登革病毒HLA-A*0201限制性T細(xì)胞表位誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的研究

段志良，李德周，徐娟娟，賈慶軍，劉慧芳，陳柏坤，文金生

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院　醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江　溫州　325027；2.寧波市第二醫(yī)院　肝病科，浙江　寧波　315000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)　蟲媒病毒研究所，浙江　溫州　325035）

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登革病毒HLA-A*0201限制性T細(xì)胞表位誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的研究

段志良1，李德周2，徐娟娟3，賈慶軍3，劉慧芳3，陳柏坤3，文金生3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江溫州325027；2.寧波市第二醫(yī)院肝病科，浙江寧波315000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)蟲媒病毒研究所，浙江溫州325035）

目的：探討登革病毒（DENV）HLA-A*0201限制性T細(xì)胞表位誘導(dǎo)DENV血清型間交叉反應(yīng)性T細(xì)胞的效應(yīng)。方法：基于已鑒定DENV-1中HLA-A*0201限制性CD8+T細(xì)胞表位（NS4b40-48TLYAVATTI）序列，合成在其他血清型中相似的候選表位，采用MHC-肽復(fù)合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)候選表位與HLA-A*0201結(jié)合力。采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）實(shí)驗(yàn)研究已鑒定表位及候選表位免疫HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的CD8+T細(xì)胞識(shí)別相同及相似表位能力；采用ELISPOT實(shí)驗(yàn)研究不同DENV血清型感染HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠是否產(chǎn)生能識(shí)別已鑒定表位及候選表位的T細(xì)胞反應(yīng)。結(jié)果：DENV-3中NS4b39-47TLYAVATTV與HLA-A*0201具高結(jié)合力，但DENV-2 中NS4b39-47TLYAVATTF與HLA-A*0201結(jié)合力弱。DENV-1-NS4b40-48和DENV-3-NS4b39-47免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠脾、淋巴結(jié)和外周血中存在可識(shí)別DENV-1-NS4b40-48、DENV-2-NS4b39-47和DENV-3-NS4b39-47的交叉反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞。在DENV-1，-2，-3感染的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)也存在類似的T細(xì)胞反應(yīng)。結(jié)論：DENV-3中NS4b39-47TLYAVATTV為新的CD8+T細(xì)胞表位，該表位及已報(bào)道表位NS4b40-48TLYAVATTI均可誘導(dǎo)DENV血清型間交叉反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，二者有助于我們研究DENV血清型間交叉反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的功能以及用于評(píng)估DENV候選疫苗的T細(xì)胞免疫效應(yīng)。

登革病毒；HLA-A*0201；交叉反應(yīng)性；CD8+T細(xì)胞

登革病毒（dengue virus，DENV）包括4個(gè)血清型（DENV-1，-2，-3，-4），其翻譯3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C、PrM/M、E）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。全球有36億人生活在DENV流行區(qū)，每年3.9億人感染DENV［1］。在前期研究中，我們從DENV-1中鑒定出了1條HLA-A*0201限制性CD8+T細(xì)胞表位（NS4b40-48TLYAVATTI）［2］，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)：該表位與DENV-4中相同位置肽序列完全一致，而與DENV-2和DENV-3中相同位置的肽序列之間存在一個(gè)氨基酸差異。在本研究中，我們將探討這些肽所誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞之間是否存在交叉反應(yīng)。

1　材料和方法

1.1材料 前期鑒定的1條CD8+T細(xì)胞表位（DENV-1-NS4b40-48TLYAVATTI）和2條候選表位（DENV-2-NS4b39-47TLYAVATTF和DENV-3-NS4b39-47TLYAVATTV）由上海強(qiáng)耀多肽合成公司合成，肽純度＞95%。T2細(xì)胞株、白紋伊蚊細(xì)胞（C6/36細(xì)胞）株和非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）株由美國(guó)ATCC提供。β2微球蛋白（β2M）由美國(guó)Sigma公司提供。HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠［C57BL/6-Tg（HLA-A2.1）1Enge/J小鼠］，雌性，30只，6～8周齡，由美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室提供并在溫州醫(yī)科大學(xué)蟲媒病毒研究所飼養(yǎng)和繁殖。小鼠隨機(jī)分成6組（每組5只）用于肽免疫和DENV感染，本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)過溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批同意。FITC標(biāo)記的抗HLA-A*0201的流式單抗由美國(guó)BD公司提供。DENV-1（Hawaii株，標(biāo)準(zhǔn)株）、DENV-2（NGC株，標(biāo)準(zhǔn)株）和DENV-3（H87株，標(biāo)準(zhǔn)株）由美國(guó)ATCC提供。小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）試劑盒由荷蘭U-CyTech公司提供。

1.2方法

1.2.1MHC-肽復(fù)合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)候選表位與T2細(xì)胞株表面HLA-A*0201分子的結(jié)合力，參考文獻(xiàn)［2］中的方法進(jìn)行：①實(shí)驗(yàn)組T2細(xì)胞在含有β2M（3 μg/mL）、不同濃度候選表位（1、10、100 μg/mL）的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基中置于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)1 h，接著在26 ℃培養(yǎng)12 h37 ℃培養(yǎng)3 h。背景對(duì)照（無(wú)肽組）T2細(xì)胞采用同樣方法培養(yǎng)（含β2M，無(wú)肽）。②采用FITC標(biāo)記的抗HLA-A*0201流式單抗于4 ℃染色T2細(xì)胞40 min。③流式細(xì)胞儀（BD FACSAria）測(cè)定T2細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度（MFI），采用下列公式計(jì)算熒光指數(shù)（FI）。肽濃度100 μg/mL時(shí)，F(xiàn)I大于1的肽被認(rèn)為是高結(jié)合力肽［2］。

1.2.2肽免疫HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠：每條肽均用于免疫HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠。首先，采用弗氏完全佐劑乳化的肽于小鼠背部皮下多點(diǎn)免疫（每只50 μg）。1周后，采用弗氏不完全佐劑乳化的肽加強(qiáng)免疫小鼠3次（每只50 μg，每次免疫間隔1周）。然后，于末次免疫1周后處死小鼠，收集外周血分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），取脾制備脾細(xì)胞懸液，取腘窩和鎖骨下淋巴結(jié)制備淋巴結(jié)細(xì)胞懸液。最后，采用小鼠IFN-γ ELISPOT試劑檢測(cè)PBMC、脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞中識(shí)別相同或相似表位的CD8+T細(xì)胞的水平。

1.2.3DENV培養(yǎng)及HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠的感染：分別將DENV-1，-2和-3加入C6/36細(xì)胞于37 ℃孵育2 h，棄病毒液、加RPMI-1640維持液后于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)50%的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收集細(xì)胞及上清予10 000 r/min離心10 min，收集上清液。采用無(wú)菌的0.22 μm過濾器過濾上述上清液以進(jìn)一步除去細(xì)胞碎片，濾過液中含有高純度的病毒顆粒。利用病毒空斑形成實(shí)驗(yàn)在Vero細(xì)胞上測(cè)定濾過液中病毒效價(jià)，采用空斑形成單位（PFU）/mL表示。調(diào)整病毒液的PFU后凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。將DENV-1，-2和-3經(jīng)小鼠尾靜脈注射感染HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠（每只0.5 mL病毒液，含1×107PFU）。DENV感染的第4周，處死小鼠后制備脾細(xì)胞懸液。采用IFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脾細(xì)胞中肽特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞水平。

1.2.4小鼠IFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn)：參考文獻(xiàn)［3］實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)。將肽免疫的HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠及DENV感染的HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞（每孔1×105個(gè)細(xì)胞）、淋巴結(jié)細(xì)胞（每孔2×105個(gè)細(xì)胞）和PBMC（每孔5×104個(gè)細(xì)胞）分別加入預(yù)包被的小鼠IFN-γ ELISPOT 96孔板中，設(shè)置背景對(duì)照孔（無(wú)肽）和實(shí)驗(yàn)孔（加10 μg/mL相同肽或不同肽）；將ELISPOT板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；洗板后每孔加入生物素化的抗小鼠IFN-γ的單抗，于37 ℃孵育1 h；洗板后每孔加入耦聯(lián)鏈霉親合素的辣根過氧化酶（HRP），于37 ℃孵育1 h；洗板后每孔加ACE顯色底物，于37 ℃避光反應(yīng)20 min；將板徹底洗滌并干燥，采用ELISPOT讀板儀計(jì)數(shù)每孔膜上斑點(diǎn)數(shù)。1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)斑點(diǎn)形成細(xì)胞（SFC），對(duì)應(yīng)于1個(gè)肽特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞。肽特異性T細(xì)胞的頻率表示為SFCs/1×105脾細(xì)胞或2×105淋巴結(jié)細(xì)胞或5×104PBMC。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用來(lái)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肽與HLA-A*0201分子的結(jié)合力 如表1所示，Blast檢索結(jié)果表明NS4b40-48TLYAVATTI在DENV-1和DENV-4中保守性分別為71%和100%。候選表位NS4b39-47TLYAVATTF和NS4b39-47TLYAVATTV在DENV-2和DENV-3中保守性分別為99%和100%。3條肽僅在末尾存在1個(gè)氨基酸差異。NS4b40-48TLYAVATTI與HLA-A*0201分子的結(jié)合力隨肽濃度增加而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)肽濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，其FI值大于1（為1.65）。NS4b39-47TLYAVATTV與HLA-A*0201分子結(jié)合力更強(qiáng)，其FI值在肽濃度為10 μg/mL和100 μg/mL時(shí)分別為1.62和4.85，均大于1。然而，對(duì)于NS4b39-47TLYAVATTF而言，盡管其FI值與肽濃度呈正比，但一直小于1。

MHC-肽復(fù)合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)流式結(jié)果如圖1所示，T2細(xì)胞在無(wú)肽、低濃度肽（1 μg/mL）、中濃度肽（10 μg/mL）、高濃度肽（100 μg/mL）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后采用FITC標(biāo)記的抗HLA-A*0201的流式單抗染色細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞MFI值，計(jì)算FI值。T2細(xì)胞未與肽孵育時(shí)，細(xì)胞表面HLA-A*0201分子的肽結(jié)合凹槽空置，導(dǎo)致該分子容易從細(xì)胞表面丟失，細(xì)胞的MFI對(duì)應(yīng)于紅色峰圖。隨著肽的添加以及肽濃度的提高，結(jié)合肽的HLA-A*0201分子越來(lái)越多，流式峰圖向右側(cè)偏移。

表1　肽的信息

圖1　肽與HLA-A*0201分子的結(jié)合力實(shí)驗(yàn)

2.2肽免疫HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)

DENV-1-NS4b40-48、DENV-2-NS4b39-47和DENV-3-NS4b39-47分別免疫HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠，采用IFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞和PBMC中效應(yīng)細(xì)胞識(shí)別相同及相似肽的效應(yīng)。如圖2所示，DENV-1-NS4b40-48免疫小鼠的脾細(xì)胞中存在3種肽特異性的T細(xì)胞，識(shí)別相同肽（DENV-1-NS4b40-48）的T細(xì)胞頻率［（88±14）SFC/1×105脾細(xì)胞］高于識(shí)別DENV-2-NS4b39-47的T細(xì)胞頻率［（68±8）SFC/1×105脾細(xì)胞］，但低于識(shí)別DENV-3-NS4b39-47的T細(xì)胞的頻率［（109±17）SFC/1×105脾細(xì)胞］。3種肽特異性T細(xì)胞的頻率與無(wú)肽組［（2±1）SFC/1×105脾細(xì)胞］比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。但DENV-2-NS4b39-47免疫小鼠脾細(xì)胞中3種肽特異性T細(xì)胞頻率低，與無(wú)肽組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DENV-3-NS4b39-47免疫小鼠的脾細(xì)胞中也存在3種肽特異性的T細(xì)胞，識(shí)別相同肽（DENV-3-NS4b39-47）的T細(xì)胞頻率［（28±7）SFC/1×105脾細(xì)胞］低于識(shí)別DENV-1-NS4b40-48的T細(xì)胞的頻率［（38±5）SFC/1×105脾細(xì)胞］，但高于識(shí)別DENV-2-NS4b39-47的T細(xì)胞頻率［（22±5）SFC/1×105脾細(xì)胞］。3種肽特異性T細(xì)胞的頻率與無(wú)肽組［（3±2）SFC/1×105脾細(xì)胞］比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

如圖3所示，DENV-1-NS4b40-48免疫小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞中存在可識(shí)別3種肽的T細(xì)胞，識(shí)別DENV-1-NS4b40-48的T細(xì)胞頻率［（123±21）SFC/2×105淋巴結(jié)細(xì)胞］大于識(shí)別DENV-2-NS4b39-47的T細(xì)胞頻率［（91±12）SFC/2×105淋巴結(jié)細(xì)胞］，但小于識(shí)別DENV-3-NS4b39-47的T細(xì)胞的頻率［（149±25）SFC/ 2×105淋巴結(jié)細(xì)胞］。3種肽特異性T細(xì)胞的頻率與無(wú)肽組［（4±2）SFC/2×105淋巴結(jié)細(xì)胞］比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。DENV-2-NS4b39-47免疫小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞中3種肽特異性T細(xì)胞頻率升高不明顯，與無(wú)肽組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DENV-3-NS4b39-47免疫的小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞中同樣存在可識(shí)別3種肽的T細(xì)胞，識(shí)別DENV-3-NS4b39-47的T細(xì)胞頻率［（42±11）SFC/2×105淋巴結(jié)細(xì)胞］低于識(shí)別DENV-1-NS4b40-48的T細(xì)胞頻率［（58±7）SFC/2×105淋巴結(jié)細(xì)胞］，但高于識(shí)別DENV-2-NS4b39-47的T細(xì)胞頻率［（33±8）SFC/2×105淋巴結(jié)細(xì)胞］。3種肽特異性T細(xì)胞的頻率與無(wú)肽組［（5±3）SFC/2×105淋巴結(jié)細(xì)胞］比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

圖2　肽免疫的HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞內(nèi)肽特異性T細(xì)胞測(cè)定

如圖4所示，DENV-1-NS4b40-48免疫小鼠的PBMC中存在可識(shí)別3種肽的T細(xì)胞，識(shí)別DENV-1-NS4b40-48的T細(xì)胞頻率［（64±9）SFC/5×104PBMC］高于識(shí)別DENV-2-NS4b39-47的T細(xì)胞頻率［（51±6）SFC/5×104PBMC］，但低于識(shí)別DENV-3-NS4b39-47的T細(xì)胞頻率［（85±13）SFC/5×104PBMC］。3種肽特異性T細(xì)胞的頻率與背景對(duì)照［（1±1）SFC/5×104PBMC］比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。DENV-2-NS4b39-47免疫的小鼠的PBMC中3種肽特異性T細(xì)胞頻率低，與無(wú)肽組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DENV-3-NS4b39-47免疫小鼠的PBMC中存在可識(shí)別3種肽的T細(xì)胞，識(shí)別DENV-3-NS4b39-47的T細(xì)胞頻率［（21±6）SFC/5× 104PBMC］低于識(shí)別DENV-1-NS4b40-48的T細(xì)胞的頻率［（29±4）SFC/5×104PBMC］，但高于識(shí)別DENV-2-NS4b39-47的T細(xì)胞頻率［（18±4）SFC/5×104PBMC］。3種肽特異性T細(xì)胞的頻率與無(wú)肽組［（2±1）SFC/5× 104PBMC］比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.3DENV感染的HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)肽特異性T細(xì)胞的水平 DENV-1，-2，-3分別感染HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠，然后采用IFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脾細(xì)胞中識(shí)別相同及相似肽的T細(xì)胞的水平。如圖5所示，DENV-1感染的小鼠的脾細(xì)胞中存在可以識(shí)別3種肽的T細(xì)胞，識(shí)別DENV-1-NS4b40-48的T細(xì)胞頻率［（24±5）SFC/1×105脾細(xì)胞］低于識(shí)別DENV-2-NS4b39-47的T細(xì)胞頻率［（34±3）SFC/1×105脾細(xì)胞］，也低于識(shí)別DENV-3-NS4b39-47的T細(xì)胞的頻率［（31±7）SFC/1×105脾細(xì)胞］，三者與無(wú)肽組［（1±1）SFC/1×105脾細(xì)胞］比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。DENV-3感染的小鼠的脾細(xì)胞中存在可以識(shí)別3種肽的T細(xì)胞，識(shí)別DENV-3-NS4b39-47的T細(xì)胞頻率［（13±2）SFC/1×105脾細(xì)胞］高于識(shí)別DENV-1-NS4b40-48的T細(xì)胞的頻率［（10±2）SFC/1×105脾細(xì)胞］，也高于識(shí)別DENV-2-NS4b39-47的T細(xì)胞頻率［（11±2）SFC/1×105脾細(xì)胞］，三者與無(wú)肽組［（1±1）SFC/1×105脾細(xì)胞］比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。但DENV-2感染小鼠誘導(dǎo)的肽特異性T細(xì)胞反應(yīng)不明顯，與無(wú)肽組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4　肽免疫的HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠的PBMC內(nèi)肽特異性T細(xì)胞測(cè)定

圖5　DENV感染的HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞內(nèi)肽特異性T細(xì)胞測(cè)定

3　討論

感染過某種DENV血清型的個(gè)體在再次感染不同血清型時(shí)易發(fā)生登革出血熱/登革休克綜合征（DHF/ DSS）［4］，科學(xué)家們認(rèn)為原始抗原效應(yīng)（original antigenic sin，OAS）［5］可能介導(dǎo)DHF/DSS發(fā)生。該假說認(rèn)為：體內(nèi)已存在DENV特異CD8+T細(xì)胞在識(shí)別相似CD8+T細(xì)胞表位時(shí)更容易被活化但并不能有效地清除病毒，反而介導(dǎo)病理?yè)p傷［6］。但是，研究人員對(duì)于CD8+T細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)還是介導(dǎo)DHF/DSS發(fā)生尚有爭(zhēng)議［7］。最近研究證明：DENV特異性CD8+T細(xì)胞通過分泌IFN-γ或直接殺傷病毒感染的靶細(xì)胞而限制DENV感染，發(fā)揮免疫保護(hù)效應(yīng)［8-9］，而且DENV特異性CD8+T細(xì)胞還可以預(yù)防DENV二次感染時(shí)抗體依賴性增強(qiáng)效應(yīng)的發(fā)生［10］。事實(shí)上，由于DENV 4個(gè)血清型間氨基酸序列的同源性達(dá)到70%以上［11］，不同DENV血清型甚至同一血清型中不同病毒株之間僅存在少量位點(diǎn)氨基酸差異（導(dǎo)致相同位置CD8+T細(xì)胞表位個(gè)別氨基酸位點(diǎn)不同）。因而，某種DENV血清型感染機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD8+T細(xì)胞應(yīng)該可以分為兩群：一群為僅識(shí)別該DENV血清型的血清型特異性CD8+T細(xì)胞，另一群為可識(shí)別多個(gè)DENV血清型的交叉反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞。上述兩群細(xì)胞在DENV感染時(shí)到底是介導(dǎo)免疫病理?yè)p傷還是發(fā)揮預(yù)防作用還有待深入探討。CD8+T細(xì)胞反應(yīng)是由CD8+T細(xì)胞表位誘導(dǎo)產(chǎn)生的，因此鑒定CD8+T細(xì)胞表位對(duì)于闡明上述DENV特異性CD8+T細(xì)胞的功能是不可或缺的。

CD8+T細(xì)胞表位是與人HLA-A或B或C等分子結(jié)合的一般含有8～10個(gè)氨基酸殘基的肽段。HLA的基因具有多態(tài)性，其不同等位基因在人群中具有高低不同的百分率。HLA-A*0201、A*1101和A*2402作為HLA-A的廣譜性等位基因，其在不同人種、不同膚色人群中均具有較高的人群覆蓋性（均大于20%），三者總的人群覆蓋率達(dá)到80%以上［12］。因此，基于上述等位基因限制的CD8+T細(xì)胞表位研究DENV特異性CD8+T細(xì)胞的功能具有代表性和普遍意義。

本研究中，我們合成了前期鑒定的HLA-A*0201限制性CD8+T細(xì)胞表位（DENV-1-NS4b40-48TLYAVATTI）及在DENV-2和-3中相似的候選表位NS4b39-47TLYAVATTF 和NS4b39-47TLYAVATTV。盡管三者相互之間只有1個(gè)氨基酸變異，但MHC-肽復(fù)合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DENV-1-NS4b40-48和DENV-3-NS4b39-47與HLA-A*0201具較高結(jié)合力，但DENV-2-NS4b39-47與HLA-A*0201結(jié)合力并不強(qiáng)。HLA-A*0201限制性表位的氨基酸序列一般滿足以下特點(diǎn)：第2位氨基酸為L(zhǎng)或I，第9位氨基酸為L(zhǎng)或I或V［13］。顯然，DENV-1-NS4b40-48和DENV-3-NS4b39-47均滿足以上要求。但DENV-2-NS4b39-47TLY AVATTF中第9位氨基酸（F）不符合要求，其可能解釋了為什么該肽與HLA-A*0201結(jié)合力較低。IFN-γ是DENV特異性CD8+T細(xì)胞分泌的一種可發(fā)揮清除DENV作用的細(xì)胞因子［14］，我們接下來(lái)通過檢測(cè)IFN-γ的分泌來(lái)評(píng)估上述肽釋放可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。肽免疫HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)表明DENV-1-NS4b40-48、DENV-3-NS4b39-47特異性T細(xì)胞不但可以識(shí)別相同肽，而且還可以識(shí)別另外2條相似肽。而且在DENV感染的HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)我們也觀察到了相同的現(xiàn)象：這一方面證明了上述結(jié)果，另一方面也表明DENV-1和DENV-3感染小鼠后在其體內(nèi)翻譯的病毒蛋白可被其自身的蛋白酶體加工釋放出DENV-1-NS4b40-48和DENV-3-NS4b39-47，后者誘導(dǎo)了T細(xì)胞反應(yīng)。然而，在肽免疫及DENV感染的小鼠體內(nèi)，我們都沒有檢測(cè)到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的高水平的DENV-2-NS4b39-47特異性T細(xì)胞。

綜上所述，本研究表明DENV-3-NS4b39-47TLYAV ATTV應(yīng)該為HLA-A*0201限制性CD8+T細(xì)胞表位，DENV-1-NS4b40-48TLYAVATTI和DENV-3-NS4b39-47TLYAVA TTV均可以誘導(dǎo)DENV血清型間交叉反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)。二者將有助于研究DENV特異性T細(xì)胞的功能或評(píng)估小鼠中DENV候選疫苗的T細(xì)胞免疫效應(yīng)。

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（本文編輯：吳昔昔）

Study on the ability of dengue virus HLA-A*0201-restricted T-cell epitopes in inducing T cell response

DUAN Zhiliang1LI Dezhou2XU Juanjuan3JIA Qingjun3LIU Huifang3CHEN Bokun3WEN Jinsheng3.1.Department of Laboratorythe Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical UniversityWenzhou325027；2.Department of Liverthe Second Hospital of NingboNingbo315000； 3.Institute of ArbovirusesWenzhou Medical UniversityWenzhou325035

ObjectiveTo explore the ability of dengue virus （DENV）-specific HLA-A*0201-restricted T cell-epitope to induce DENV serotype cross-reactive T cell response.MethodsBased on the sequence of one previously identified DENV-1-specific HLA-A*0201-restricted CD8+T-cell epitope （NS4b40-48TLYAVATTI）the epitope variants in other DENV serotypes were synthesized and their binding affinity for HLA-A*0201 molecule was determined by using MHC-peptide complex stabilization assay.These peptides were used to immunize HLA-A*0201 transgenic miceand the ability of induced CD8+T cells to recognize the same epitope and epitope variant was evaluated by using enzyme-linked immunospot （ELISPOT） assay； Finallyindividual DENV serotype was used to infect HLA-A*0201 transgenic mice and ELISPOT assay was utilized to assess whether the induced CD8+T cells could recognize same epitope or epitope variant.ResultsThe epitope candidate in DENV-3 （NS4b39-47TLYAVATTV） had high affinity for HLA-A*0201 molecule while the epitope candidate in DENV-2 （NS4b39-47TLYAVATTF） bound to HLA-A*0201 molecule with a low affinity.Both DENV-1-NS4b40-48and DENV-3-NS4b39-47elicited DENV serotype cross-reactive CD8+T cells which were distributed in the spleen，lymph nodesperipheral blood of peptide-immunized transgenic mice and could recognize DENV-1-NS4b40-48，DENV-2-NS4b39-47and DENV-3-NS4b39-47simultaneously.Additionallythe same phenomenon was observed inDENV-1-2-3-infected HLA-A*0201 transgenic mice.ConclusionDENV-3-derived NS4b39-47TLYAVATTV is identified as novel CD8+T-cell epitope.Both this epitope and a previously identified epitope （NS4b40-48TLYAVATTI） triggered DENV serotype cross-reactive CD8+T cell responsewhich would help us clarify the function of DENV serotype cross-reactive CD8+T cells and evaluate the immunogenicity of DENV vaccine.

dengue virus； HLA-A*0201； cross-reactive； CD8+T cells

R373.2

ADOI10.3969/j.issn.2095-9400.2016.06.002

2015-09-03

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LQ14C010006，LY13H160035）；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20140653）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81501363）。

段志良（1976-），女，湖南婁底人，主管技師。

文金生，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：wjs78@wmu.edu.cn。