SCID Beige小鼠繁殖性能、臟器重量、血液生理生化指標(biāo)和免疫細(xì)胞的測定

許文靜, 郭建光, 楊東偉, 唐慧青, 符　杰, 袁水娟, 施美蓮（. 上海靈暢生物科技有限公司, 上海 04；　. 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司, 上海 065）

SCID Beige小鼠繁殖性能、臟器重量、血液生理生化指標(biāo)和免疫細(xì)胞的測定

許文靜1, 郭建光2, 楊東偉1, 唐慧青1, 符杰2, 袁水娟1, 施美蓮2
（1. 上海靈暢生物科技有限公司, 上海 201412；2. 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司, 上海 201615）

目的測定SCID Beige小鼠的繁殖性能、主要臟器重量、血液生理生化指標(biāo)和免疫細(xì)胞比例。方法（1）選取10周齡SCID Beige小鼠15雌15雄進(jìn)行配種, 測定其繁殖性能； （2）選取4周齡、8周齡和16周齡SCID Beige小鼠各30只（雌雄各半）, 稱體質(zhì)量, 依次剖取各臟器并稱重；（3）使用毛細(xì)管眼眶采血，測定血液生理生化指標(biāo)； （4）利用流式細(xì)胞儀檢測其T細(xì)胞及其亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞。結(jié)果（1）SCID Beige小鼠妊娠率、窩產(chǎn)仔數(shù)和離乳率隨胎次逐漸下降； （2）三個(gè)日齡段SCID Beige小鼠的脾臟重量隨日齡的增加而減小，其余臟器重量隨日齡的增加而增加，同日齡不同性別間肝臟和心臟重量呈顯著性差異，腦重量無顯著性差異； （3）SCID Beige小鼠112日齡雄鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血細(xì)胞壓積（HCT）、淋巴細(xì)胞（LYM）及LYM%與同日齡雌鼠和其他日齡小鼠差異明顯； （4）SCID Beige小鼠的CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD19 B細(xì)胞，B220 B細(xì)胞和NK細(xì)胞含量極低，雌鼠T細(xì)胞含量低于雄鼠，不同性別間淋巴細(xì)胞含量無顯著性差異。結(jié)論SCID Beige小鼠表現(xiàn)為T、B、NK細(xì)胞聯(lián)合免疫功能缺陷，且不存在滲漏現(xiàn)象，該小鼠在腫瘤移植的應(yīng)用方面具有一定優(yōu)勢。

SCID Beige小鼠； 繁殖性能； 臟器重量測定； 血液生理生化指標(biāo)； 免疫細(xì)胞測定

隨著生物醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，人們對實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量的要求越來越高，無菌小鼠、免疫缺陷小鼠在免疫和腫瘤研究中的作用越來越重要, SCID Beige小鼠就是其中之一。1979年，Roder等［1］研究表明, Beige小鼠的自然殺傷（NK）細(xì)胞活性缺乏； 1993年Mosier等［2］利用BALB/c-beige/beige同類近交系（congenic strain）小鼠將beige基因?qū)隒B-17SCID小鼠成為scid/scid, beige/beige小鼠（或記為SCID Beige小鼠）。該小鼠毛色白化，具備SCID小鼠的B、T淋巴細(xì)胞功能缺失，同時(shí)具備Beige小鼠典型的NK細(xì)胞功能缺陷。本文對SCID Beige小鼠的繁殖性能和臟器重量、血液生理生化指標(biāo)和部分免疫細(xì)胞指標(biāo)進(jìn)行了觀測，為利用該品系小鼠進(jìn)行相關(guān)研究提供基礎(chǔ)生物學(xué)資料。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

SCID Beige小鼠由上海靈暢生物科技有限公司提供［SCXK（滬）2013-0018］。10周齡小鼠30只（雌雄各半）用于繁殖； 隨機(jī)抽取生產(chǎn)大群中28、56和112日齡30只（雌雄各半）用于臟器重量等測定。

1.2飼養(yǎng)管理及環(huán)境

實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在硬塑薄膜隔離包內(nèi)，隔離包內(nèi)的空氣為100級全新風(fēng)，包內(nèi)溫度控制在22± 2 ℃，相對濕度55%±10%，換氣頻率20次/h；照明12 h/d； 動物自由采食和飲水。

小鼠用飼料、墊料為上海普路騰生物科技有限公司提供［滬飼證（2014）04001］, 經(jīng)60Co輻照，劑量為35 kGY，基本營養(yǎng)成分為： 粗蛋白24.5%～25.5%, 粗脂肪5.5%～6.5%, 粗灰分6.0%～6.5%，粗纖維4.0%～4.5%, 水份≤10%, 鈣1.2%～1.5%，磷0.75%～1.0%, 賴氨酸≥1.32%, 蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%。飲水為純水酸化水（pH 3.5～4.0）。飲用水、籠具、水瓶、毛巾、鑷子等物品經(jīng)121 ℃, 30 min高壓蒸汽滅菌后傳入使用。

1.3主要器材與儀器

日立7020全自動生化儀和配套試劑（日本）；Sysmex KX-21N全自動血球分析儀和配套試劑（日本）； eppendorf 5427R離心機(jī)（德國eppendorf公司）；流式細(xì)胞儀和配套試劑； Mettler toledo AL104電子稱［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司, 可讀性0.1 mg］；動物固定臺； 手術(shù)剪、眼科鑷等常規(guī)手術(shù)器械。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1繁殖性能測定選取10周齡動物15雌15雄進(jìn)行配種，記錄動物各胎次窩產(chǎn)仔數(shù)、哺乳數(shù)、離乳數(shù)、離乳率和胎間隔。

1.4.2臟器重量測定電子天平稱體質(zhì)量后眼眶采血，不少于1.5 mL，再脫頸椎處死，立即剖取脾、腎、心、肝、肺、腦、胸腺，并用濾紙吸干組織表面水分，稱取重量。

1.4.3血常規(guī)指標(biāo)測定取20 μL全血加500 μL稀釋液混勻，用Sysmex KX-21N全自動血球分析儀檢測，12項(xiàng)指標(biāo)為白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血細(xì)胞壓積（HCT）、紅細(xì)胞平均體積（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白MCH）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板（PLT）、紅細(xì)胞體積分布寬度（RDW）、血小板平均容積（MPV）、血小板體積分布寬度（PDW）、淋巴細(xì)胞（LYM）等。

1.4.4血液生化指標(biāo)測定取0.8 mL全血置離心管內(nèi)，4 ℃冰箱內(nèi)放置1 h后2 800×g離心10 min，分離出血清，進(jìn)行血液生化測定。13項(xiàng)指標(biāo)為總膽固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、血糖（GLU）、尿素氮（BUN）、鈣（Ca）、磷（P）。

1.4.5免疫功能指標(biāo)測定采用小鼠摘眼球取血法取外周血，加入EDTA抗凝劑。取流式管加入CD3、CD4、CD8、B220、NK的抗體, 按照編號分別加入采集的外周血50 μL, 避光染色15 min。加入紅細(xì)胞裂解液500 μL, 裂解5～10 min。500×g離心5 min，棄上清。加入1 mL PBS重選細(xì)胞，500×g離心5 min，棄上清。加入200 μL PBS重選細(xì)胞, 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞亞群，結(jié)果分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用軟件SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析, 數(shù)值以± s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1繁殖性能

由表1可知，SCID Beige小鼠妊娠率、窩產(chǎn)仔數(shù)和離乳率隨胎次逐漸下降。該小鼠很難生產(chǎn)第四胎。哺乳數(shù)比窩產(chǎn)仔數(shù)有一定下降，而哺乳數(shù)和離乳數(shù)相差不多。

表1　SCID Beige小鼠繁殖性能

2.2臟器重量

由表2可知，三個(gè)日齡SCID Beige小鼠的脾臟重量隨日齡的增加而減小，56日齡和112日齡與28日齡相比呈顯著性差異，但112日齡與56日齡相比無顯著性差異，其余臟器重量隨日齡的增加而增大。三個(gè)日齡SCID Beige小鼠同周齡不同性別間相比，肝臟和心臟重量呈顯著性差異，腦重量無顯著性差異。

2.3血液生理指標(biāo)

由表3可知，SCID Beige小鼠同周齡不同性別間相比，呈差異顯著的指標(biāo)數(shù)隨日齡的增大而增加。112日齡雄鼠的WBC、RBC、HGB、HCT、LYM%和LYM#指標(biāo)明顯差異于同周齡雌鼠和其他日齡小鼠。

表2　SCID Beige小鼠臟器重量　　　　　　　　　　　　　　　　　　mg

表3　SCID Beige小鼠血液生理指標(biāo)

2.4血液生化指標(biāo)

由表4可知, SCID Beige小鼠同日齡不同性別間相比，ALP指標(biāo)呈顯著性差異，AST、GLU、BUN、Ca和P指標(biāo)無顯著性差異。SCID Beige小鼠同性別28和56日齡的GLU、BUN和Ca指標(biāo)無顯著性差異。ALP和P隨著動物日齡的增加明顯下降，BUN隨動物日齡的增加呈上升趨勢。

2.5免疫細(xì)胞

由表5可知, SCID Beige小鼠的CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD19 B細(xì)胞、B220 B細(xì)胞和NK細(xì)胞含量極低。雄鼠T細(xì)胞含量略高于雌鼠。不同性別間NK細(xì)胞和淋巴細(xì)胞含量無顯著性差異。

3　討論

本文數(shù)據(jù)顯示，SCID Beige小鼠的平均窩產(chǎn)仔數(shù)、離乳率要比正常小鼠如C57BL/6J［3］和KM［4］小鼠低，其第一胎次妊娠率不到70%，胎間隔相對較長且生產(chǎn)胎次少，所以換種頻率較高，飼養(yǎng)難度和生產(chǎn)成本偏高。

體質(zhì)量和臟器重量是最基本的生物學(xué)特性，是衡量SCID Beige小鼠生長狀況的最直觀的數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，同性別SCID Beige小鼠除脾臟外所有臟器重量均隨日齡的增加而增加，脾臟則相反，56日齡和112日齡的脾臟重量小于28日齡，且同周齡不同性別間差異不顯著。脾臟是機(jī)體中最大的淋巴器官和免疫器官，脾臟內(nèi)大量的免疫細(xì)胞是其執(zhí)行免疫功能的基礎(chǔ)［5］，說明隨日齡的變化，SCID Beige小鼠的免疫功能也在發(fā)生一定變化。28日齡和56日齡不同性別間呈顯著性差異，推測同日齡不同性別間SCID Beige小鼠的免疫功能也存在一定的差異。

表4　SCID Beige小鼠血液生化指標(biāo)

表5　SCID Beige小鼠外周血免疫細(xì)胞百分比

白細(xì)胞也稱為免疫細(xì)胞（包括淋巴細(xì)胞），能吞噬異物產(chǎn)生抗體，在機(jī)體損傷治愈，抗御病原的入侵和對疾病的免疫方面起著重要的作用，白細(xì)胞減少可能反映免疫系統(tǒng)的衰弱。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，112日齡雄鼠的WBC、LYM%、LYM#均遠(yuǎn)高于其他動物，反映了其免疫系統(tǒng)出現(xiàn)了較大變化。結(jié)果顯示，隨著小鼠日齡的上升，同周齡不同性別間呈顯著性差異的指標(biāo)數(shù)增加，反映出隨日齡的增加，品系性別間差異在擴(kuò)大。ALT和AST在肝臟疾病的診斷中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，能夠反應(yīng)肝細(xì)胞的損害情況，有利于各類肝臟疾病的診斷和分析［6］，SCID Beige小鼠112日齡的ALT指標(biāo)偏高，但AST指標(biāo)不高，因此不能判定該小鼠在該日齡時(shí)存在肝臟損傷。與Charles River公司小鼠數(shù)據(jù)相比，AST數(shù)值接近，ALT和BUN數(shù)值偏低［7］。

SCID Beige小鼠是T、B、NK細(xì)胞缺陷的聯(lián)合免疫缺陷模型動物, 得到了越來越多研究者的使用。本研究采用8周齡SCID Beige小鼠外周血進(jìn)行測定, 證實(shí)了該小鼠T、B、NK細(xì)胞缺陷, 但雌性SCID Beige小鼠的CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞和CD19 B細(xì)胞的含量都低于雄性, NK 細(xì)胞含量和淋巴細(xì)胞總含量基本相同, 只有B220 B細(xì)胞含量高于雄性。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求, 研究人員可做不同的選擇。

與SCID小鼠相比，SCID Beige小鼠在某些腫瘤的移植成功率更高［8］，Beige基因突變引起的NK細(xì)胞活性降低雖不能作為影響細(xì)胞移植成功率的決定性因素，但有能夠提高受體保留移植細(xì)胞活力和功能的潛力［9］。很多研究者已經(jīng)在T細(xì)胞研究［10］、卵巢腫瘤［11］和甲狀腺素［12］研究等領(lǐng)域中對SCID Beige小鼠有了一定的應(yīng)用并取得不錯(cuò)的成果。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)SCID Beige小鼠T、B、NK細(xì)胞缺陷，且不存在滲漏現(xiàn)象，推測該小鼠在腫瘤移植的應(yīng)用方面具有一定的優(yōu)勢。

［1］胡建華, 姚明, 崔淑芳. 實(shí)驗(yàn)動物學(xué)教程［M］. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2009：551.

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Q95-33

B

1674-5817（2016）03-0129-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.010

2015-11-24

上海市科委實(shí)驗(yàn)動物研究專項(xiàng)（13140900500）

許文靜（1987-）, 女, 畜牧師, 從事免疫缺陷動物模型的繁育及生物學(xué)特性研究。E-mail： 427865428@qq.com

施美蓮（1965-）, 女, 高級畜牧師, 從事實(shí)驗(yàn)動物保種、育種、免疫缺陷動物的研究以及實(shí)驗(yàn)動物營養(yǎng)學(xué)研究。E-mail： mlshi@slaccas.com