分子標(biāo)記輔助選擇抗南方玉米銹病材料

譚 華，鄒成林，鄭德波，韋新興，黃愛(ài)花，蔣維萍，韋 慧，黃開(kāi)健（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，廣西 南寧 530007）

分子標(biāo)記輔助選擇抗南方玉米銹病材料

譚 華，鄒成林，鄭德波，韋新興，黃愛(ài)花，蔣維萍，韋 慧，黃開(kāi)健
（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，廣西 南寧 530007）

以來(lái)自國(guó)際玉米小麥改良中心（CIMMYT）的高抗南方玉米銹病種質(zhì)為抗銹源，把抗病基因?qū)雭?lái)自溫帶欠抗銹種質(zhì)，借助分子標(biāo)記輔助選擇，聚合抗銹基因定向改良，對(duì)獲得的BC2F2進(jìn)行田間抗病性接種鑒定。結(jié)果顯示，利用phi048選擇與抗病親本相同帶型的BC2F2家系368個(gè)單株接種鑒定，抗及高抗級(jí)別植株共235株，占總株數(shù)的63.9%；中抗級(jí)別植株114株，占31.0%；感病植株19株，占5.1%。表明利用phi048對(duì)南方玉米銹病抗病材料進(jìn)行早代選擇是有效的，可淘汰大量感病家系，減輕田間工作量；利用分子標(biāo)記輔助定向選擇結(jié)合抗病接種鑒定，能有效改良溫帶種質(zhì)的抗銹性。

南方玉米銹??；分子標(biāo)記輔助選擇；抗銹改良

譚華，鄒成林，鄭德波，等 . 分子標(biāo)記輔助選擇抗南方玉米銹病材料［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（7）：6-10.

南方玉米銹病是由多堆柄銹菌引起的玉米產(chǎn)區(qū)流行性重要病害，對(duì)玉米生產(chǎn)危害日益嚴(yán)重［1-3］，其蔓延發(fā)展已成為制約玉米生產(chǎn)一大病害。發(fā)掘和利用南方銹病抗病基因資源、篩選和培育抗病品種是控制南方玉米銹病的有效途徑［4-6］，前人研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)比溫帶種質(zhì)具有更豐富遺傳多樣性，是尋找玉米抗銹基因的重要種質(zhì)資源［7］，國(guó)際玉米小麥改良中心（CIMMITY）種質(zhì)中蘊(yùn)涵著豐富的抗銹基因，將其導(dǎo)入溫帶種質(zhì)和選擇抗銹基因，可有效提高溫帶種質(zhì)的抗銹性，在抗病育種中拓寬豐富玉米育種種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)［8-9］。李少博等［3］以齊319為抗源改良京24南方玉米銹病的抗性，通過(guò)分子標(biāo)記輔助前景選擇和背景選擇，實(shí)現(xiàn)京24在抗銹性狀上的定向改良；蔣雅娟等［10］將P25攜帶的抗病基因通過(guò)回交途徑轉(zhuǎn)移到感病自交系F349上，連續(xù)回交所得BC5代的F349抗病近等基因系，田間抗感結(jié)果與分子檢測(cè)結(jié)果一致，選擇效率達(dá)97.9%。本研究擬通過(guò)利用回交轉(zhuǎn)導(dǎo)，以溫帶欠抗銹種質(zhì)為受體導(dǎo)入抗銹基因，借助分子標(biāo)記輔助前景選擇，結(jié)合田間接種鑒定，對(duì)溫帶種質(zhì)聚合抗銹性定向改良，探討導(dǎo)入抗銹基因改良溫帶種質(zhì)的抗銹性，為抗病育種提供新的抗銹基因源途徑。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料以來(lái)自CIMMYT的CML161、CML166、CML170、CML190為供體，以溫帶感南方玉米銹病種質(zhì)Q205、黃C、CAI60、L2548、丹340、掖478等玉米自交系為受體，借助農(nóng)藝性狀選擇與分子標(biāo)記相結(jié)合進(jìn)行回交世代選擇，經(jīng)1次雜交2次回交1次自交獲得的BC2F2分離群體，以雙M9為高抗對(duì)照，以黃早四為高感對(duì)照。

1.2試驗(yàn)方法

SSR分子標(biāo)記：玉米苗期5-6葉取幼嫩葉片采用CTAB法提取DNA；SSR標(biāo)記phi048序列來(lái)自 Maize GDB（2002），由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。重復(fù)序列為（GCC）n：

phi048-F：5' -GCAAACCTTGCATGAACCC GATTGT-3'

phi048-R：5' - CAAGCGTCCAGCTCGAT GATTTC -3'

反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積10 μL，包括ddH2O 6.6 μL，10×Buffer（含Mg2+）1.0 μL，dNTP （2.5mM）0.15 μL，Taq酶 0.1 μL，Primer（0.2 μmol/L）0.15 μL，DNA 2 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，60℃復(fù)性45 s，72℃延伸 1 min，32個(gè)循環(huán)；再72℃延伸10 min；聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染。

1.3田間銹病接種鑒定

試驗(yàn)在國(guó)家玉米改良中心南寧分中心明陽(yáng)試驗(yàn)基地（22°12′N(xiāo)，107°19′E，海拔105 m）進(jìn)行，單行區(qū)行長(zhǎng)5.0 m，行距 0.7 m，每行留苗25株。采集提前種植的感染南方玉米銹病植株葉片，于水中揉搓紗布過(guò)濾得孢子懸浮液，于8～9葉期對(duì)CML161、CML166、CML170、CML190、Q205、黃C、CAI60、L2548、丹340、掖478等供試玉米材料采用噴霧接種，于傍晚噴霧植株葉片7～8 mL/株，噴后保持濕潤(rùn)環(huán)境，玉米乳熟至蠟熟期調(diào)查鑒定，重點(diǎn)調(diào)查玉米植株穗上葉和穗位下方3片葉，田間銹病調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［4］：1級(jí)為高抗（HR），葉片上無(wú)或極少孢子堆；3級(jí)為抗?。≧），葉片上有少量孢子堆，占葉面積少于25%；5級(jí)為中抗（MR），葉片上孢子堆占葉面積26%～50%；7級(jí)為感?。⊿），葉片上有大量孢子堆，占葉面積51%～75%；9級(jí)為高感（HS），葉片上有大量孢子堆，大于葉面積75%。

2　結(jié)果與分析

2.1供試材料抗病性接種鑒定

各材料對(duì)南方玉米銹病的抗性調(diào)查結(jié)果（表1）顯示，高感對(duì)照黃早四全株葉片上有大量銹病孢子堆，發(fā)病程度達(dá)9級(jí)；高抗對(duì)照雙M9葉片上極少孢子堆，發(fā)病程度為1級(jí)，表明接種試驗(yàn)達(dá)到預(yù)期要求。CML161、CML166、CML170、CML190發(fā)病程度為1級(jí)，達(dá)高抗水平；Q205、黃C、CAI60、L2548、丹340、掖478葉片上有大量孢子堆甚至整株枯死，達(dá)7～9級(jí)感或高感水平。

接種鑒定試驗(yàn)結(jié)果表明，高抗對(duì)照雙M9和高感對(duì)照黃早四達(dá)到預(yù)期的抗性表達(dá)，選用來(lái)自CIMMYT作為抗銹供體的CML161等4份材料具有抗銹能力強(qiáng)，達(dá)到高抗水平；來(lái)自溫帶材料Q205等6份作為受體材料在南方高溫多雨生態(tài)條件感銹嚴(yán)重，葉片上有大量孢子堆甚至整株枯死，達(dá)感病或高感級(jí)別。

表1 供試玉米自交系對(duì)南方銹病的接種鑒定結(jié)果

2.2前景選擇引物在抗感親本間的篩選

參考前人對(duì)南方玉米銹病抗病基因的研究結(jié)果［11-12］，通過(guò)對(duì)前景選擇phio41、phi118、phi097、bnlg176、phi402、umcl402、phi090、phi053、umcl528、phi074、phi019、phi048、phi077、phi123、phi114、phi015、phi044、phi016、phi059、phi050、phi062、phi092、phi076 等23 對(duì)候選引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增SSR選擇，篩選獲得在高抗對(duì)照和高感對(duì)照以及試驗(yàn)所用抗、感材料具有較好多態(tài)性的phi048進(jìn)行選擇，抗、感材料間能擴(kuò)增出差異性條帶。電泳結(jié)果（圖1）顯示，4個(gè)供體1、2、3、4帶型與高抗對(duì)照雙M9（CK1，呈上帶）帶型一致，6個(gè)受體材料帶型與高感對(duì)照黃早四（CK2，呈下帶）帶型一致，表明可選取phi048引物用于回交群體進(jìn)行基因型單株標(biāo)記區(qū)分選擇。

圖1 引物 phi048 檢測(cè)4 個(gè)供體和6個(gè)受體玉米自交系多態(tài)性

2.3分子標(biāo)記前景選擇與田間鑒定結(jié)果比較

種植利用分子標(biāo)記與高抗對(duì)照雙M9帶型一致的BC2F2代分離群體進(jìn)行南方型銹病抗性接種鑒定，共鑒定368株。不同群體抗性接種鑒定結(jié)果（表2）表明，達(dá)到高抗及抗水平235株，占鑒定總株數(shù)的67.4%～60.9%；中抗（5級(jí)）植株114株，占總株數(shù)的37.0%～21.7%；感病植株19株、占5.1%。

表2 BC2F2代分離群體接種鑒定結(jié)果

南方型銹病抗性鑒定結(jié)果表明與高抗對(duì)照雙M9帶型一致的BC2F2代分離群體中，達(dá)到高抗及抗水平的植株占63.9%，中抗級(jí)別占31.0%，二者接近植株總數(shù)的95%，感病植株19株、占5.1%，表明所用引物進(jìn)行分子標(biāo)記輔助目標(biāo)性狀選擇，有較高選擇準(zhǔn)確性，可淘汰與高感對(duì)照帶型一致的材料，減輕田間工作量。

3　結(jié)論與討論

我國(guó)玉米品種和自交系大多易感染南方玉米銹病，己定位的抗銹病基因?yàn)閱物@性基因，相對(duì)單一的抗性遺傳背景不利于抗性的持久利用，應(yīng)尋找不同遺傳背景的抗銹源，以抗病育種手段控制南方銹?。?-9，13］；防治南方銹病安全、經(jīng)濟(jì)、有效的方法是培育抗病品種，而創(chuàng)制抗病種質(zhì)是開(kāi)展抗病育種的重要基礎(chǔ)［14］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同自交系對(duì)南方型銹病抗、感差異顯著，其中來(lái)自CIMMYT的種質(zhì)具有抗銹能力強(qiáng)，可作為抗銹供體改良溫帶種質(zhì)；來(lái)自溫帶背景的種質(zhì)在南方低緯高溫多雨條件易感南方玉米銹病，不同自交系的抗感程度不同，表現(xiàn)的感病癥狀也不同，來(lái)自溫帶的玉米在南方高溫多雨生態(tài)條件大多感銹嚴(yán)重，葉片上有大量孢子堆甚至整株枯死。

本研究以4份高抗南方玉米銹病為供體，6份感銹自交系為受體通過(guò)雜交、回交聚合抗銹基因，對(duì)利用分子標(biāo)記選擇的BC2F2代分離群體進(jìn)行南方型銹病抗性鑒定，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)與高抗對(duì)照雙M9帶型一致的368株BC2F2代分離群體達(dá)到高抗及抗水平植株235株、占63.9%，中抗級(jí)別114株、占31.0%，二者接近植株總數(shù)的95%，感病植株19株、占5.1%，可以認(rèn)為所用引物進(jìn)行分子標(biāo)記輔助目標(biāo)性狀選擇，可提高選擇的準(zhǔn)確性。

分子標(biāo)記輔助選擇目標(biāo)性狀在其他作物上的應(yīng)用已有諸多報(bào)道，潘曉飚等［15］利用分子標(biāo)記輔助選擇和田間鑒定選擇相結(jié)合通過(guò)基因聚合，獲得帶有抗稻瘟病兼抗白葉枯病的雙基因或多基因聚合材料；曾祥艷等［16］通過(guò)復(fù)合雜交、回交，利用抗病性鑒定和分子標(biāo)記輔助選擇，選育出聚合了多個(gè)抗病基因的兼抗白粉、條銹和黃矮病的小麥新種質(zhì)；李文鳳等［17］以5個(gè)己知含抗褐銹病基因Brul和5個(gè)高感褐銹病的甘蔗品種為試材，成功構(gòu)建了甘蔗抗褐銹病基因Brul的分子快速檢測(cè)體系；此外，在甜瓜、辣椒上利用分子標(biāo)記輔助聚合抗性基因，對(duì)甜瓜抗蔓枯病在BC3F3世代即獲得蔓枯病抗性顯著提高且果實(shí)性狀良好的改良材料及辣椒抗疫病新種質(zhì)［5，19］。

本研究通過(guò)對(duì)BC2F2代分離群體田間接種鑒定與室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，表明本試驗(yàn)篩選獲得的標(biāo)記對(duì)抗銹群體進(jìn)行輔助選擇是有效的，不同群體標(biāo)記結(jié)果有所差異。有學(xué)者認(rèn)為不同組合分離群體的標(biāo)記結(jié)果有顯著差異，在于可能與基因的遺傳背景有關(guān)［21］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，所篩選的前景引物對(duì)南方銹病的分子輔助選擇是可行的，標(biāo)記選擇和田間接種表型鑒定相結(jié)合，選擇抗南方玉米銹病材料是有效的，在抗病育種中，對(duì)南方玉米銹病抗病能力的轉(zhuǎn)移，可以通過(guò)雜交回交轉(zhuǎn)導(dǎo)借助分子標(biāo)記輔助選擇，提高選擇的準(zhǔn)確性和效率，達(dá)到預(yù)期育種目標(biāo)和拓寬玉米育種種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)。

［1］ 穆春華，魯守平，付晉，等. 玉米南方銹病的研究進(jìn)展［J］. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，28（5）：509-512 .

［2］ 吳永升，鄒成林，黃愛(ài)花，等. 玉米自交系南方銹病抗性配合力及遺傳參數(shù)分析［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，27（6）：2286-2289.

［3］ 李少博，宋偉，王鳳格，等. 分子標(biāo)記輔助玉米自交系京24抗南方銹病的改良［J］. 分子植物育種，2012，10（4）：440-445.

［4］ 李石初，杜青. 玉米種質(zhì)資源抗南方玉米銹病鑒定初報(bào)［J］. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（21）：187，189.

［5］ 陳翠霞，邢全華，梁春陽(yáng)，等. 南方玉米銹病抗病基因的定位及不同遺傳背景對(duì)基因標(biāo)記的比較分析［J］. 遺傳學(xué)報(bào)，2003，30（4）：341-344.

［6］ 姚國(guó)旗，曹冰，單娟，等. 玉米南方銹病抗性新種質(zhì)的篩選［J］. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46 （7）：112-116.

［7］ 姚國(guó)旗，單娟，曹冰，等. 玉米自交系 CML470抗南方銹病基因的定位［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2013，14（3）：518-522.

［8］ 杜青，唐照磊，李石初，等. 玉米種質(zhì)資源抗南方銹病鑒定與評(píng)價(jià)［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，44（5）：765-768.

［9］ 任轉(zhuǎn)灘. 玉米抗銹病種質(zhì)資源的篩選及應(yīng)用研究［J］. 玉米科學(xué)，2006，14（4）：155-157.

［10］ 蔣雅娟，賀巖，張登峰，等. 玉米抗南方型銹病基因共分離分子標(biāo)記的研究［J］. 作物學(xué)報(bào)，2007，33（5）：849-852.

［11］ 陳翠霞. 南方玉米銹病的抗病性鑒定、抗病基因的遺傳分析、分子標(biāo)記和精細(xì)定位［D］. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［12］ 江凱學(xué). 玉米對(duì)南方銹病的抗病性研究［D］.秦皇島：河北師范科技學(xué)院，2012.

［13］ 劉駿，馬青，于凱，等. 我國(guó)玉米南方銹病發(fā)生區(qū)域和玉米品種田間抗性的研究［J］. 作物雜志， 2009（3）：71-74.

［14］ 江凱 ，杜青，秦子惠，等. 玉米種質(zhì)資源抗南方銹病鑒定［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2013，14 （4）：711-714.

［15］ 潘曉飚，陳凱，張強(qiáng)，等. 分子標(biāo)記輔助選育水稻抗白葉枯病和稻瘟病多基因聚合恢復(fù)系［J］. 作物學(xué)報(bào)，2013，39（9）：1582-1593.

［16］ 曾祥艷，張?jiān)銎G，杜麗璞，等. 分子標(biāo)記輔助選育兼抗白粉病、條銹病、黃矮病小麥新種質(zhì)［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（12）：2380-2386.

［17］ 李文鳳，王曉燕，黃應(yīng)昆，等. 甘蔗抗褐銹病基因Brul分子檢測(cè)體系的建立與應(yīng)用［J］. 植物保護(hù)，2015，41（2）：120-124.

［18］ 畢研飛，徐兵劃，郭靜，等. 分子標(biāo)記輔助甜瓜抗蔓枯病基因聚合及‘白皮脆’品種改良［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，38（3）：375-380.

［19］ 馬壽賓，孫艷，王探，等. 分子標(biāo)記輔助選擇辣椒抗疫病新種質(zhì)研究［J］. 北方園藝，2013 （10）：107-110.

（責(zé)任編輯 鄒移光）

Selection of materials with resistance to southern corn rust（SCR） by marker-assistant selection（MAS） in maize （Zea mays L.）

TAN Hua，ZOU Cheng-lin，ZHENG De-bo，WEI Xin-xing，HUANG Ai-hua，
JIANG Wei-ping，WEI Hui，HUANG Kai-jian
（Maize Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，China）

In order to improve the maize resistance to southern corn rust of temperate germplasm，the resistant genes，which came from germplasm of high SCR-resistant in CIMMYT，were introduced in temperate germplasm. The SCR-resistance of temperate germplasm was directionaly improved by pyramiding SCR-resistant genes. 368 plants of a BC2F2 family，which had the same polymorphism with the SCR-resistant parent by detecting with SSR marker phi048，were used to identify their SCR-resistance by artificial inoculation in field. The results showed that 235 plants were highly resistant or resistant，accounting for 63.9%，114 plants were moderately resistant，accounting for 31.0%，19 plants were susceptible，accounting for 5.1%. The results demonstrated that SSR marker phi048 was effective to select SCR-resistant materials in early stage，which could knock out lots of SCR-susceptible lines therefore reduce plenty of field work. The SCR-resistance of temperate germplasm was effectively improved by directional selection with marker assistant combined to identification with artificial inoculation.

southern corn rust （SCR）；marker-assistant selection （MAS）；SCR-resistant improvement

S513.034

A

1004-874X（2016）07-0006-05

2015-09-17

廣西重大科技計(jì)劃專(zhuān)項(xiàng)（桂科重14121001-1-9）；廣西自然科學(xué)基金（2013GXNSFAA019101）

譚華（1959-），男，研究員，E-mail：TH19881206@163.com