球后靜脈注射在裸小鼠納米粒靜脈給藥中的可行性探討

楊　柳, 楊　華, 劉　云, 陳　佳, 龔明福, 舒通勝（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院放射科, 重慶400037）

球后靜脈注射在裸小鼠納米粒靜脈給藥中的可行性探討

楊柳, 楊華, 劉云, 陳佳, 龔明福, 舒通勝
（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院放射科, 重慶400037）

目的探討球后靜脈注射在裸小鼠納米粒靜脈給藥中的可行性。方法成年裸小鼠8只，隨機(jī)分成2組，每組4只，分別通過尾靜脈及球后靜脈注射超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide, SPIO）納米粒, 行裸小鼠肝臟磁共振（magnetic resonance, MR）快速自旋回波（fast spin echo, FSE） T2WI掃描, 測量同一層面、同一區(qū)域肝實(shí)質(zhì)及鄰近肌肉在增強(qiáng)前后的信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度變化率。結(jié)果8只裸小鼠全部穿刺成功。尾靜脈穿刺平均耗時(shí)8 min 30 s，平均穿刺次數(shù)為3.7次； 球后靜脈竇穿刺平均耗時(shí)約3 min 50 s，平均穿刺次數(shù)為2.3次。球后靜脈及尾靜脈兩種方法注射納米粒后肝臟的信號(hào)強(qiáng)度變化規(guī)律一致，納米粒注射后即刻、5 min、10 min、30 min、1 h及2 h的信號(hào)強(qiáng)度變化率分別為：尾靜脈注射66.78%±5.62%，72.92%±8.41%，73.08% ±7.68%，74.06%±7.44%，74.61%±6.28%，73.66%±4.52%； 球后靜脈注射： 69.29%±7.53%，74.86%±5.84%，77.54%±6.47%，78.85%±8.23%，79.05%±4.65%，77.99%±7.73%，兩者差異無顯著性（P＞0.05）。結(jié)論裸小鼠球后靜脈穿刺簡單、可靠，可以作為尾靜脈穿刺以外納米粒注射的途徑。

裸小鼠； 靜脈給藥； 納米粒； 球后靜脈

由于體型小、生長繁殖快、飼養(yǎng)管理方便，小鼠成為了哺乳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。在既往的藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，研究者采用的給藥方式包括灌胃給藥、皮下注射、腹膜腔注射和靜脈注射等。其中靜脈注射有起效快，血藥濃度高等優(yōu)點(diǎn)，成為最有效的藥物注射方式［1］。尾靜脈穿刺是靜脈給藥中最常見的方式，然而許多研究者認(rèn)為，尾靜脈穿刺技術(shù)難度大，耗時(shí)長，在需要連續(xù)、多次注藥時(shí)不太方便。尤其是對(duì)于體型較小的裸小鼠而言，難度更大。球后靜脈竇以前往往作為靜脈取血的重要路徑，球后靜脈竇穿刺用于靜脈給藥目前報(bào)道較少，特別是在靜脈推注納米粒的可行性，目前還未見報(bào)道［2］。本部分研究擬通過裸小鼠尾靜脈及球后靜脈兩種方式靜脈給注超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）納米粒，觀察動(dòng)物肝臟的增強(qiáng)效果，評(píng)價(jià)球后靜脈注射在裸小鼠納米粒靜脈給藥中的可行性，以期總結(jié)出合適的裸小鼠納米粒給藥途徑。

1　材料與方法

1.1常規(guī)平掃

成年雌性BALB/C裸小鼠8只，購于北京華阜康生物科技股份有限公司［SCXK（京）2014-0004］，隨機(jī)分成兩組，每組4只，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，采用自制的裸小鼠固定器固定。將裸小鼠俯臥位置于掃描床上（頭部先進(jìn)入），在裸小鼠于固定架之間的間隙內(nèi)輕輕放入棉球，在保暖的同時(shí)固定裸小鼠, 降低裸小鼠的呼吸運(yùn)動(dòng)。采用正交小動(dòng)物專用線圈于3.0 T磁共振（MR）掃描儀掃描行常規(guī)橫斷位平掃, 掃描序列及參數(shù)為： 軸位快速自旋回波（FSE） T2WI： 重復(fù)時(shí)間（TR）3 000 ms,回波時(shí)間（TE）65 ms, 重復(fù)次數(shù)（NEX）： 3, 層厚：2.0mm,間距0.2 mm。

1.2納米粒的靜脈注射

掃描結(jié)束后退床至定位，記錄好裸小鼠的大致位置后取出裸小鼠，采用4.5號(hào)穿刺針行尾靜脈和球后靜脈竇穿刺。尾靜脈穿刺前先用溫水浸泡鼠尾3 min，用酒精棉球擦拭尾巴，使血管擴(kuò)張，用左手食指、中指及拇指將鼠尾固定，右手持針，針尖朝下，針孔向上，從食指稍上方進(jìn)針，進(jìn)針后，沿著血管讓針頭在血管里前行一段，用回抽或逆向按揉血管可以看到回血后，用拇指固定針頭，連接預(yù)先抽有鐵濃度為45 μg/mL的SPIO懸液的1 mL注射器，緩慢注射對(duì)比劑。球后靜脈竇穿刺參考Yardeni等［2］的方法。裸小鼠取左側(cè)臥位，頭偏向右側(cè)，操作者左手拇指和食指輕輕擠壓眼圈的背側(cè)和腹側(cè)皮膚使眼球輕輕突出，右手持針，針孔面向下，針尖傾斜30°緩慢的從內(nèi)眥沿著眼球邊上進(jìn)針，直至眼底，連接1 mL注射器，輕輕回抽確定穿刺成功，然后輕輕的、緩慢的注射對(duì)比劑。注射完成，再緩慢地，輕輕地將針退出。兩種方法注射的納米?？偭烤鶠?.15 mL。

1.3增強(qiáng)掃描及數(shù)據(jù)分析

按平掃時(shí)的初始位置固定裸小鼠, 進(jìn)床至掃描位, 行肝臟連續(xù)的FSE T2WI增強(qiáng)掃描，掃描參數(shù)同平掃。掃描時(shí)間點(diǎn)分別為注藥后即刻、5 min、10 min、30 min、1 h及2 h。掃描結(jié)束后，測量同一層面、同一區(qū)域肝臟實(shí)質(zhì)部分及鄰近肌肉在增強(qiáng)前后的信號(hào)強(qiáng)度, 設(shè)感興趣區(qū)（Region of interest, ROI）為6 mm2, 并計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)化率（△SI）, △SI= SIen-SIpl）/ SIpl×100%, 其中SIpl和SIen分別為平掃和增強(qiáng)后的信號(hào)強(qiáng)度, 比較兩種方法有否差異。采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件, 計(jì)量資料以±s表示。采用兩隨機(jī)樣本均數(shù)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1穿刺情況

8只裸小鼠全部靜脈穿刺成功。從平掃結(jié)束取出裸小鼠開始計(jì)時(shí), 尾靜脈穿刺平均耗時(shí)8 min 30 s,平均穿刺次數(shù)為3.7次，最多一只裸小鼠穿刺6次才成功； 球后靜脈竇穿刺平均耗時(shí)約3 min 50 s，平均穿刺次數(shù)為2.3次，最多穿刺4次。尾靜脈穿刺次數(shù)越多，隨著鼠尾的腫脹，穿刺難度越大。尾靜脈穿刺組1只裸小鼠的尾部在反復(fù)尾靜脈穿刺后出現(xiàn)水腫, 3 d后壞死, 其余裸小鼠穿刺后連續(xù)觀察1周未出現(xiàn)明顯并發(fā)癥。

2.2注射SIPO后信號(hào)強(qiáng)度

兩種方法注射SPIO后信號(hào)強(qiáng)度變化見表1，信號(hào)強(qiáng)度變化規(guī)律一致, 注射納米粒后即刻肝臟信號(hào)急劇降低, 5 min、10 min、30 min信號(hào)降低程度逐漸放緩, 30 min、1 h和2h信號(hào)改變不明顯（圖1）。在注藥后即刻、5 min、10 min、30 min、1 h及2 h, 各時(shí)間點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度變化率分別為： 尾靜脈注射66.78%±5.62%，72.92%±8.41%，73.08%± 7.68%, 74.06%±7.44%，74.61%±6.28%, 73.66% ±4.52%； 球后靜脈注射： 69.29%±7.53%, 74.86% ±5.84%, 77.54%±6.47%, 78.85%±8.23%, 79.05% ±4.65%, 77.99%±7.73%。兩者差異無顯著性（P＞0.05）。肌肉信號(hào)在注射對(duì)比劑后即刻輕度降低,后緩慢回升, 到30 min后信號(hào)恢復(fù)到增強(qiáng)前。

表1　球后靜脈注射和尾靜脈注射兩種方法注射SPIO后肝臟信號(hào)強(qiáng)度變化

3　討論

裸小鼠自身免疫系統(tǒng)存在缺陷，成為構(gòu)建人腫瘤動(dòng)物移植瘤模型的最佳選擇，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)理，腫瘤藥物研發(fā)等領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用［3］。在既往的裸小鼠移植瘤的藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，研究者采用的給藥方式包括灌胃給藥、皮下注射、腹膜腔注射和尾靜脈注射等。其中尾靜脈注射有起效快，血藥濃度高等優(yōu)點(diǎn)，成為被廣泛采用的給藥方式。然而，裸小鼠尾靜脈較細(xì)小，對(duì)一般實(shí)驗(yàn)人員來說穿刺難度較大，往往導(dǎo)致靜脈穿刺失敗。此外，為了提高尾靜脈穿刺的成功率，操作者往往需要將裸小鼠進(jìn)行制動(dòng)，并需要用紅外燈照射或采用熱水浸泡鼠尾的方法使外周鼠尾靜脈擴(kuò)張，給穿刺操作帶來了不必要的額外操作［3］。球后靜脈竇是由眶上靜脈、下眼瞼靜脈、鼻背靜脈和顳淺靜脈等匯聚成的靜脈池，相對(duì)尾靜脈，球后靜脈竇更粗，穿刺注藥操作更簡單，對(duì)操作者的技術(shù)熟練程度要求較低，近年來受到越來越多普通實(shí)驗(yàn)人員的親睞。目前已有研究證明，球后靜脈竇穿刺注射的方法在進(jìn)行骨髓移植、白血病誘導(dǎo)、靜脈輸注實(shí)驗(yàn)用混合物、以及基因治療時(shí)實(shí)用、可靠［4, 5］。然而，關(guān)于這個(gè)方法用于靜脈給藥目前報(bào)道較少，特別是在靜脈推注納米粒對(duì)增強(qiáng)效果的影響，目前還未見報(bào)道?；谝陨弦蛩兀狙芯刻接懥送ㄟ^球后靜脈竇和尾靜脈注射納米粒進(jìn)行MR增強(qiáng)掃描的可行性和其對(duì)增強(qiáng)效果的影響。研究結(jié)果表明，相對(duì)于尾靜脈，通過球后靜脈竇注射SPIO的方法簡單、高效、成功率高，且具有很高的重復(fù)率。球后靜脈竇給藥組未見任何并發(fā)癥，而尾靜脈給藥組出現(xiàn)了腫脹、壞死的情況。測量不同方法給藥后肝臟的信號(hào)強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)兩者的變化規(guī)律一致，在注藥后即刻、5 min、10 min、30 min、1 h及2 h，各時(shí)間點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度變化率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1　球后靜脈注射SPIO后肝臟MR圖像

在實(shí)際操作中，作者體會(huì)到球后靜脈注藥時(shí)阻力較小，即便如此，注藥速度仍不能太快，據(jù)報(bào)道［6］，過高的球后注射壓力可以使藥物滲透到球后周圍間隙。關(guān)于注藥總量，有研究者報(bào)道［7］在成年小鼠注藥量可達(dá)到200～300 μL, 也有學(xué)者［2］提出小鼠注藥量不能超過150 μL, 因?yàn)閷?duì)于體質(zhì)量 30 g的小鼠，其體內(nèi)的血液總量大約2.2 mL（占體質(zhì)量的7.2%），即使是緩慢注射總量為200～300 μL對(duì)比劑，也會(huì)引起短暫血管超負(fù)荷。在本實(shí)驗(yàn)中，裸小鼠體質(zhì)量約15 g，通過緩慢推注對(duì)比劑150 μL后，部分裸小鼠的確出現(xiàn)呼吸急促的癥狀，但所有裸小鼠最終都能從麻醉中自然蘇醒。鑒于此，作者認(rèn)為，裸小鼠常規(guī)注藥量應(yīng)控制在100 μL左右，如實(shí)驗(yàn)確需更大劑量，應(yīng)緩慢、分節(jié)注射，而不能連續(xù)快速注射，且總量不能超過150 μL。

靜脈注射納米粒以后，納米粒很快被血漿蛋白調(diào)理而被清除，主要被肝臟和脾臟吸收，少量被肺、腎、心臟和腦吸收［8,9］。分子影像是目前評(píng)估納米粒的藥代動(dòng)力學(xué)的最直觀、可行方法，通過肝臟磁共振信號(hào)改變來判斷納米粒的在體內(nèi)的循環(huán)是觀察磁性納米粒在體內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)的重要方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝臟信號(hào)的變化規(guī)律與文獻(xiàn)報(bào)道的納米粒的藥代動(dòng)力學(xué)一致［10］，表明兩種靜脈途徑給藥均是有效的。球后靜脈注射信號(hào)強(qiáng)度變化率較尾靜脈注射更大，這可能與球后靜脈相對(duì)尾靜脈更粗, 對(duì)比劑通過更順暢有關(guān)。說明兩種方法均可用于納米粒的注射，但球后靜脈注射更流暢。

即便球后靜脈竇穿刺注藥操作簡單，注藥可靠，對(duì)操作者的技術(shù)熟練程度要求較低，但對(duì)于新手而言，在正式實(shí)驗(yàn)之前，仍需在終末期麻醉小鼠上進(jìn)行反復(fù)的穿刺試驗(yàn)。此外，作者體會(huì)到球后靜脈給藥的過程中，動(dòng)物不免會(huì)發(fā)生位置的移動(dòng)，這對(duì)于需要注藥前后同一位置準(zhǔn)確對(duì)比的實(shí)驗(yàn)來說定位要求更高?？傊瑢?duì)于尾靜脈穿刺尚不十分熟練的操作員來說，球后靜脈穿刺是一種重要的補(bǔ)充方法，尤其對(duì)于納米粒的注射，球后靜脈路徑或可作為首選路徑。

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Feasibility Study on Intravenous Administration of Nanoparticles via Retrobulbar Vein in Nude Mice

YANG Liu, YANG Hua, LIU Yun, CHEN Jia, GONG Ming-fu, SHU Tong-sheng
（Department of Radiology， Xinqiao Hospital， Third Military Medical University， Chongqing 400037， China）

ObjectiveTo explore the feasibility of retrobulbar vein injection of nanoparticles in nude mice. MethodsEight healthy adult nude mice were randomly divided into two groups with four in each group. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles （SPIO） were intravenously injected via tail vein and retrobulbar vein, respectively. Magnetic resonance （MR） FSE T2WI were performed on liver of nude mice. The signal intensity （SI） of the liver and adjacent muscles were measured, and the change rate of SI were calculated. ResultsAll the 8 nude mice were punctured successfully. It took an average of 8 minutes30 seconds and 3.7 times for tail vein puncture, which was larger than that of retrobulbar vein puncture which took an average of 3 minutes 50 seconds and 2.3 times. The liver SI enhancement is consistent between retrobulbar vein injection and tail vein injection. The SI change rate at 0 minute, 5 minute, 10 minute, 30 minute, 1 hour and 2 hour were 66.78%±5.62%, 72.92%±8.41%, 73.08% ±7.68%, 74.06%±7.44%, 74.61%±6.28%, 73.66%±4.52% respectively in tail vein injection and 69.29%±7.53%, 74.86%±5.84%, 77.54%±6.47%, 78.85%±8.23%, 79.05%±4.65%, 77.99%±7.73% respectively in retrobulbar vein injection. The difference was not statistically significant （P＞0.05）. ConclusionThe intravenous administration of nanoparticles via retrobulbar vein is simpler andefficient, it may be used as a method apart from the tail vein injection .

Nude mice； Intravenous administration； Nanoparticles； Retrobulbar vein

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0117-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.007

2015-09-16

國家自然科學(xué)基金（ 81501521）； 重慶市前沿與應(yīng)用基礎(chǔ)研究一般項(xiàng)目（cstc2015jcyjA1338）

楊柳（1981-）, 女, 主治醫(yī)師, 主要從事分子影像學(xué)研究。E-mail： 13527547568@163.com

龔明福, 博士。E-mail： yanghua780819@163.com