安全等特點(diǎn)，因此已成為最有效的抗病毒策略之一。

為獲得抵抗多種病毒病的植株，可將多個(gè)目的基因轉(zhuǎn)入植物中并得以表達(dá)。構(gòu)建RNAi表達(dá)載體有兩種方法和途徑：一是將1個(gè)目的基因插入到1個(gè)表達(dá)載體，構(gòu)建多個(gè)不同的表達(dá)載體；二是將多個(gè)目的基金融合構(gòu)建1個(gè)多基因表達(dá)載體，包括將多種病毒的保守片段連接成長(zhǎng)片段，以相反方向插入到內(nèi)含子序列（形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)）兩端，形成具有長(zhǎng)的反向重復(fù)序列的RNAi載體［13］或每種病毒的保守序列各自形成小的發(fā)夾結(jié)構(gòu)后再連接一起［11］。本研究采用第二種方法并加以改進(jìn)，與已報(bào)道的抗多種病毒RNAi載體的構(gòu)建方法不同之處在于：（1）本研究通過(guò)對(duì)GenBank 中的危害番木瓜的兩種主要病毒番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV）和番木瓜畸形花葉病毒（PLDMV）的多條基因組全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì)，直接人工合成包含PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro基因多個(gè)保守區(qū)域的靶序列；（2）以人工合成靶序列為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)短不同但大部分重疊的兩對(duì)引物，最后通過(guò)引物設(shè)計(jì)時(shí)添加的特定酶切位點(diǎn)使長(zhǎng)短不同的兩個(gè)靶序列反向連接，形成以長(zhǎng)靶序列的5’一部分序列作為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)，不需要另外插入內(nèi)含子序列的反向重復(fù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi表達(dá)載體。本研究采用的RNAi表達(dá)載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）避免載體構(gòu)建過(guò)程中由于長(zhǎng)的反向重復(fù)序列可能發(fā)生重組，導(dǎo)致載體內(nèi)含子序列的截?cái)嗷蛉笔?，增加載體構(gòu)建的難度和降低載體的穩(wěn)定性；（2）避免反復(fù)酶切、連接，簡(jiǎn)化操作過(guò)程；（3）較短的序列就能包含更多的保守序列，提高抗病毒效率；（4）具有反向重復(fù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNAi載體產(chǎn)生dsRNA的效率更高，并且非反向重復(fù)部分的序列也是病毒來(lái)源的保守序列，在轉(zhuǎn)基因植物中也能產(chǎn)生dsRNA，因此能有效的提高RNAi載體的抗病毒效率。

Nib對(duì)病毒復(fù)制起關(guān)鍵作用，并在各病毒株系中比較保守。Hc-Pro不僅具有蛋白酶活性，作為蚜傳輔助因子參與病毒蚜傳過(guò)程，調(diào)節(jié)病毒中宿主體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，并且是馬鈴薯Y病毒屬病毒的沉默抑制子，在病毒復(fù)制、宿主癥狀表達(dá)及增強(qiáng)異源病毒復(fù)制等方面發(fā)揮作用。本研究構(gòu)建的RNAi表達(dá)載體同時(shí)靶標(biāo)PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro基因多個(gè)保守區(qū)域的靶序列，能有效提高沉默效率，為利用RNAi技術(shù)培育廣譜、高效、穩(wěn)定且安全性高，同時(shí)抗PRSV和PLDMV病毒病的轉(zhuǎn)基因番木瓜新種質(zhì)的奠定基礎(chǔ)。

［1］ Tripathi S，Suzuki J Y，F(xiàn)erreira S A，et al. Papaya ringspot virus-P：characteristics，pathogenicity，sequence variability and control［J］. Molecular Plant Pathology，2008，9（3）： 269-280.

［2］ 陳谷，葉長(zhǎng)明，黃俊潮，等. 番木瓜環(huán)斑病毒復(fù)制酶基因轉(zhuǎn)化番木瓜的研究［J］. 遺傳，1998，20（S）：9-11.

［3］ 魏軍亞，劉德兵，陳業(yè)淵，等. 花粉管通道法介導(dǎo)PRSV-CP基因dsRNA轉(zhuǎn)化番木瓜［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2008，28（11）：2159-2163.

［4］ Maureen M M F，Richard M M，Dennis G，et al. Stable transformation of papaya via microprojectile bombardment［J］.Plant Cell Reports，1990，9（4）：189-194.

［5］ Kawano S，Yonaha T. The Occurrence of papaya leaf-distortion mosaic virus in Okinawa［J］. Tech Bull of FFTC，1992，132：12-23.

［6］ Bau H J，Kung Y J，Raja J A，et al. Potential threat of a new pathotype of Papaya leaf distortion mosaic virus infecting transgenic papaya resistant to Papaya ringspot virus［J］. Phytopathology，2008，98（7）：848-856.

［7］ Kiritani K，Su H J. Papaya ringspot，banana bunchy top，and citrus greening in the Asia and pacific region： Occurrence and control strategy ［J］. Jpn. Agric. Res. Q，1999，33：23-30.

［8］ 楊勇，庹德財(cái)，沈文濤，等. 海南地區(qū)番木瓜畸形花葉病毒的發(fā)現(xiàn)與鑒定［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，34（12）：2442-2445.

［9］ 張雨良，黃啟星，郭安平，等. 海南番木瓜PRSV 和PLDMV病毒發(fā)生情況及分子鑒定［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，34（12）：2436-2441.

［10］ Carol A，Robert F. Crop improvement using small RNAs：applications and predictive ecological risk assessments［J］. Trends in Biotechnology，2009，27（11）：644-651.

［11］ Zhang X C，Sato Shirley，Ye X H，et al. Robust RNAi-based resistance to mixed infection of three viruses in soybean plants expressing separate short hairpins from a single transgene［J］. Phytopathology，2011，101（11）：1264-1269.

［12］ Ding S W，Lu R. Virus-derived siRNAs and piRNAs in immunity and pathogenesis［J］. Curr Opin Virol，2011，1（6）：533-544.

［13］ Kung Y J，Yu T A，Huang C H，et al. Generation of hermaphrodite transgenic papaya lines with virus resistance via transformation of somatic embryos derived from adventitious roots of in vitro shoots［J］. Transgenic Research，2010，19（4）：621-635.

（責(zé)任編輯 鄒移光）

Rapid construction of multiple target RNAi expression vector from synthesized fragment

ZHANG Xiu-chun，WU Kun-xin，ZHAO Ping-juan，LIU Zhi-xin
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Haikou 571101，China）

Papaya production is seriously limited by Papaya ringspot virus （PRSV） worldwide and Papaya leaf-distortion mosaic virus （PLDMV） in Eastern Asia. To develop transgenic papaya lines with robust resistance to both of PRSV and PLDMV viruses， we took advantage of a sythesized fragment which included several conserved segments of Nib and Hc-Pro gene of PRSV and PLDMV to constructe pPTN-LS RNAi expression vector. The pPTNLS RNAi expression vector was constructed by two fragments with different length and inverted repeat （IR） deriving from the sythesized fragment. The IR part served as stem while the extending part of the longer fragment served as loop of the hairpin structure of pPTN-LS respectively. Since it didn’t need to insert additional intron，the method of RNAi expression vector construction mentioned above was fast and the result was stable as well. The transgenic Papaya engineering with pPTN-LS should be robust resistant to PRSV and PLDMV at the same time，because the sythesized fragment was derived from the highly conserved regions of Nib and Hc-Pro gene of PRSV and PLDMV. The study may pave the way to develop transgenic papaya lines with robust resistance to both of PRSV and PLDMV viruses.

sythesized fragment；papaya ringspot virus；papaya leaf-distortion mosaic virus；RNAi expression vector

S667.9

A

1004-874X（2016）07-0081-06

2016-03-23

國(guó)家自然科學(xué)基金（31201264）

張秀春（1972-），女，博士，副研究員，E-mail：zhangxiuchun@itbb.org.cn

劉志昕（1963-），男，博士，研究員，E-mail：liuzhixin@itbb.org.cn