姜黃素對百草枯中毒大鼠急性腎氧化損傷的干預(yù)作用

鄭丹，韓文文，洪廣亮，趙光舉，李萌芳，蔡曉霞，吳斌，盧中秋

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院　重癥醫(yī)學(xué)科，浙江　臺州　317000；2.寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院急診科，浙江　寧波　315000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　急診醫(yī)學(xué)中心，浙江　溫州　325015）

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·論著·

姜黃素對百草枯中毒大鼠急性腎氧化損傷的干預(yù)作用

鄭丹1，韓文文2，洪廣亮3，趙光舉3，李萌芳3，蔡曉霞3，吳斌3，盧中秋3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江臺州317000；2.寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院急診科，浙江寧波315000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)中心，浙江溫州325015）

目的：探討姜黃素對百草枯（PQ）中毒大鼠急性腎氧化損傷的干預(yù)和可能機(jī)制。方法：將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組15只、姜黃素對照組（姜黃素50 mg/kg）15只、PQ染毒組（PQ 100 mg/kg）15只、姜黃素干預(yù)組（PQ染毒后15 min、24 h、48 h，腹腔注射姜黃素50 mg/kg）15只。大鼠經(jīng)處理后第1、第3、第7天取腎組織，化學(xué)比色法檢測腎組織勻漿液丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）含量，超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力；ELISA法檢測血紅素氧合酶-l（HO-1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）活力；RT-PCR法檢測核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2（Nrf2）mRNA表達(dá)，Western Blot法檢測Nrf2蛋白表達(dá)。光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織的病理變化。結(jié)果：與正常對照組比較，PQ染毒組和姜黃素干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)MDA含量均升高，GSH、SOD、CAT活力均降低，iNOS活力升高，Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)均升高，第1、第3天HO-l活力升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與同時(shí)間點(diǎn)PQ染毒組比較，姜黃素干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)MDA含量明顯降低，GSH、SOD、CAT明顯升高，iNOS活力下降，Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，第1、第3天HO-1活力升高（P＜0.05）；PQ染毒組腎小球球囊間隙增大，排列紊亂，隨時(shí)間延長，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)玻璃樣變性及空泡樣變性，姜黃素干預(yù)組病理表現(xiàn)較PQ染毒組明顯減輕。結(jié)論：姜黃素對PQ中毒大鼠急性腎氧化損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)腎組織Nrf2表達(dá)，上調(diào)HO-1、SOD等抗氧化酶水平，提高腎組織抗氧化應(yīng)激能力。

百草枯；腎損傷；核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2；姜黃素；氧化應(yīng)激

百草枯（paraqual，PQ）是一種廣譜有機(jī)雜環(huán)類除草劑。PQ中毒后對人體毒性較強(qiáng)，急性中毒后可引起肺、腎、肝等各臟器功能損害的表現(xiàn)，并且以肺、腎損害最明顯［1］。腎臟是PQ中毒的主要排泄器官，腎臟損傷加重PQ在體內(nèi)的蓄積。深入研究PQ中毒大鼠急性腎損傷的機(jī)制及其干預(yù)措施，對降低病死率有積極的意義。姜黃素有抗氧化、清除氧自由基、抗炎等作用。本研究通過建立PQ中毒大鼠急性腎損傷模型，觀察姜黃素干預(yù)后中毒大鼠腎組織核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2（Nrf2）的表達(dá)，觀察氧化及抗氧化指標(biāo)的變化。探討姜黃素對PQ中毒大鼠急性腎氧化損傷的影響和機(jī)制。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量220～250 g，2～3月齡，由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號（SCXK（浙）2010-0044）。該動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過溫州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 20% PQ水溶液由南通先正達(dá)作物保護(hù)有限公司提供；姜黃素由美國Sigma公司提供；氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活力測定試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；RNA提取試劑盒由美國Invitrogen公司提供；PCR試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供；核蛋白提取試劑盒由美國Pierce公司提供；Nrf2抗體由英國Abcam公司提供；血紅素氧合酶-l（heme oxygenase-l，HO-1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）的ELISA試劑盒由上海西塘生物科技有限公司提供。

1.3分組與處理 將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常對

照組、姜黃素對照組、PQ染毒組、姜黃素干預(yù)組，每組15只。PQ染毒組：100 mg/kg PQ一次性灌胃染毒（20% PQ溶液用0.9%氯化鈉溶液稀釋為2%的PQ溶液）；姜黃素干預(yù)組：在PQ染毒組處理后15 min、24 h、48 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別腹腔注射姜黃素50 mg/kg；正常對照組及姜黃素對照組均給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，姜黃素對照組在15 min、24 h、48 h后給予姜黃素50 mg/kg腹腔注射，正常對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。上述處理后第1、第3、第7天各組隨機(jī)選取5只大鼠，10%水合氯醛麻醉處死，取腎臟組織，PBS沖洗，分裝后立即放入液氮并及時(shí)置于-80 ℃冰箱凍存。

1.4指標(biāo)檢測

1.4.1腎組織中MDA、GSH含量和SOD、CAT活力測定：制備10%腎組織勻漿液，BCA法測蛋白濃度，用化學(xué)比色法測腎組織勻漿液中SOD、CAT活力和MDA、GSH含量。

1.4.2腎組織中HO-1和iNOS活力檢測：制備10%腎組織勻漿液，BCA法測蛋白濃度，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管、空白管、待測樣品管，在反應(yīng)板的每孔內(nèi)進(jìn)行加樣，3次洗板，最后在反應(yīng)板每孔中加入100 μL終止液后混勻，用酶標(biāo)儀在波長450 nm處檢測吸光值。最后得出腎組織勻漿液HO-1、iNOS含量。

1.4.3腎組織中Nrf2 mRNA測定及蛋白表達(dá)的檢測：提取腎組織總RNA，進(jìn)行RT-PCR。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠檢測，用Quanty one軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的基因/β-actin蛋白灰度表示目的基因相對表達(dá)量。提取腎組織細(xì)胞核蛋白，BCA法測蛋白濃度，用Western Blot法檢測Nrf2蛋白表達(dá)。用Quanty one軟件進(jìn)行灰度值分析，以Nrf2/β-actin蛋白灰度的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.4腎組織病理觀察：對4%多聚甲醛固定液中保存的腎組織進(jìn)行脫水和包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理變化。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

測定 與正常對照組比，PQ染毒組和姜黃素干預(yù)組在各自處理后的第1、第3、第7天MDA明顯升高，GSH含量、SOD、CAT活力明顯下降（P＜0.05）；與同時(shí)間點(diǎn)的PQ染毒組比，姜黃素干預(yù)組MDA含量下降，GSH含量和SOD、CAT活力均升高（均P＜0.05）。見表1。

2.1腎組織勻漿中MDA、GSH含量和SOD、CAT活力

表1　各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腎組織勻漿中MDA、GSH、SOD、CAT值的變化（n=5，±s）

表1　各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腎組織勻漿中MDA、GSH、SOD、CAT值的變化（n=5，±s）

與正常對照組比：aP＜0.05；與PQ染毒組比：bP＜0.05

組別　MDA（nmol/mg）　GSH（μmol/g）　SOD（U/mg）　CAT（U/mg）正常對照組第1天　0.48±0.01ab2.89±0.08ab112.96±1.57ab16.68±0.43ab第3天　0.48±0.01ab2.46±0.02ab113.41±4.01ab16.30±0.07ab第7天　0.49±0.00ab2.19±0.09ab112.90±6.56ab16.18±0.25ab姜黃素對照組第1天　0.48±0.01ab2.91±0.06ab112.19±0.66ab16.69±0.52ab第3天　0.49±0.01ab2.45±0.02ab112.90±2.69ab16.30±0.06ab第7天　0.49±0.00ab2.19±0.05ab112.82±5.54ab16.18±0.25abPQ染毒組第1天　0.54±0.01ab1.62±0.11ab99.89±0.63ab14.17±0.11ab第3天　0.57±0.01ab1.35±0.02ab94.06±0.91ab11.97±0.36ab第7天　0.66±0.02ab1.43±0.01ab94.67±0.93ab12.94±0.32ab姜黃素干預(yù)組第1天　0.52±0.00ab1.78±0.01ab103.39±0.52ab14.94±0.12ab第3天　0.55±0.00ab1.45±0.02ab99.57±0.45ab13.70±0.14ab第7天　0.60±0.02ab1.54±0.01ab102.98±0.29ab14.75±0.23ab

2.2各組大鼠腎組織HO-1和iNOS活力檢測 正常對照組中腎組織HO-1、iNOS表達(dá)均較低；與正常對照組比，PQ染毒組和姜黃素干預(yù)組的HO-1活力在各自處理后第1、第3天升高明顯，iNOS活力在各自處理后第1、第3、第7天升高明顯（P＜0.05）；與PQ染毒組比，同時(shí)間點(diǎn)的姜黃素干預(yù)組HO-1活力在給予姜黃素后的第1、第3天較之前升高明顯，iNOS活力在給予姜黃素后第1、第3、第7天均明顯下降（P ＜0.05）。見表2。

2.3各組大鼠腎組織中Nrf2 mRNA表達(dá) 正常對照組和姜黃素對照組的Nrf2 mRNA表達(dá)較少（P＞0.05）；與正常對照組比，PQ染毒組和姜黃素干預(yù)組的Nrf2 mRNA表達(dá)在第1、第3、第7天均有顯著升高（P＜0.05）；與PQ染毒組比，同一時(shí)間點(diǎn)姜黃素干預(yù)組的Nrf2 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見圖1。

2.4各組大鼠腎組織Nrf2蛋白表達(dá) 正常對照組和姜黃素對照組Nrf2蛋白表達(dá)均較少（P＞0.05）；與正常對照組比，PQ染毒組和姜黃素干預(yù)組Nrf2蛋白在第1、第3、第7天均有明顯升高（P＜0.05）；與PQ染毒組比，姜黃素干預(yù)組在第1、第3、第7天的Nrf2蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

表2　各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腎組織HO-1、iNOS活力變化（n=5，±s）

表2　各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腎組織HO-1、iNOS活力變化（n=5，±s）

與正常對照組比：aP＜0.05；與PQ染毒組比：bP＜0.05

組別　HO-1（pg/mg）　iNOS（ng/mg）正常對照組第1天　183.39±0.54ab68.27±5.68ab第3天　183.64±2.34ab67.85±3.41ab第7天　184.22±1.52ab68.10±2.81ab姜黃素對照組第1天　183.68±3.44ab67.59±6.23ab第3天　183.49±2.43ab68.38±4.26ab第7天　183.49±2.87ab68.03±5.68abPQ染毒組第1天　252.44±4.13ab126.27±2.80ab第3天　360.88±3.62ab224.62±4.58ab第7天　188.25±3.12ab183.24±5.77ab姜黃素干預(yù)組第1天　294.96±3.95ab95.35±3.63ab第3天　389.22±4.38ab177.44±6.62ab第7天　189.91±4.27ab146.24±4.16ab

圖1　各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腎組織Nrf2 mRNA表達(dá)變化

圖2　各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腎組織Nrf2蛋白表達(dá)變化

2.5光學(xué)顯微鏡下大鼠腎組織的病理改變 正常對照組腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，腎小管管腔正常；姜黃素對照組腎小球、腎小管排列緊密，未見明顯異常；PQ染毒組第1天腎小球球囊間隙明顯擴(kuò)大，細(xì)胞排列紊亂，第3天腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)玻璃樣變，伴有管型尿，第7天時(shí)玻璃樣變性進(jìn)一步加重，并出現(xiàn)空泡樣變性，腎小管管腔上皮細(xì)胞脫落；姜黃素干預(yù)組與各時(shí)間點(diǎn)的PQ染毒組比，腎小管上皮細(xì)胞的玻璃樣變性、空泡樣變性明顯減輕，細(xì)胞排列整齊、緊密。見圖3。

3　討論

PQ中毒進(jìn)入體內(nèi)后，快速地分布到各器官組織，經(jīng)由還原型輔酶I I（NADPH）輔助的單電子還原為自由基，然后與氧反應(yīng)形成超氧陰離子，后者能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），從而誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，可反應(yīng)脂質(zhì)過氧化損傷的嚴(yán)重程度［2］。SOD和CAT都是體內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD催化02-生成O2和H2O2，而CAT可催化H2O2分解為H2O和O2。GSH是非蛋白的巰基化合物，可清除O-、H2O2等，是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因子［3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PQ中毒大鼠腎組織中MDA含量明顯升高，而SOD、CAT、GSH等抗氧化指標(biāo)均有明顯下降，提示氧化應(yīng)激參與了PQ中毒大鼠急性腎損傷的發(fā)病過程，與以往研究［4-5］一致。趙波等［6］在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PQ中毒大鼠腎組織中PQ濃度在第14天時(shí)仍存在，而本實(shí)驗(yàn)中MDA含量在染毒后第1、第3、第7天呈持續(xù)性升高，說明PQ中毒后腎損傷的持續(xù)時(shí)間較久。

HO-1是抗氧化酶，其分解產(chǎn)物CO、膽紅素、膽綠素也有抗氧化作用。iNOS在生理狀態(tài)下腎內(nèi)少量表達(dá)，而病理狀態(tài)下，可以產(chǎn)生過量CO迅速與ROS反應(yīng)生成過氧亞硝酸陰離子（ONOO-），造成腎臟細(xì)胞損傷［7］。HO-1通過抑制iNOS轉(zhuǎn)錄及直接與iNOS的血紅素結(jié)合，減少iNOS生成，抑制ONOO-的合成。Nrf2被認(rèn)為是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵調(diào)控因子，當(dāng)受到氧化應(yīng)激或親電子試劑作用時(shí)，Nrf2 與Keapl解離，轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（anti-oxidative response element，ARE）結(jié)合后上調(diào)I I相解毒酶和抗氧化酶表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力［8］。有研究［9］發(fā)現(xiàn)，各種氧化應(yīng)激后可激活Nrf2，上調(diào)HO-1、SOD、CAT等，發(fā)揮抗氧化損傷作用。在我們以往的研究中，趙光舉等［10］在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PQ中毒后可誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生Nrf2發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，認(rèn)為是細(xì)胞自身抗氧化保護(hù)的一種代償反應(yīng)。劉瑤等［11］在PQ中毒大鼠研究中發(fā)現(xiàn)生長激素釋放肽通過上調(diào)Nrf2及其下游的抗氧化酶水平，減輕肺氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)中提示PQ染毒組Nrf2 mRNA 和Nrf2蛋白表達(dá)較正常對照組明顯升高，認(rèn)為PQ中毒后自身可誘導(dǎo)Nrf2上調(diào)，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，在染毒后第3天達(dá)高峰，第7天后下降，考慮體內(nèi)自身誘導(dǎo)出的Nrf2量不足，呈一過性應(yīng)激反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HO-1及iNOS在正常大鼠腎組織中低水平表達(dá)，在PQ中毒大鼠腎組織中HO-1明顯升高，而iNOS也被大量誘生，認(rèn)為在受到應(yīng)激時(shí)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)被激活，而在PQ染毒組第7天時(shí)，HO-1下降明顯，考慮與Nrf2水平下降及HO-1被過度消耗有關(guān)。因此Nrf2作為抗氧化應(yīng)激的調(diào)控因子，是PQ中毒急性腎氧化損傷的治療靶點(diǎn)。

圖3　各組小鼠腎組織病理學(xué)改變（×400）

姜黃素是從姜黃中分離出的一種低分子量多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等作用，且不良反應(yīng)小。近來有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對各種原因引起的急性或慢性腎功能損害均有保護(hù)作用［12］。李昱辰等［13］發(fā)現(xiàn)姜黃素通過抗氧化和清除氧自由基作用減輕順鉑引起的腎毒性。研究［14］發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠促進(jìn)細(xì)胞的Nrf2通路活化，并誘導(dǎo)下游抗氧化酶類表達(dá)，發(fā)揮對氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。Soetikno等［15］對大鼠進(jìn)行5/6腎切除手術(shù)并給予姜黃素治療中發(fā)現(xiàn)，姜黃素可上調(diào)Nrf2蛋白，增加細(xì)胞內(nèi)HO-1、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等活力，降低MDA含量，表明姜黃素可通過Nrf-2通路調(diào)控I I相解毒酶類表達(dá)，減輕腎臟損傷。本實(shí)驗(yàn)中顯示，給予姜黃素后能進(jìn)一步上調(diào)Nrf2水平，提高HO-1、SOD、CAT活力，抑制iNOS表達(dá)，提示姜黃素可能通過Nrf2途徑提高腎組織抗氧化水平，保護(hù)PQ中毒大鼠急性腎氧化損傷。

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（文本編輯：吳昔昔）

Protective effect of curcumin against acute renal oxidative injury of paraquat-induced in mice

ZHENG Dan1HAN Wenwen2HONG Guangliang3ZHAO Guangju3LI Mengfang3CAI Xiaoxia3WU Bin3LU Zhongqiu3.1.Intensive Care UnitTaizhou Hospital Affiliated to Wenzhou Medical UniversityTaizhou317000；2.Department of EmergencyNingbo Medical Treatment Center Lihuili HospitalNingbo315000； 3.Emergency Medical Centerthe First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical UniversityWenzhou325015

ObjectiveTo investigate the effect of curcumin on oxidative stress of acute renal injury in rats induced by paraquat and the mechanism underlying its effect.MethodsSixty rats were randomly divided into 4 groupscontrol group （n=15）curcumin control group （curcumin 50 mg/kg） （n=15）PQ poisoned group （2% paraquat solution 100 mg/kg） （n=15）and curcumin intervention group （intraperitoneal injection of curcumin 50 mg/kg at 15 min24 hor 48 h after paraquat exposure） （n=15）.On days l3 and 7 after the treatment and renal tissue was collected.The content of malonaldehyde （MDA） and glutathione （GSH）the activities of superoxide dismutase activity （SOD） and catalase （CAT） in the renal tissue were determined with chemical colorimetry.The activities of heme oxygenase-1 （HO-1） and inducible nitric oxide synthase （iNOS） in the renal tissue were determined with ELISA.The mRNA and protein levels of nuclear related factor 2 （Nrf2） were determined with RT-PCR and Western Blotrespectively.The pathological changes of renal tissue were examined under optical microscopy.ResultsBoth PQ group and curcumin intervention group with each time showed increase in MDA contentdecrease in GSH contentdecrease in SOD and CAT activitiesincrease in iNOS activitiesincrease in the protein and mRNA levels of Nrf2increase in HO-1 activities at day 13in comparison with the control group （P＜0.05）.In comparison with the PQ group on the same daythe curcumin intervention group showed de-crease in MDA contentincrease in the activities of GSHSODCATdecrease in iNOS activitiesand increase in the mRNA and protein levels of Nrf2 on days l3 and 7increase in HO-1 on days 13 （P＜0.05）.In the PQ groupthe clearance of glomerulus saccules was increasedarranged in disorderrenal tubular epithelial cell appeared glassy degeneration and vacuolar degeneration with time expandingbut compared with PQ groupthe pathological manifestations was relieved obviously with the same time in the curcumin intervention group.ConclusionCurcumin plays a protective role in paraquat poisoning with oxidative stress of acute renal injurywhich may depend on inducing the expression of Nrf2increasing the HO-1SOD and other antioxidant enzyme levels，and increasing the ability of resistance to oxidative stress in renal tissue.

paraquat； renal injury； nuclear related factor 2； curcumin； oxidative stress

S884.9

ADOI10.3969/j.issn.2095-9400.2016.06.001

2015-09-03

浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科計(jì)劃項(xiàng)目（2012-XK-A28）；浙江省“十二五”重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（2012-207）；浙江省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（11-CX26）。

鄭丹（1982-），女，浙江臨海人，主治醫(yī)師。

盧中秋，主任醫(yī)師，Email：lzq640815@163.com。