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    缺氧誘導(dǎo)因子—1α和M2型丙酮酸激酶在膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)糖酵解的影響

    2016-10-08 23:05:18張楠偰光華
    中國醫(yī)藥科學(xué) 2016年5期
    關(guān)鍵詞:丙酮酸糖酵解膽管癌

    張楠 偰光華

    [摘要]目的分析缺氧誘導(dǎo)因子-1α和M2型丙酮酸激酶在膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對(duì)糖酵解的影響。方法分別以不同濃度的氯化鈷溶液誘導(dǎo)的缺氧條件下培養(yǎng)膽管癌QBC939細(xì)胞,測定并比較培養(yǎng)24h后各組細(xì)胞HIF-1α、PK-M2蛋白表達(dá)水平和乳酸分泌量。結(jié)果缺氧組的HIF-1α、PK-M2蛋白表達(dá)水平均顯著高于常氧組,膽管癌QBC939細(xì)胞24h乳酸分泌量,隨氯化鈷濃度逐漸增加,且均顯著高于常氧培養(yǎng)時(shí)分泌的乳酸量,比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析法分析,PK-M2與HIF-1α呈顯著正相關(guān)(r=0.436,P=0.002)。結(jié)論缺氧誘導(dǎo)因子-1α和M2型丙酮酸激酶在人膽管癌QBC939細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平顯著提高,且均在膽管癌細(xì)胞糖酵解水平的升高過程中發(fā)揮重要作用。

    [關(guān)鍵詞]缺氧誘導(dǎo)因子-1α;M2型丙酮酸激酶;膽管癌;糖酵解

    [中圖分類號(hào)]R735.8 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2095-0616(2016)05-34-03

    膽管癌是十分常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)源于膽管上皮細(xì)胞,在所有消化系統(tǒng)惡性腫瘤的患者中占到3%,以低分化膽管癌為主,有男性發(fā)病率高于女性,60~65歲人群中高發(fā)的特點(diǎn)[2-41。本文就氯化鈷誘導(dǎo)的缺氧條件下,人膽管癌QBc939細(xì)胞中HIF-1α、PK-M2的蛋白表達(dá)變化情況進(jìn)行分析,并探討其對(duì)糖酵解的影響情況?,F(xiàn)報(bào)道如下。

    1資料與方法

    1.1一般資料

    選擇人類膽管癌細(xì)胞株OBC939(購自上海和元生物技術(shù)有限公司)作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株,以氯化鈷為缺氧模擬劑誘導(dǎo)缺氧條件。

    1.2方法

    將購買的在液氮中凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇和傳代處理,其中,細(xì)胞的復(fù)蘇主要包括恒溫水浴融化、DMSO稀釋、離心分離、DMEM培養(yǎng)基(含1%青鏈霉素以及10%FBS的混合液)加入、細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)等步驟;細(xì)胞傳代則是在培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%~90%時(shí),用含EDTA的胰蛋白酶消化、細(xì)胞懸浮、離心分離后轉(zhuǎn)移并在含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng),按1:3~1:5的比例傳代。再次經(jīng)消化、分離、懸浮、冷凍后保存。

    選取已傳3~4代,生長狀態(tài)良好的膽管癌QBC939細(xì)胞接種培養(yǎng),并行分組處理。常氧培養(yǎng)是在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下將膽管癌QBC939細(xì)胞放入DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),將其作為對(duì)照組;觀察組則是將膽管癌QBC939細(xì)胞置于含缺氧模擬劑的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),缺氧模擬劑為氯化鈷,分設(shè)氯化鈷濃度為100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L等四,J、組,培養(yǎng)24h后收獲細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞蛋白提取與濃度測定(BCA法)對(duì)不同條件下缺氧誘導(dǎo)因子-1α和M2型丙酮酸激酶在人膽管癌QBC939細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

    同時(shí),收集常氧狀態(tài)下與缺氧24h后不同小組組內(nèi)人膽管癌QBC939細(xì)胞培養(yǎng)的上清液,采用比色法對(duì)其乳酸濃度進(jìn)行測定,所有操作均嚴(yán)格遵照乳酸濃度測定試劑盒說明書的要求進(jìn)行,重復(fù)6次,收集數(shù)據(jù)。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以(x±s)表示,采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1不同組別膽管癌HIF-1α、PK-M2的蛋白表達(dá)水平比較

    比較不同組別膽管癌QBC939細(xì)胞中,HIF-1α、PK-M2的蛋白表達(dá)水平,可見,觀察組的HIF-1α、PK-M2蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中,HIF-1α蛋白表達(dá)量在氯化鈷濃度為150μmol/L最高,而HIF-1α蛋白表達(dá)量受氯化鈷濃度影響較小。經(jīng)Pearson相關(guān)分析法分析,PK-M2與HIF-1α呈顯著正相關(guān)(r=0.436,P=0.002)。見表1。

    2.2不同組別膽管癌QBC939N胞24h乳酸分泌量比較

    比較不同缺氧環(huán)境下,膽管癌QBC939細(xì)胞24h乳酸分泌量,可見隨氯化鈷濃度增加,乳酸.分泌量逐漸增加,且均顯著高于常氧培養(yǎng)時(shí)分泌的乳酸量(8.025±1.234),比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    3討論

    調(diào)查顯示,近年來,膽管癌的發(fā)病率有不斷升高的趨勢,由于其發(fā)病原因尚不十分明確,治療中多以手術(shù)切除為首選方法,但膽管癌細(xì)胞的發(fā)病相對(duì)隱匿,早期診斷困難,患者就診時(shí)多以發(fā)展至晚期,腫瘤惡性度高,且有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、局部浸潤情況的發(fā)生,有手術(shù)切除率低,復(fù)發(fā)率高,術(shù)后生存率低,預(yù)后差的情況。在手術(shù)切除的基礎(chǔ)上輔以化學(xué)藥物進(jìn)行綜合治療是比較理想的方法。如何從分子水平上對(duì)膽管癌的發(fā)生、發(fā)展情況進(jìn)行分析,并采取有效的基因靶向治療則是腫瘤化療的新方向。

    其中,HIF-1可在腫瘤的缺氧過程中發(fā)揮誘導(dǎo)作用,促進(jìn)VEGF、EPO、PK、HK、LDH等多種關(guān)鍵生長調(diào)節(jié)因子的表達(dá),參與影響腫瘤能量代謝、侵襲轉(zhuǎn)移、微血管生成、耐受放化療等過程。而PK則是糖酵解途徑中最后一步反應(yīng)的限速酶,膽管癌組織中血供極差以及供氧不足時(shí)呈PK-M2高表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn),在氯化鈷誘導(dǎo)的缺氧環(huán)境中,HIF-1α、PK-M2蛋白表達(dá)水平均顯著高于常氧組,同時(shí)乳酸分泌量顯著增加,提示其均在膽管癌細(xì)胞糖酵解水平的升高過程中發(fā)揮重要作用,這對(duì)于膽管癌相關(guān)化療藥物的開發(fā)有一定指導(dǎo)意義。呂品等研究了低氧對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖的影響及與HIF-1α表達(dá)的關(guān)系,同樣發(fā)現(xiàn)在不同的氯化鈷誘導(dǎo)濃度下,膽管癌的細(xì)胞增殖、膽管癌細(xì)胞周期都受到顯著影響,從相關(guān)分析曲線上看,在低氧條件處理72h后,會(huì)有QBC939膽管癌細(xì)胞G1期細(xì)胞下降,而s期、G2期細(xì)胞增加的情況,且有氧化鈷濃度升高,G1期細(xì)胞不斷下降的表現(xiàn),HIF-1α表達(dá)灰度值變化規(guī)律與本文結(jié)果基本一致,共同說明了膽管癌細(xì)胞糖酵解水平與HIF-1α息息相關(guān)。柴浩等對(duì)M2-型丙酮酸激酶在膽管癌組織中的表達(dá)情況研究中,確定膽管癌組織中PKM2表達(dá)明顯高于癌旁組織,提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,其也與膽管癌細(xì)胞糖酵解水平的升高息息相關(guān)。

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