莖點(diǎn)霉生物學(xué)特性研究

楊玲玉，王穎，程穎慧，高瑞芳，許青，何邦令*，劉會(huì)香*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安2710002.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東深圳5180453.濟(jì)寧市兗州區(qū)林業(yè)局，山東兗州272100

莖點(diǎn)霉生物學(xué)特性研究

楊玲玉1，王穎2，程穎慧2，高瑞芳2，許青3，何邦令1*，劉會(huì)香1*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安271000
2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東深圳518045
3.濟(jì)寧市兗州區(qū)林業(yè)局，山東兗州272100

莖點(diǎn)霉（Phoma spp.）是農(nóng)作物和其他經(jīng)濟(jì)作物的重要病原菌，寄主范圍廣泛，引起植株葉斑、葉枯、莖枯、褐斑、枯斑等癥狀，其中部分種是檢疫性植物病原菌。本文對莖點(diǎn)霉的12個(gè)種21個(gè)菌株的培養(yǎng)性狀及分生孢子器特征進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)莖點(diǎn)霉菌株在生長速度、產(chǎn)孢等方面有顯著差異，其中檢疫性豌豆腳腐病菌（Phoma pinodella）種內(nèi)菌落形態(tài)也有較大差異。大部分莖點(diǎn)霉菌株在燕麥培養(yǎng)基上明顯地促進(jìn)孢子產(chǎn)生；在PDA培養(yǎng)基上變溫處理培養(yǎng)30 d，能夠促進(jìn)豌豆腳腐病菌菌株產(chǎn)孢；單一的劃破菌落法對所有菌株產(chǎn)孢沒有影響?？诎稒z疫時(shí)不能只依據(jù)形態(tài)學(xué)特征區(qū)分檢疫性莖點(diǎn)霉，應(yīng)結(jié)合其他分子手段綜合鑒定。

莖點(diǎn)霉屬；培養(yǎng)性狀；分生孢子器；生物學(xué)特性

檢疫性莖點(diǎn)霉（Phoma spp.）是農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物的重要病原菌，寄主范圍極為廣泛，危害豆科、十字花科、茄科等幾十屬上百種植物，可引起植株葉斑、葉枯、莖枯、褐斑、枯斑等癥狀［1，2］，輕則導(dǎo)致產(chǎn)量下降品質(zhì)變劣，重則導(dǎo)致植物死亡［3］。2009年，上海出入境檢驗(yàn)檢疫局從來自澳大利亞的油菜籽樣品中截獲了油菜莖基潰瘍病菌（Leptosphaeria maculans）［4］；2012年，寧波檢驗(yàn)檢疫局從來自意大利的蘋果種苗中首次檢出葡萄莖枯病菌（Phoma glomerata）［5］，2013年上?？诎兑矎倪M(jìn)口大豆中檢驗(yàn)到該病菌［6］。上述檢疫性Phoma病菌目前在國內(nèi)尚無分布，而我國每年從別國進(jìn)口大量農(nóng)副產(chǎn)品，Phoma病菌傳入的風(fēng)險(xiǎn)不斷加劇。因此，掌握檢疫性Phoma病菌的生物學(xué)特性，并進(jìn)行科學(xué)識(shí)別和鑒定，對進(jìn)境農(nóng)副產(chǎn)品上Phoma病菌的檢驗(yàn)檢疫顯得尤為重要。本文以我國口岸獲取和來自荷蘭微生物菌種保藏中心（CBS）的檢疫性Phoma屬真菌豌豆腳腐病菌（P.pinodella）、葡萄莖枯病菌（P.glomerata）、大蔥抗粉根病菌（P.terrestris）、維管束莖點(diǎn)霉（P.tracheiphila）、油菜莖基潰瘍病菌（P.lingam）和非檢疫性Phoma屬真菌多喙莖點(diǎn)霉（P.multirostrata）、熱帶莖點(diǎn)霉（P.tropica）、豌豆莖點(diǎn)霉（P.pinodes）、苜蓿莖點(diǎn)霉（P.medicaginis var.medicaginis）等1 2個(gè)種共21個(gè)菌株為試驗(yàn)菌株，研究了病菌的培養(yǎng)學(xué)特性、子實(shí)體形成所需的營養(yǎng)條件、子實(shí)體的形態(tài)特征及病菌生長等方面的生物學(xué)特性，研究結(jié)果對于科學(xué)檢測和預(yù)警口岸檢疫性Phoma病菌的入侵具有重要指導(dǎo)意義。

1　材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試菌株共計(jì)12個(gè)種21個(gè)菌株，見表1。

表1　本研究供試菌株Table 1 Isolatesof Phoma spp.in this study

1.1.2培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）進(jìn)行菌株培養(yǎng)。PDA培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基（OA）和松針培養(yǎng)基進(jìn)行菌株促產(chǎn)孢培養(yǎng)。

1.2菌株培養(yǎng)學(xué)及生長特性研究

選取培養(yǎng)5 d的供試Phoma菌株，挑取相同菌齡菌餅（d=5mm）接種于PDA培養(yǎng)基中央，于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5～7 d。觀察菌株的培養(yǎng)學(xué)特性，描述菌落特征；采用十字交叉法測定菌落生長情況。試驗(yàn)重復(fù)3次，比較不同菌株生長速率。

1.3菌株促產(chǎn)孢培養(yǎng)

選用PDA、OA和松針三種通用培養(yǎng)基、變溫處理、劃碎菌落三種不同處理方式，研究對Phoma真菌產(chǎn)孢的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1Phoma菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征

通過對12個(gè)種21個(gè)Phoma菌落觀察表明，不同種及同種不同菌株的菌落表現(xiàn)豐富的多樣性。

豌豆莖點(diǎn)霉（Phoma pinodes）共兩個(gè)菌株CBS285.49和CBS235.55。菌落生長均緩慢，白色、棕黃色，輻射狀，致密。生長后期兩者差異較大。CBS285.49菌落白色棉絮狀，中央突起，形狀不規(guī)則圓形，氣生菌絲發(fā)達(dá)，隨著生長漸變?yōu)榈厣蜃攸S色。CBS235.55菌落輪紋明顯且呈深淺交替，中央棕色，突起，圓形，白色，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，有少量絨毛狀菌絲。

豌豆腳腐病菌（Phoma pinodella）共三個(gè)菌株CBS567.97、CBS100.580和2013PC69。其菌落均致密，規(guī)則圓形，無氣生菌絲或氣生菌絲不發(fā)達(dá)，不同培養(yǎng)批次菌落特征不穩(wěn)定，偶會(huì)從中間形成放射狀溝。CBS567.97菌落初期呈粉色絨毛狀，中部紅棕色，邊緣棕色，隨著生長顏色逐漸變深，出現(xiàn)明顯深淺交替。CBS100.580菌落中間呈深棕色，邊緣顏色淺；背面中部黑色，邊緣棕色及棕黃色。匍匐生長，中部突起，凸起處菌絲棉絮狀，后期菌絲間產(chǎn)生致密的黑色小點(diǎn)。2013PC69菌落棕色、墨綠色，放射狀，邊緣白色，后期表面出現(xiàn)白色菌絲團(tuán)，中部少量墨綠色氣生菌絲摻雜有白色氣生菌絲。該菌株形態(tài)變異大，部分中央有溝壑狀凹溝。

圖1　檢疫性Phoma菌株及非檢疫性菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征（7 d）Fig.1Quarantine Phoma and unquarantine isolates colony characterson PDA culturemedium（7 d）

葡萄莖枯病菌（Phoma glomerata）共五個(gè)菌株CBS287.76、CBS293.36、2015SOU03、2015SOU26 和2015SOU49。其初期菌落邊緣菌絲均為白色，后期表現(xiàn)為不同程度的棕色，中部顏色較四周深。氣生菌絲不發(fā)達(dá)、平伏、致密，生長速度快，邊緣規(guī)則圓形，易產(chǎn)生致密的輪紋狀排列的分生孢子器。后期CBS287.76、CBS293.36菌落表面可溢出淺玫瑰紅色油滴狀的孢子堆。

熱帶莖點(diǎn)霉（Phoma tropica）（菌株3.9385）菌落邊緣白色，中間墨綠色，致密，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，菌落圓形，表面絨毛狀，偶有淺色扇形區(qū)域。

大蔥抗粉根病菌（Phoma terrestris）（菌株ATCC36564）菌落邊緣淡黃色，中間紅棕色，圓形，氣生菌絲較少，匍匐向基內(nèi)生長，致密，生長緩慢。生長后期，菌落背面深紅色，中部顏色深，易形成不規(guī)則的淺紫紅色塊狀斑和圓點(diǎn)特征。

維管束莖點(diǎn)霉（Phoma tracheiphila）（菌株ATCC38206）菌落棕色，邊緣整齊，生長緩慢，平伏，無氣生菌絲，表面呈油脂狀，光滑，菌落內(nèi)部有不規(guī)則的深紅色小點(diǎn)，后期為紅棕色，背面中部為深棕色，周圍淺棕色，內(nèi)有不規(guī)則深色小點(diǎn)。

苜蓿莖點(diǎn)霉（Phomamedicaginis var.medicaginis）（菌株ACU01-1）菌落淺黃色，生長較慢，絨毛狀，邊緣不整齊，后期中央灰色，邊緣黑色，致密，輻射狀，氣生菌絲較發(fā)達(dá)。

多喙莖點(diǎn)霉（Phomamultirostrata）（菌株3.7936）菌落中部白色，四周乳黃色，后期顏色逐漸變深，呈乳黃色，中部略突起，致密，平伏，絨毛狀，邊緣規(guī)則圓形，無氣生菌絲，常有規(guī)則輻射狀或不規(guī)則溝壑，后期易產(chǎn)生乳黃色分生孢子器。

Phoma sp.（菌株P(guān)77、2012PC37和SC74）三菌株菌落特征差異大，其中P77菌落初為淡黃色，后為灰褐色，夾雜白色菌絲，致密，生長緩慢，邊緣呈絨毛輻射狀，背面黃色；2012PC37菌落淺黃色，邊緣匍匐狀、不規(guī)則，生長慢，中央突起，后期背面易產(chǎn)生少量小黑點(diǎn)；SC74菌落紅棕色，中部突起，氣生菌絲發(fā)達(dá)，絮狀，致密，邊緣不整齊，出現(xiàn)粉色環(huán)帶。背面紅棕色，且深淺顏色交替，呈輪紋狀。

油菜莖基潰瘍病菌（Phoma lingam）共三個(gè)菌株CBS275.63、CBS260.94和CBS147.24。菌株間差異性較小，邊緣規(guī)則圓形，放射狀，生長速度快。CBS275.63和CBS260.94菌落白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)、茂密、棉絮狀，中部凸起。CBS275.63后期出現(xiàn)大量輪紋狀排列的黑色分生孢子器。CBS260.94中部不規(guī)則凸起，隨著生長顏色變深，凸起變高，周圍形成凹環(huán)。CBS147.24與上述菌株差異大，淡黃色，菌絲匍匐，氣生菌絲少，具少量絨毛，基內(nèi)生長。

比較熱帶莖點(diǎn)霉（Phoma tropica）（3.9385）和豌豆腳腐病菌（P.pinodella）（2013PC69），其菌落中部均為墨綠色、圓形、氣生菌絲茂盛，但前者邊緣白色，顏色略淺，易產(chǎn)孢，后者邊緣無色透明，不易產(chǎn)孢。其它兩個(gè)豌豆腳腐病菌（CBS567.97、CBS100.580）菌株形態(tài)特征各不同，生長速度快，不同批次培養(yǎng)菌落特征不穩(wěn)定；比較油菜莖基潰瘍病菌（P.lingam）（CBS275.63、CBS260.94、CBS147.24）和多喙莖點(diǎn)霉（3.7936），前者菌落呈白色或淡黃色，表面平整，而多喙莖點(diǎn)霉菌落白色，表面有溝壑狀凹陷。

2.2不同菌株的生長特性測定

圖2　不同Phoma菌株的生長速度Fig.2Grow th ratesof different Phoma spp.isolates

圖2表明，在PDA培養(yǎng)基上，供試菌株種間菌絲生長速度差異很大，但種內(nèi)生長差異不大。豌豆莖點(diǎn)霉、維管束莖點(diǎn)霉、苜蓿莖點(diǎn)霉生長速度慢。豌豆腳腐病菌、葡萄莖枯病菌生長速度快。油菜莖基潰瘍病菌種內(nèi)菌株生長速度差異大。

2.3Phoma不同菌株的子實(shí)體特征

2.3.1不同培養(yǎng)基對菌株產(chǎn)孢的影燕麥培養(yǎng)基能夠促進(jìn)Phoma產(chǎn)孢，對P.medicaginis var.medicaginis （ACU01-1）、Phoma sp.（P77、SC74）菌株促進(jìn)效果明顯。松針培養(yǎng)基對Phoma菌株促產(chǎn)孢效果不明顯。其他菌株不產(chǎn)孢，需進(jìn)一步摸索它們的產(chǎn)孢條件。

表2　供試產(chǎn)孢菌株子實(shí)體特征Table 2 The fruiting body characteristics of produced spore isolates

2.3.2不同培養(yǎng)方式對產(chǎn)孢的影響逆境生長條件能促進(jìn)部分豌豆腳腐病菌產(chǎn)孢，但時(shí)間較長，一般為一月以上。CBS567.97、CBS100.580菌株在PDA上培養(yǎng)15～20 d后，培養(yǎng)皿背面會(huì)產(chǎn)生大量暗色小點(diǎn)，此時(shí)再移入4℃，逆境刺激30 d后會(huì)產(chǎn)生大量分生孢子（100倍物鏡下）。劃碎菌落對所有供試Phoma菌株產(chǎn)孢沒有明顯效果。

2.3.3部分供試Phoma菌株分生孢子器、分生孢子形態(tài)供試Phoma菌株的分生孢子器壁薄，無乳突，球形、半球形、橢圓形、近球形、不規(guī)則形，褐色或黑色（SC74呈棕紅、棕黃色），部分葡萄莖枯病菌孢子器邊緣顏色深，單生或聚生，生于基質(zhì)表面，多數(shù)器壁外面由交織的疏松菌絲包圍。分生孢子梗短。分生孢子為單孢、透明、球形、卵形、橢圓形或桿狀。孢子有1～2個(gè)油球或無，P.glomerata （2015SOU03、2015SOU26、2015SOU49）和Phoma sp.（2012PC37、P77）孢子形狀差別大，橢圓形、梨形或桿狀，無色或淺綠色。

圖3　不同菌株的分生孢子器特征（a）Phoma tropica；（b）P.multirostrata（OA）；（c）P.medicaginis var.medicaginis（松針）；（d-e）Phoma.sp.（f-j）；P.glomerata的分生孢子器Fig.3Pycnidia characteristicsof different isolates （a）Phoma tropica（b）P.multirostrata（OA）（c）P.medicaginis var.medicaginis（Pine needles）（d-e）Phoma sp.（f-j）P.glomerata of pycnidia

圖4　不同菌株的分生孢子特征（A）P.Multirostrata；（B）P.medicaginis var.medicaginis；（C）P.glomerata（CBS287.76、CBS293.36）Phoma tropica；（D）Phoma sp.（SC74）；（E）P. glomerata（2015SOU03、2015SOU26、2015SOU49）Phoma sp.（2012PC37、P77）的分生孢子Fig.4Conidial characteristicsof different isolates （A）P.multirostrata；（B）P.medicaginis var.Medicaginis；（C）P.glomerata（CBS287.76，CBS293.36），Phoma tropica；（D）Phoma sp.（SC74）；（E）P. glomerata（2015SOU03，2015SOU26，2015SOU49），Phoma sp.（2012PC37，P77）

3　討論

莖點(diǎn)霉屬的多種病菌被中國、美國、歐盟、加拿大、日本等多國列為檢疫對象。我國在2007年頒布的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中，就包括了莖點(diǎn)霉屬的Phoma pinodella （L.K.Jones）Morgan-Jones&K.B.Burch、P.glomerata（Corda）Wollenweber et Hochapfel、P.exigua desmazières f.sp.foveata（Foister）Boerema、P.tracheiphila（Petri）L.A.Kantsch.et Gikaschvili、Leptosphaeriamaculans（Desm.）Ces.etDe Not.（無性階段為P.lingam）等。除了危害農(nóng)作物，有些Phoma的種還可危害動(dòng)物，甚至人類［7，8］。

莖點(diǎn)霉屬部分真菌在我國屬于檢疫性病菌，尚無危害報(bào)道，其研究較少，但部分種在國外已造成嚴(yán)重危害。本文通過對其生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，Phoma菌株生物學(xué)表現(xiàn)豐富的多樣性，如豌豆腳腐病菌。有些種間菌落形態(tài)相似，如P.tropica和P.pinodella。對于這些菌株，口岸檢疫不能單一依據(jù)形態(tài)學(xué)進(jìn)行區(qū)分，應(yīng)結(jié)合其他分子手段。上述檢疫性Phoma菌株生物學(xué)特性的研究，有助于對口岸進(jìn)境的各類植物及其產(chǎn)品上此類病原菌的鑒定，這對預(yù)防檢疫性Phoma真菌隨進(jìn)境植物及其產(chǎn)品傳入我國，保護(hù)我國種植業(yè)的安全生產(chǎn)具有重要意義。

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Study on Biological Characteristics of Phoma spp.

YANG Ling-yu1，WANGYing2，CHENGYing-hui2，GAO Rui-fang2，XU Qing3，HEBang-ling1*，LIU Hui-xiang1*
1.College ofPlantProtection/Shandong Agricultural University，Taian 271018，China
2.Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen 518045，China
3.Forestry Bureau ofYanzhou District，Jining City，Yanzhou，272100，China

Phoma spp.are important pathogens of crop and other econom ic crop，whose host ranges are extensive and they cause the leaf spots，leaf and stem blights，brown spot symptoms.This paper mainly studied the culture and pycnidia characters on 12 quarantine Phoma spp.of 21 related isolates.The result showed that the tested Phoma isolates had significant differences in grow ing speeds and spores production.P.pinodella among isolates was quite different in colony morphology；most of Phoma strains could obviously promote spores production on the oatmedium.P.pinodella could also produce spores in 30 days on sustainable variable temperature on PDAmedium condition.In addition，themethod of simple cutting colony had no effect on all the tested Phoma isolates spore production.Comprehensive identification of the Phoma spp in portquarantine could notonly depend onmorphological charactersbutshould combinewith othermethod.

Phoma spp.；culture characters；pycnidia；biological characteristics

S412

A

1000-2324（2016）04-0501-05

2016-03-9

2016-05-03

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014IK008）

楊玲玉（1990-），女，山東青島人，碩士研究生.E-mail：y928093706y@163.com

Author for correspondence.E-mail：hebangling@126.com；hxliu722@126.com