多重PCR檢測在兒童肺炎細(xì)菌性病原中的臨床應(yīng)用

劉妙娥　馮慧艷　趙尊

[摘要]目的 探討多重PCR檢測在兒童肺炎細(xì)菌性病原中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 選取2015年1～7月在我院就診的300例肺炎患兒，收集患兒呼吸道分泌物，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)并提取DNA，利用多重PCR擴(kuò)增14種呼吸道病原菌靶基因，統(tǒng)計(jì)分析多重PCR檢測兒童肺炎細(xì)菌性病原敏感性和特異性。結(jié)果 從300例標(biāo)本中，細(xì)菌培養(yǎng)出184株病原菌，陽性率為61.33%（184/300）。經(jīng)多重PCR擴(kuò)增檢測118例樣本呈陽性，陽性率為39.3%（118/300）。對14種病原菌多重PCR的敏感性為51.6%，特異性為68.6%，符合率為58.9%。多重PCR對SPN檢出率（15.7%，47/300）高于培養(yǎng)（5.7%，17/300）（P<0.05）；聯(lián)合檢測細(xì)菌性病原檢出率為80.67%（242/300），聯(lián)合檢測顯著提高金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌的檢出率。結(jié)論 多重PCR技術(shù)對肺炎鏈球菌檢測的敏感性較高，聯(lián)合檢測能提高兒童肺炎細(xì)菌性病原檢出率。

[關(guān)鍵詞]多重PCR；兒童肺炎；細(xì)菌性病原；臨床運(yùn)用

[中圖分類號]R725.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B [文章編號]2095-0616（2016）05-169-04

在兒童肺炎的診治中，明確病原很重要。近些年隨著抗菌素的早期、廣泛應(yīng)用，使細(xì)菌培養(yǎng)的陽性率大大降低，給細(xì)菌性肺炎的病原學(xué)診斷增加了難度。目前臨床中常用的細(xì)菌培養(yǎng)、免疫熒光、單PCR技術(shù)等檢測方法，一般往往只能檢測出一種或一類病原，無法檢測出其他病原或混合感染，因此需要尋找一個(gè)多重檢測或聯(lián)合檢測的方法來加強(qiáng)病原學(xué)診斷，指導(dǎo)臨床工作和用藥。本研究采用多重PCR技術(shù)檢測細(xì)菌性肺炎臨床標(biāo)本，比較多重PCR、細(xì)菌培養(yǎng)、單PCR對各種病原的檢出率，探討該多重PCR技術(shù)對兒童肺炎細(xì)菌性病原的診斷價(jià)值，指導(dǎo)臨床兒童肺炎診治工作，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年1～7月在我院就診的300例肺炎患兒，提取呼吸道分泌物，其中男204例，女96例，年齡1個(gè)月～9歲，平均年齡（5.6±1.2）歲，病程2～90d。均符合肺炎臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，并獲得父母知情同意并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑

全自動(dòng)微生物檢定儀（VITEK-32）購自法國Bio Merieux；懸浮點(diǎn)陣儀（Luminex 100）購自美國LUMINEX；PCR儀（ABI 5700）購自美國ABI；高速離心機(jī)（Allegra X-12R）購自美國BeckmanCoulter；肺炎支原體PCR檢測KIT購自廣州達(dá)安基因；HAII試劑盒和ResPlex Ⅰ細(xì)菌面板均購自美國GENACO；細(xì)菌基因組DNA提取KIT購自美國AXYGEN；普通血平板培養(yǎng)基購自廣州華鑫公司。

1.3方法

采集深部呼吸道分泌物后立即送至細(xì)菌室。（1）細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定將采集的標(biāo)本分別接種于普通血平板、流感嗜血桿菌巧克力培養(yǎng)基和肺炎鏈球菌培養(yǎng)基。流感嗜血桿菌接種后做革蘭染色及X、V因子鑒定。其余菌落應(yīng)用微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定。（2）提取細(xì)菌基因組、設(shè)計(jì)14種細(xì)菌特異性引物及擴(kuò)增靶基因14種病原菌及其靶基因：肺炎鏈球菌（SPN）靶基因LytA，金黃色葡萄球菌（SA）Nuc，流感嗜血桿菌（HINF）OmpP2，肺炎克雷伯桿菌（KPN）Khe，嗜肺軍團(tuán)菌（LPN）Mip，銅綠假單胞菌（PA）AlgD，大腸埃希菌（ECO）Eac，鮑曼不動(dòng)桿菌（ABM）Npol，奇異變形桿菌（PM）Topoiso，陰溝腸桿菌（ECL）AmpC，化膿鏈球菌（SPY）Mf，腦膜炎奈瑟菌（NMG）CtrA，屎腸球菌（EFCM）Ddl，肺炎支原體（MPN）MPN592，糞腸球菌（EFLS）Ddl。（3）多重PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系為35.8μL Rnase-freewater，5μL緩沖液，1μL dNTP，6μL引物，0.2μLHotstar Taq聚合酶和2μL DNA樣品。反應(yīng)條件參考說明書（95℃變性15min，94℃設(shè)定30s，52℃設(shè)定1min，72℃設(shè)定1min，以上進(jìn)行15個(gè)循環(huán)；94℃15s，70℃90s，進(jìn)行6個(gè)循環(huán)；94℃15s，52℃15s，72%15s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72%維持3min）。（4）擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：按照懸浮點(diǎn)陣儀（Luminex 100）說明書進(jìn)行操作。所獲熒光強(qiáng)度中位值高于250（或?yàn)殛幮云骄导?倍標(biāo)準(zhǔn)差）判定為陽性。（5）肺炎支原體熒光定量PCR檢測：參考試劑盒說明書進(jìn)行，同時(shí)將標(biāo)本號、陰性質(zhì)控及陽性梯度進(jìn)行標(biāo)記。循環(huán)反應(yīng)條件為：93℃設(shè)定2min，93℃設(shè)定45s。55℃設(shè)定60s，循環(huán)數(shù)為10；93℃設(shè)定30s，55℃設(shè)定45s，循環(huán)數(shù)為30，分析結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS10.0軟件包對統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析，兩組間比較采用x²檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1多重PCR與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果比較

多重PCR檢測的總體的陽性率低于細(xì)菌培養(yǎng)，與細(xì)菌培養(yǎng)比較275例多重PCR敏感性為51.6%，特異性為68.6%，符合率為58.9%。見表1。

2.2多重PCR與5種細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果比較

多重PCR對SPN檢出率（15.7%，47/300）高于培養(yǎng)（5.7%，17/300）（P<0.05）；對HINF檢出率（22.3%，54/300）與培養(yǎng)（203%，64/300）之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。5種細(xì)菌的多重PCR與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果比較見表2。

參考5種細(xì)菌培養(yǎng)，多重PCR的特異性和符合率均高于細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，對SPN、PA的敏感性高于細(xì)菌培養(yǎng)的，相關(guān)指標(biāo)見表3。

2.3聯(lián)合檢測結(jié)果分析

聯(lián)合檢測結(jié)果細(xì)菌性病原檢出率為80.67%（242/300），聯(lián)合檢測提高流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌檢出例數(shù)。見表4。

3討論

世界衛(wèi)生組織（WHO）在2005年公告，5歲以下兒童的死亡原因中，肺炎仍居于第一位，全世界每年死于肺炎的兒童大約有200萬，其主要病原為細(xì)菌性，其次為病毒、支原體、衣原體等。在病原學(xué)診斷方法中，PCR擴(kuò)增為目前應(yīng)用最多的分子診斷技術(shù)，因其在敏感度、速度、安全性、準(zhǔn)確性的優(yōu)勢，在難以常規(guī)培養(yǎng)的病原體如病毒、支原體、衣原體等的檢測方面發(fā)揮了重要作用。單PCR一次只能檢出一種病原或一類，在病原學(xué)的鑒別診斷方面存在缺陷，而多重PCR在一次檢測中可以同時(shí)查出多種病原，已廣泛應(yīng)用于病原學(xué)診斷、耐藥基因檢測等研究領(lǐng)域。是病原學(xué)鑒別診斷未來發(fā)展方向，在病毒性肺炎病原學(xué)診斷方面，國內(nèi)外均取得了比較滿意結(jié)果。近些年，隨著抗生素的早期廣泛應(yīng)用，增加了細(xì)菌培養(yǎng)檢出率的難度，而采用多種方法進(jìn)行聯(lián)合檢測可以相互補(bǔ)充，提高病原檢出率。

本研究顯示，總體看來多重PCR陽性率低于培養(yǎng)，可能因片段擴(kuò)增的條件不一，難以均勻的對每種靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，因此產(chǎn)物較少，從而導(dǎo)致敏感性的降低。而在肺炎鏈球菌的檢測方面，多重PCR對SPN檢出率明顯高于培養(yǎng)，說明多重PCR對肺炎鏈球菌敏感性優(yōu)于培養(yǎng)。聯(lián)合檢測細(xì)菌性病原檢出率為80.67%（242/300），高于單獨(dú)細(xì)菌培養(yǎng)的檢出率，且聯(lián)合檢測提高流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌檢出例數(shù)和銅綠假單胞菌的檢出率，可以體現(xiàn)聯(lián)合檢測的優(yōu)勢，這與國內(nèi)外其他專家學(xué)者報(bào)道一致。

綜上，多重PCR技術(shù)對檢測肺炎鏈球菌的敏感性較高，而對檢測其他細(xì)菌性病原的敏感性還有待提高。多重PCR技術(shù)聯(lián)合細(xì)菌培養(yǎng)能提高兒童肺炎細(xì)菌性病原檢出率。臨床工作中可以綜合考慮各種檢測方法的優(yōu)勢，靈活運(yùn)用，提高病原學(xué)診斷，促進(jìn)治療。