白藜蘆醇改善飲食誘導肥胖斑馬魚脂代謝的研究

冉蓋，應力，李琳，鄧拓，燕喬喬，應晨江，葉曉蕾

（1.溫州醫(yī)科大學　環(huán)境與公共衛(wèi)生學院，浙江　溫州　325035；2.華中科技大學　公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，湖北　武漢　430030）

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白藜蘆醇改善飲食誘導肥胖斑馬魚脂代謝的研究

冉蓋1，應力1，李琳1，鄧拓1，燕喬喬1，應晨江2，葉曉蕾1

（1.溫州醫(yī)科大學環(huán)境與公共衛(wèi)生學院，浙江溫州325035；2.華中科技大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，湖北武漢430030）

目的：研究白藜蘆醇（RSV）對飲食誘導肥胖斑馬魚脂代謝的影響。方法：120條野生型成年雄性斑馬魚（AB系），隨機分為4組，即正常喂飼組（Con），正常喂飼+RSV組（Con+RSV），過度喂飼組（DIO），過度喂飼+RSV組（DIO+RSV）。每條魚正常喂飼蟲卵量每天為8 mg，過量喂飼量為每天60 mg，RSV干預劑量為20 μmol/L，每天11 h。實驗持續(xù)8周。實驗結束時測定魚體長、體質(zhì)量，計算肥滿度，檢測血漿甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC），觀察肝組織形態(tài)。檢測魚體pAMPKα/AMPKα、Sirt1、Cav-1和LC3蛋白表達水平。結果：DIO組斑馬魚體長、體質(zhì)量和肥滿度較對照組分別增加11.7%、61.9%和15.1%（P＜0.01），雖然喂食量和RSV對斑馬魚體長的影響存在交互效應（P＜0.05），但RSV干預對上述指標的影響差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。RSV干預能顯著改善過度喂飼誘導的脂肪浸潤和肝臟脂滴形成，上調(diào)魚體AMPKα蛋白磷酸化水平及顯著提升Sirt1蛋白表達水平（725.8% DIO+RSV組 vs DIO組，P＜0.01），RSV干預同時顯著提升自噬標志蛋白LC3-I I的水平（P＜0.05）。結論：RSV在沒有影響體長、體質(zhì)量和血脂的情況下，可以調(diào)節(jié)飲食誘導肥胖斑馬魚的脂代謝，這可能與pAMPKa/Sirt1/自噬通路有關。

白藜蘆醇；自噬；脂代謝；肥胖；斑馬魚

肥胖癥（obesity）作為代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）的主要組分之一，與高血壓、糖尿病、冠心病等疾病密切相關，嚴重危害著人類健康。2010年國際肥胖癥研究協(xié)會報告顯示，全球肥胖癥患者達4.75億，每年至少有260萬人死于肥胖及其相關疾?。?］。近年來的研究表明，以白藜蘆醇（resveratrol，RSV）和茶多酚等多酚類為代表的植物化學物被認為在預防MS及心血管疾病方面頗具前景，但關鍵性預防作用機制尚待探明。有研究表明，RSV可以通過腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPKα）/沉默信息調(diào)控因子1 （sirtuins 1，Sirtl）上調(diào)微管相關蛋白1輕鏈3-β （microtubule-associated protein 1 light chain3-β，LC3）表達［2］。LC3是自噬的特異性標記蛋白之一，LC3-I I/I與LC3-I I可反映自噬水平的高低。目前，對于RSV是否通過誘導自噬調(diào)節(jié)脂代謝尚未闡明。

斑馬魚是一種廣泛使用的模式生物，它在飲食誘導肥胖方面與哺乳動物有著共同的病理生理途徑［3］。本研究以斑馬魚為對象，觀察過度喂飼和RSV干預對斑馬魚脂代謝和AMPKα、Sirt1、窖蛋白-1 （caveolin 1，Cav-1）和LC3等蛋白表達水平的影響，以明確RSV是否通過誘導自噬調(diào)節(jié)脂代謝。

1　材料和方法

1.1材料 RSV（購于南京春秋生物工程有限公司，純度≥99%）。血液總膽固醇（total cholesterol，TC）酶法測定試劑盒和血液甘油三酯（triglyceride，TG）酶法測定試劑盒購自普利萊基因技術有限公司。pAMPKα（Thr172）（40H9）和Cav-1（D46G3）抗體購買于Cell Signaling Technology公司；LC3-I I （NB820-59177）購自Novus公司；AMPKα（10929-2-AP）、Sirt1（13161-1-AP）和GAPDH（60004-1-lg）購自Proteintech公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物：本研究所用斑馬魚為無病原體AB系，由溫州市水域科學與環(huán)境生態(tài)重點實驗室提供。選擇120～130 d齡雄性個體作為受試對象。飼養(yǎng)條件參照文獻［4］。飼養(yǎng)水溫（26±1）℃，pH值為6.5～7.5，電導率保持在450～1 000 μs/cm，光周期為14L：10D。以鹽水豐年蟲幼體作為飼料，每天定時定量喂飼。每天觀察記錄魚的生長情況，及時清除食物殘渣和糞便，一直持續(xù)至實驗結束。

1.2.2 實驗設計：120條成年雄性斑馬魚隨機分為4組，每組30條：正常喂飼組（Con）、正常喂飼+RSV組（Con+RSV）、過度喂飼組（DIO）、過度喂飼+RSV組（DIO+RSV）。正常喂飼蟲卵量為每天8 mg，9：00喂飼1次；過量喂飼蟲卵量為每天60 mg，9：00、 12：00、17：00 3次喂飼。RSV干預劑量為20 μmol/L，每天22：00～次日9：00將斑馬魚置于新鮮配制的RSV水溶液中飼養(yǎng)干預11 h，持續(xù)8周。

1.3肥滿度的測定 待檢測斑馬魚禁食24 h后，用濾紙吸干魚體表面的殘留水分，測體長、體質(zhì)量，計算肥滿度（condition factor）。

肥滿度=體質(zhì)量（g）×100/體長（cm）3

1.4血漿TG和TC測定 待檢測斑馬魚禁食24 h后，用濾紙吸干魚體表面的殘留水分、斷尾，用肝素化毛細管取血，將新鮮血液置于200 μL Eppendorf管，于1 000×g離心5 min得到血漿，-80 ℃保存待用。按試劑盒說明書操作。

1.5肝組織形態(tài)學檢測 在體視顯微鏡下將待檢測斑馬魚快速解剖摘取肝臟，置于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度為4 μm，再通過脫蠟水化后，蘇木精-伊紅染色，最后脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.6魚體pAMPKα/AMPKα、Sirt1、Cav-1和LC3蛋白表達水平檢測 在體視顯微鏡下將待檢測斑馬魚快速解剖摘除內(nèi)臟，去頭去尾去脊椎骨后-80 ℃保存?zhèn)溆?。Western blot法作蛋白檢測：將凍存的魚體剪碎，用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，100 ℃變性5 min，每個樣本取40 μg蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜10 min×3次，分別孵育pAMPKα（1：1 000）、AMPKα（1：1 000）、Sirt1 （1：1 000）、Cav-1（1：1 000）、LC3-I I（1：1 000）和GAPDH（1：5 000），4 ℃過夜，TBST洗膜10 min×3次，二抗（1：5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，最后顯影成像分析，計算各蛋白條帶和內(nèi)參（GAPDH）的比值。

2　結果

2.1斑馬魚體長、體質(zhì)量、肥滿度和血脂的改變

喂食量和RSV對斑馬魚體長的影響存在交互效應（P＜0.05）；但對體質(zhì)量、肥滿度、TG和TC的交互效應均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在無RSV干預情況下，過度喂飼使斑馬魚體長、體質(zhì)量和肥滿度分別增加11.7%、61.9%和15.1%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；但過度喂飼對TG和TC的影響均無統(tǒng)計學意義（P＞0.10）。在正常喂飼情況下，RSV干預可使體長增加1.5%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在過度喂飼情況下，RSV干預可使體長平均減少2.5%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。RSV干預對體質(zhì)量、肥滿度、TG和TC的影響均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.10）。見表1。

表1　斑馬魚體長、體質(zhì)量、肥滿度和血脂檢測結果（±s）

表1　斑馬魚體長、體質(zhì)量、肥滿度和血脂檢測結果（±s）

組別　體長（cm，n=30）　體質(zhì)量（g，n=30）　肥滿度（100 g/cm3，n=30）　TC（mmol/L，n=4）　TG（mmol/L，n=4）Con　3.25±0.15　0.265±0.028　0.781±0.104　4.39±0.51　8.06±1.15 Con+RSV　3.30±0.20　0.277±0.033　0.781±0.125　4.34±0.74　6.14±1.75 DIO　3.63±0.17　0.429±0.052　0.899±0.110　5.13±0.44　6.63±0.94 DIO+RSV　3.54±0.18　0.416±0.055　0.937±0.112　4.31±0.32　7.12±0.32 F喂食＜94.438　362.811?。?4.123　1.833　0.154 FRSV＜ 0.263?。肌?.004?。?0.806　2.714　1.531 F交互＜ 4.644　＜　2.365?。?0.841　2.075　4.335 P喂食＜0.001?。?.001?。?.001　0.201　0.702 PRSV＜ 0.609　＜ 0.953?。?0.371　0.125　0.240 P交互＜ 0.033　＜　0.127?。?0.361　0.175　0.059

2.2肝臟組織形態(tài)學檢測 DIO組斑馬魚肝臟觀察到脂肪浸潤和肝臟脂滴，并且出現(xiàn)肝索結構紊亂。在Con組、Con+RSV組和DIO+RSV組中沒有發(fā)現(xiàn)肝臟脂滴和肝索結構紊亂現(xiàn)象。見圖1。

2.3魚體pAMPKα/AMPKα、Sirt1、Cav-1和LC3蛋白表達水平的變化 喂食量和RSV對斑馬魚pAMPKα/ AMPKα蛋白表達水平的交互效應無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。喂食量對斑馬魚pAMPKα/AMPKα蛋白表達水平的影響無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；RSV干預使pAMPKα/AMPKα蛋白表達水平增高（P＜0.05），在正常喂飼情況下平均增高204.8%，在過度喂飼情況下平均增高186.5%。見圖2A。喂食量和RSV對斑馬魚Sirt1蛋白表達水平的影響存在交互效應（P＜0.01）。在正常喂飼情況下，RSV對Sirt1蛋白表達水平的影響無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但在過度喂飼情況下，RSV干預可使Sirt1蛋白表達水平增高達725.8%（P＜0.01）。見圖2B。

喂食量和RSV對斑馬魚LC3蛋白表達水平的交互效應無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。喂食量對斑馬魚LC3-I I蛋白表達水平的影響無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；RSV干預使LC3-I I蛋白表達水平增高（P＜0.05），在正常喂飼情況下平均增高47.3%，在過度喂飼情況下平均增高100.0%。見圖2C。喂食量和RSV對斑馬魚Cav-1蛋白表達水平的影響存在交互效應（P＜0.05）。DIO組Cav-1蛋白表達水平高于Con組（P＜0.05）；在正常喂飼情況下，RSV干預使Cav-1蛋白表達水平增高，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在過度喂飼情況下，RSV干預可使Cav-1蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見圖2D。

圖1　斑馬魚肝臟組織學檢測結果（HE染色，×400）

3　討論

模式動物斑馬魚具有個體小、養(yǎng)殖成本低、生長周期短、體外發(fā)育、胚體透明、在解剖學與生理學上與人類具有高度的相似性且其在基因組水平上與包括人類在內(nèi)的其他脊椎動物具有驚人的相似等優(yōu)點，已廣泛用于生命科學和環(huán)境科學等研究領域。肥胖是由遺傳和環(huán)境因素共同作用而引起的體質(zhì)量增加、脂肪積聚過多所致的慢性代謝性疾病，嚴重影響機體健康。肥滿度是衡量和反映魚類肥瘦程度和生長情況的指標，用于分析不同環(huán)境對動物營養(yǎng)狀況的影響等［5］。本研究通過以每天60 mg喂飼8周后成功誘導了斑馬魚肥胖，表現(xiàn)為體長、體質(zhì)量和肥滿度明顯增加，這一結果與Oka等［3］的研究結果相一致。

圖2　RSV對斑馬魚魚體pAMPKα/AMPKα、Sirt1、LC3-I I和Cav-1蛋白表達水平的影響

RSV是一種非黃酮多酚類植物化合物，廣泛來源于花生、葡萄、虎杖、桑椹等植物，研究表明它具有抗肥胖作用。Lagouge等［6］和Wang等［7］的研究表明，在RSV長期干預或者高劑量的RSV（200或400 mg·d/kg）作用下，可使得高脂飲食誘導肥胖的小鼠體質(zhì)量下降。在本研究中，RSV干預（20 mmol/L）在斑馬魚形態(tài)學上未見有明顯改善，對血脂也未見有明顯影響，但肝臟組織學檢查發(fā)現(xiàn)它能顯著改善過度喂飼誘導的脂肪浸潤和肝臟脂滴形成。說明RSV能夠影響斑馬魚的脂代謝，防止過度飲食誘導的肝臟脂肪變性。

AMPK是對細胞能量代謝敏感的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過調(diào)節(jié)Sirt1的表達從而調(diào)控脂代謝，維持細胞內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)，因此被稱為“細胞能量檢測器”。AMPK是由α、β、γ 3個亞基組成，其中α為反應亞基，它的Thr172磷酸化是調(diào)節(jié)其活性的關鍵位點。本研究結果顯示，RSV干預使得pAMPKα/AMPKα表達水平升高，說明RSV激活AMPKα的磷酸化。而磷酸化的AMPKα可以增加NAD+和NAD+/NADH水平，進而增強Sirt1的活性［8］。本研究結果顯示，在過度喂飼情況下，RSV干預使Sirt1蛋白表達水平增高。提示在DIO+RSV組中RSV通過激活AMPK的磷酸化水平上調(diào)Sirt1蛋白的表達。Sirt1參與自噬調(diào)節(jié)，通過以NAD+依賴方式與Atg5、Atg7和Atg8形成復合物，使其脫乙酰化，激活自噬［9］，進而參與脂質(zhì)降解代謝過程［2］。因此，Sirt1能夠通過誘導自噬，促進脂質(zhì)降解代謝。

LC3是自噬特異性的標記蛋白。最近研究表明，LC3-I I以乙酰化的形式存在于細胞核內(nèi)，而Sirt1通過對其K49和K51位點進行去乙酰化激活LC3［10］。LC3定位自噬體膜上，與Cav-1耦合形成脂筏［11］。Cav-1參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)膽固醇的流出，并與LC3結合，維持著自噬和脂代謝的穩(wěn)態(tài)［11］。本研究結果表明，在過度喂飼情況下，RSV干預使LC3-I I表達升高，而Cav-1表達降低，提示在過度喂飼情況下，RSV可能通過下調(diào)Cav-1蛋白表達調(diào)控脂代謝。但在正常喂飼情況下，RSV的干預同樣使LC3-I I表達水平升高，而Cav-1蛋白表達水平卻呈增高趨勢。這表明在正常喂飼與過度喂飼情況下，RSV對自噬影響的機制不同。

RSV在沒有明顯影響體長、體質(zhì)量和肥滿度等前提下，可以調(diào)節(jié)飲食誘導肥胖斑馬魚脂代謝，這種調(diào)節(jié)作用可能涉及Sirt1/pAMPKa/自噬機制。

［1］葛均波, 徐永健.內(nèi)科學[M].北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2013: 769.

［2］WU YLI XZHU J Xet al.Resveratrol-activated AMPK/ SIRT1/autophagy in cellular models of Parkinson's disease ［J］.Neurosignals201119（3）163-174.

［3］OKA TNISHIMURA YZANG Let al.Diet-induced obesity in zebrafish shares commonpathophysiological pathways with mammalian obesity［J］.BMC Physiol201010：21.

［4］WESTERFIELD M.The zebrafish book［M］.EugeneUniversity of Oregon Press20003-4.

［5］VERGAUWEN LBENOOT DBLUST Ret al.Long-term warm or cold acclimation elicits a transcriptional response and affects energy metabolism in zebrafish［J］.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol2010157（2）149-157.

［6］LAGOUGE MARGMANN CGERHART-HINES Zet al.Resveratrol improves mitochondrial function and protects against metabolic disease by activating SIRT1 and PGC-1alpha［J］.Cell2006127（6）1109-1122.

［7］WANG BSUN JLI Let al.Regulatory effects of resveratrol on glucose metabolism and T-lymphocyte subsets in the development of high-fat diet-induced obesity in C57BL/6 mice［J］.Food Funct20145（7）1452-1463.

［8］CHUNG J HMANGANIELLO VDYCK J R.Resveratrol as a calorie restriction mimetictherapeutic implications［J］.Trends Cell Biol201222（10）546-554.

［9］LEE I HCAO LMOSTOSLAVSKY Ret al.A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy［J］.Proc Natl Acad Sci U S A2008105（9）3374-3379.

［10］HUANG RXU YWAN Wet al.Deacetylation of nuclear LC3 drives autophagy initiation under starvation［J］.Mol Cell201557（3）456-466.

［11］CHEN Z HCAO J FZHOU J Set al.Interaction of caveolin-1 with ATG12-ATG5 system suppresses autophagy in lung epithelial cells［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2014306（11）L1016-L1025.

(本文編輯：吳彬)

Resveratrol ameliorates the lipid metabolism in the diet-induced obese zebrafish

RAN Gai1YING Li1LI Lin1DENG Tuo1YAN Qiaoqiao1YING Chenjiang2YE Xiaolei1.1.School of Environmental Science and Public HealthWenzhou Medical UniversityWenzhou325035； 2.Department of Nutrition and Food HygieneSchool of Public HealthHuazhong University of Science and TechnologyWuhan430030

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol （RSV） on lipid metabolism in diet-induced obese zebrafish.MethodsOne hundred and twenty adult zebrafish （Danio rerio） of the wild-type strain （AB） were randomly allocated into 4 groupscontrol group （Con）Con+RSVdiet-induced obese （DIO）and DIO+RSV.The Con group was fed on freshly hatched live Artemia （8 mg cysts/fish/day） once a day for 8 weeks.The DIO group was fed on freshly hatched live Artemia （60 mg cysts/fish/day） three times a day for 8 weeks.The fish were exposed to 20 mmol/L resveratrol for 11 hours every day.After 8 weeksthe body lengthbody weighttotal cholesterol （TC）and triglyceride （TG） were measured.The histology of the liver was evaluated.The protein levels of pAMPKαAMPKαSirt1caveolin-1 （Cav-1） and LC3-II were analyzed by western blotting.ResultsAfter 8 weeksthe body lengthbody weight and condition factor increased by 11.7%61.9% and 15.1% （P＜0.01）respectively.There was interaction effect on body length between the food intake and resveratrol （P=0.033）but resveratrol had no effect on the above parameters.Resveratrol could significantly alleviate the fatty infiltration and the formation of lipid droplets in the liverand resveratrol up-regulated protein levels of pAMPKαSirt1 （725.8% DIO+RSV group vs.DIO groupP＜0.01） and autophagy marker protein LC3-II （P=0.047）.ConclusionWithout affecting the body lengthbody weight and lipid parametersresveratrol ameliorates the lipid metabolism via pAMPK/Sirt1/autophagy pathway in the diet-induced obese zebrafish.

resveratrol； autophagy； lipid metabolism； obesity； zebrafish

R151.3

ADOI10.3969/j.issn.2095-9400.2016.06.005

2015-12-08

國家自然科學基金資助項目（81273060，81373007）。

冉蓋（1989-），男，四川達州人，碩士生。

葉曉蕾，教授，碩士生導師，Email：yexiaolei@wmu.edu.cn。