離子液體在無(wú)抗奶檢測(cè)中的應(yīng)用

周鑫魁洪　霞錢(qián)瀅文鄧麗娟王杰斌高志瑩何海寧劉　琦

(1. 甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅 蘭州　730010；2. 甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司，甘肅 蘭州　730010)

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離子液體在無(wú)抗奶檢測(cè)中的應(yīng)用

周鑫魁1,2洪霞1,2錢(qián)瀅文1,2鄧麗娟1,2王杰斌1,2高志瑩1,2何海寧1,2劉琦1,2

(1. 甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅 蘭州730010；2. 甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司，甘肅 蘭州730010)

采用復(fù)分解方法合成疏水性離子液體1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽[(C8MIM)(PF6)]，用活性炭和大孔樹(shù)脂固相萃取小柱凈化該離子液體，得到無(wú)色透明的[(C8MIM)(PF6)]，產(chǎn)率87.6%。利用該離子液體萃取乳及乳制品中的青霉素及其酶解產(chǎn)物青霉素噻唑酸，并優(yōu)化萃取條件。通過(guò)自建的高效液相色譜方法檢測(cè)青霉素及青霉素噻唑酸的含量，間接判斷乳及乳制品中是否為真正的“無(wú)抗奶”。離子液體萃取方法青霉素回收率為87.4%～92.6%，RSD為1.8%，檢出限5 ng/mL；青霉素噻唑酸回收率為83.5%～90.8%，RSD為2.4%，檢出限5 ng/mL，通過(guò)與杯碟法和液相質(zhì)譜法作比較，更說(shuō)明了該方法的優(yōu)越性。

離子液體；β-內(nèi)酰胺酶；青霉素；青霉素噻唑酸；高效液相色譜；乳及乳制品

青霉素作為一種高效、廉價(jià)的抗生素，是禽畜飼養(yǎng)治療、抵抗炎癥首選的藥物?？股貫E用的危害在于加劇細(xì)菌耐藥性，正成為目前全球最迫切的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。如何嚴(yán)格控制、合理使用抗生素必須引起全社會(huì)的重視。在乳及乳制品的生產(chǎn)過(guò)程中，不法企業(yè)為了避免檢查出過(guò)量使用青霉素，人為地使用β-內(nèi)酰胺酶去降解牛乳中殘留的青霉素，使青霉素酶解生成青霉素噻唑酸，生產(chǎn)人造“無(wú)抗奶”。所以判斷產(chǎn)品是否為真正的“無(wú)抗奶”，需要同時(shí)檢測(cè)青霉素和β-內(nèi)酰胺酶是否殘留。目前檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的方法有微生物法，該方法靈敏度高，檢出限低，但是重復(fù)性不好，檢測(cè)周期過(guò)長(zhǎng)[1]；碘量法操作簡(jiǎn)便、快捷，為實(shí)驗(yàn)室普遍使用，但是對(duì)反應(yīng)時(shí)間要求嚴(yán)格，靈敏度和重現(xiàn)性不好[2-4]；酶聯(lián)免疫法[5-6]快速、高效，但是成本太高。高效液相色譜法具有高性能的檢測(cè)設(shè)備和先進(jìn)的操作控制系統(tǒng)，自動(dòng)化程度高、結(jié)果重復(fù)性好，但在檢測(cè)基質(zhì)復(fù)雜的乳及乳制品時(shí)，需要對(duì)樣品進(jìn)行比較繁瑣的前處理工作，而且處理過(guò)程一般為稀釋樣品，所以靈敏度不高[7-8][9]31-38[10-11]；液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法所需儀器價(jià)格昂貴[12]。因此建立一種簡(jiǎn)單，快捷，靈敏度高的乳及乳制品的前處理方法是很有必要的。

離子液體在室溫或近于室溫情況下是由有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)陰離子組成的熔融鹽體系構(gòu)成。由于離子液體獨(dú)特的性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用在富集、分離、合成、催化、電化學(xué)等方面[13-16]。其中烷基咪唑類(lèi)離子液體常被用于萃取和富集水溶液中的苯及苯的衍生物等[17]。并且烷基咪唑類(lèi)離子液體與液相色譜柱及其流動(dòng)相有很好的兼容性，可以作為樣品溶劑進(jìn)入液相色譜儀[18]12-17。

但如何將離子液體應(yīng)用到“無(wú)抗奶”的檢測(cè)中，同時(shí)檢測(cè)青霉素及其酶解產(chǎn)物青霉素噻唑酸卻很少有研究。趙洪秋[18]22-23利用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，液—液微萃取的形式，萃取并檢測(cè)牛乳中青霉素的含量，得到較好的效果。但對(duì)于添加β-內(nèi)酰胺酶，將青霉素分解為青霉素噻唑酸的人造“無(wú)抗奶”并沒(méi)有加以研究。而且1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽的色譜行為與目標(biāo)物近似，所以在趙洪秋色譜圖中，目標(biāo)物周?chē)s質(zhì)較多。根據(jù)對(duì)“無(wú)抗奶”的檢測(cè)需求，合成并凈化得到無(wú)色透明的離子液體1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽。該離子液體疏水性更強(qiáng)，極性更弱。本身的色譜行為不影響目標(biāo)物出峰。將[(C8MIM)(PF6)]液—液分散萃取技術(shù)應(yīng)用在乳及乳制品中青霉素及青霉素噻唑酸的檢測(cè)試驗(yàn)中，可以提高離子液體對(duì)目標(biāo)物的富集程度，增加回收率。同時(shí)快速地對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行凈化、萃取、濃縮。從而使樣品前處理更快捷，檢測(cè)結(jié)果更穩(wěn)定，方法檢出限更低，靈敏度更高。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

N-甲基咪唑：分析純，阿拉丁試劑上海有限公司；

1-氯正辛烷：優(yōu)級(jí)純，上海麥克林生化科技有限公司；

六氟磷酸鉀：分析純，阿拉丁試劑上海有限公司；

青霉素標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品(97.5%)，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；

β-內(nèi)酰胺酶：分析純(500 U/mL)，阿拉丁試劑上海有限公司；

甲醇：色譜純，北京百靈威科技有限公司。

大孔樹(shù)脂固相萃取柱：4 g，12 mL，迪馬科技有限公司；

牛奶陰性樣品：蘭州莊園乳業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2儀器與設(shè)備

液相色譜儀：安捷倫1260型，配二級(jí)管陣列檢測(cè)器，安捷倫科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

離心機(jī)：RX-II型，天美中國(guó)科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1離子液體合成根據(jù)文獻(xiàn)[13]修改如下：1-辛基-3-甲基咪唑氯化鹽的合成([C8MIM]Cl)：稱(chēng)取0.25 mol(20.53 g)N-甲基咪唑和0.258 mol(23.88 g)1-氯正丁烷于100 mL燒瓶中，加熱回流24 h，用熱乙酸乙酯多次洗滌反應(yīng)后的液體，棄去乙酸乙酯，70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到淡黃色粘稠液體，備用；1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽的合成([C8MIM][PF6])：稱(chēng)取1-辛基-3-甲基咪唑氯化鹽35 g溶于200 mL蒸餾水中，加入六氟磷酸鉀47 g，攪拌1 h，分為兩層，棄去上層后，用蒸餾水反復(fù)洗滌除去氯離子，在洗滌過(guò)離子液體的水中滴加0.1 mol/L的硝酸銀溶液，直到不產(chǎn)生白色沉淀，證明氯離子洗滌干凈。70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除水分，得到淡黃色粘稠液體。將該液體溶于200 mL色譜純甲醇中，加入10 g活性炭脫色。取上清液過(guò)大孔樹(shù)脂固相萃取柱，接收全部流出液，70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除多余溶劑。得到無(wú)色透明粘稠液體，備用。

1.3.2試劑配制稱(chēng)取青霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用0.05 mol/L pH 3.5乙酸銨溶解定容至10 mL，得到1 mg/mL青霉素溶液。使用時(shí)用0.05 mol/L pH 3.5的乙酸銨逐級(jí)稀釋至適當(dāng)濃度。秤取青霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用0.05 mol/L pH 6.0的乙酸銨溶解，加入1 mL 500 U/mL的β-內(nèi)酰胺酶，37 ℃恒溫酶解30 min。得到青霉素噻唑酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)，用0.05 mol/L pH 3.5的乙酸銨逐級(jí)稀釋至適當(dāng)濃度。

1.3.3樣品前處理稱(chēng)取10.00 g牛奶樣品于離心管中，加入0.05 mol/L pH 3.5乙酸銨溶液30 mL，渦旋、超聲后，分別加入106 g/L亞鐵氰化鉀溶液和220 g/L乙酸鋅溶液各5 mL，渦旋震蕩，使其混合均勻后，于4 ℃，10 000 r/min離心5 min，取全部上清液置于另一支離心管中，分別加入1 mL離子液體和5 g氯化鈉，劇烈搖動(dòng)2 min，使離子液體與上清液形成乳濁液，4 ℃，10 000 r/min離心5 min，目標(biāo)物被離子液體萃取留在下層，取下層清液過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。

1.3.4色譜條件為使青霉素與青霉素噻唑酸能良好分離，并且離子液體出峰不影響目標(biāo)物色譜峰。目標(biāo)物在流動(dòng)相pH范圍內(nèi)只有單一化合物形態(tài)。固自行建立色譜方法，色譜柱：C184.6 μm×150 mm分析柱；流動(dòng)相：pH 3.5乙酸銨緩沖液—甲醇(體積比40∶60)；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm。

1.3.5回收率及隔日試驗(yàn)在牛奶陰性樣品中加入不同體積的青霉素及青霉素噻唑酸(由步驟1.3.2配制所得)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中青霉素及青霉素噻唑酸含量分別為10，20，40 ng/mL，按照1.3.3的方法測(cè)定其含量，并計(jì)算回收率。將待測(cè)樣液常溫放置過(guò)夜，第2天再次測(cè)定其含量，計(jì)算回收率。

1.3.6樣液pH值對(duì)離子液體萃取效果的影響分別用0.05 mol/L pH值為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的乙酸銨緩沖液，配制1 μg/mL的青霉素和青霉素噻唑酸溶液，取1 mL經(jīng)離子液體萃取后，進(jìn)入液相色譜儀測(cè)定。

1.3.7標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程、相關(guān)性系數(shù)、線性范圍、最低檢出限及精密度試驗(yàn)取50～50 000 ng/mL不同濃度的青霉素和青霉素噻唑酸溶液進(jìn)行分析，以液相色譜的峰面積對(duì)目標(biāo)物濃度求得回歸方程；以3倍信噪比為最低檢出限；取10份陰性樣品做青霉素和青霉素噻唑酸的藥物添加，按1.3.3的方法處理、測(cè)定，測(cè)得兩種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.8方法應(yīng)用在10組陰性樣品中，人為隨機(jī)添加青霉素和β-內(nèi)酰胺酶，放置1 d后，分別用杯碟法[2]、液相質(zhì)譜法[12]、離子液體萃取法檢測(cè)。

2　結(jié)果與討論

2.1離子液體對(duì)青霉素和青霉素噻唑酸的萃取效果

陰性樣品、陰性樣品中添加青霉素及青霉素噻唑酸的加標(biāo)樣品按照1.3.4的方法處理，經(jīng)液相色譜儀檢測(cè)，得到相應(yīng)的色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1(a)可知，離子液體從樣品中萃取的非目標(biāo)物，并沒(méi)有在青霉素和青霉素噻唑酸的保留時(shí)間范圍內(nèi)出峰，說(shuō)明在該試驗(yàn)條件下離子液體萃取的非目標(biāo)物及離子液體本身對(duì)青霉素和青霉素噻唑酸的色譜峰沒(méi)有產(chǎn)生影響。對(duì)比圖1(b)和(c)可知，青霉素出峰時(shí)間約為2.9 min，青霉素噻唑酸出峰時(shí)間約為2.2 min，青霉素和青霉素噻唑酸峰型對(duì)稱(chēng)，有良好的分離度，說(shuō)明該色譜條件能完全滿足青霉素和青霉素噻唑酸的檢測(cè)。

圖1　青霉素和青霉素噻唑酸液相色譜圖

2.2回收率及隔日試驗(yàn)

以藥物添加回收率評(píng)價(jià)離子液體萃取效果，以日內(nèi)結(jié)果與日間結(jié)果的對(duì)比，評(píng)價(jià)青霉素及青霉素噻唑酸在離子液體中的穩(wěn)定性，見(jiàn)表1。由表1可知，青霉素回收率為87.4%～92.6%，和文獻(xiàn)[18]20-23中所報(bào)道的85.5%～96.0%相似；青霉素噻唑酸回收率為83.5%～90.8%，而文獻(xiàn)[9]34-35中所用的常規(guī)液相方法，青霉素噻唑酸回收率僅為76.4%～81.3%。說(shuō)明離子液體對(duì)青霉素和青霉素噻唑酸有良好的富集作用和萃取效果。而且日內(nèi)結(jié)果和日間結(jié)果差異不大，RSD值小于5%。說(shuō)明青霉素和青霉素噻唑酸在離子液體中較穩(wěn)定。

2.3樣品溶液pH值對(duì)離子液體萃取的影響

每種pH值做5份平行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，青霉素和青霉素噻唑酸溶液的pH值在3～4時(shí)，離子液體

表1　青霉素及青霉素噻唑酸藥物添加回收率

圖2　pH值對(duì)萃取效果的影響

對(duì)目標(biāo)物的萃取效率最高；pH值在5～7時(shí)，離子液體對(duì)目標(biāo)物的萃取效率有所降低；pH值在7～10時(shí)，離子液體對(duì)目標(biāo)物的萃取效率大幅降低。因?yàn)闃悠啡芤褐械那嗝顾睾颓嗝顾剜邕蛩嵩趬A性條件下會(huì)轉(zhuǎn)化為青霉素鹽和青霉素噻唑酸鹽，而離子液體對(duì)鹽的吸附能力非常微弱。所以樣品應(yīng)該用pH為3～4的緩沖液進(jìn)行稀釋。

2.4標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程、相關(guān)性系數(shù)、線性范圍、最低檢出限及精密度

以線性范圍評(píng)價(jià)該方法的檢測(cè)濃度范圍，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)價(jià)精密度和穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，該方法線性范圍寬，適合不同濃度樣品的分析。樣品前處理方法采用濃縮10倍的形式，當(dāng)青霉素和青霉素噻唑酸最低響應(yīng)濃度分別為46，49 ng/mL時(shí)，方法檢出限分別為4.6(≈5)，4.9(≈5) ng/mL。較林楠[9]37-38所使用的常規(guī)液相方法檢出限20 ng/mL更低。而青霉素和青霉素噻唑酸的RSD值均于3%，說(shuō)明該方法符合檢驗(yàn)的要求。

2.5方法應(yīng)用

經(jīng)微生物法[2]檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶完成的樣品10組，其中2組為含有β-內(nèi)酰胺酶的陽(yáng)性樣品，再經(jīng)液相質(zhì)譜[12]確認(rèn)，除含有β-內(nèi)酰胺酶的陽(yáng)性樣品外，其余9組仍有1組含有青霉噻唑酸，1組含有青霉素。

對(duì)上述10組用1.3.3的方法處理、測(cè)定。其中6組未檢出青霉素和青霉素噻唑酸，4組含有青霉素或青霉素噻唑酸，檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。由于β-內(nèi)酰胺酶在產(chǎn)品加工過(guò)程中可能分解、變質(zhì)，所以用杯碟法判斷是否含有β-內(nèi)酰胺酶，很容易產(chǎn)生假陰性的結(jié)果。所以本方法能更準(zhǔn)確地判斷樣品是否為真正的“無(wú)抗奶”。而按照文獻(xiàn)[12]液相質(zhì)譜法，儀器設(shè)備需要高額成本，樣品前處理過(guò)程需要經(jīng)固相萃取小柱凈化，操作復(fù)雜，造成試驗(yàn)方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大(3.02%～9.81%)。所以離子液體萃取，液相色譜檢測(cè)的方法結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，同時(shí)操作更方便快捷。

表2　線性回歸方程、相關(guān)性系數(shù)、線性范圍、檢出限及精密度數(shù)據(jù)

表3　該方法在實(shí)際樣品中的應(yīng)用?

?+表示含有該成分；-表示不含有該成分；小括號(hào)中的數(shù)據(jù)為該物質(zhì)的含量。

3　結(jié)論

離子液體[C8MIM][PF6]在pH為3～4時(shí)，對(duì)乳品中青霉素及青霉素噻唑酸的富集能力強(qiáng)。且富集效果穩(wěn)定。富集后的青霉素及青霉素噻唑酸在本條件下能夠得到很好的分離度，凈化效果良好。整個(gè)試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便快捷?？朔顺Ｒ?guī)液相色譜法中操作繁瑣，靈敏度低的缺點(diǎn)。同時(shí)該方法回收率、精密度良好，準(zhǔn)確度高，重顯性好。克服的微生物法假陰性率高，重現(xiàn)性不好的缺點(diǎn)。在實(shí)際樣品中應(yīng)用良好，為真正的“無(wú)抗奶”檢測(cè)探索了一個(gè)很好的方法。在該方法的基礎(chǔ)上可以選擇更優(yōu)的萃取條件和色譜條件，同時(shí)測(cè)定更多的抗生素。

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Application of ionic liquids in the detection of antibiotic negative milk

ZHOU Xin-kui1,2HONGXia1,2QIANYing-wen1,2DENGLi-juan1,2WANGJie-bin1,2GAOZhi-ying1,2HEHai-ning1,2LIUQi1,2

(1.GansuInstituteofBusinessandTechnology,Lanzhou,Gansu730010,China;2.GansuZhongshangFoodQualityTestandDetectionCo.,Ltd.,Lanzhou,Gansu730010,China)

Hydrophobic ionic liquid 1-octyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate [(C8MIM) (PF6)] was synthesized using metathesis method, and then the ionic liquid was purified by activated carbon and macroporous resin solid phase extraction column, to get a colorless, transparent product [(C8MIM) (PF6)] with a yield of 87.6%. The ionic liquids was used to extract penicillin and penicillin-thiazole acid hydrolysates in milk and dairy products, and its extracting condition was optimized. After that the content of penicillin and penicillin thiazole acid were detected by utilizing self-developed HPLC method, and it could be indirectly determined whether the milk and dairy products were true antibiotic negative milk. In this study, the recovery rate of penicillin by ionic liquid extraction method was 87.9%～92.6%, with RSD 1.8%, and the detection limit was 5 ng/mL. Moreover, the recovery rate of penicillin thiazole acid was found to be 83.5%～90.8%, with RSD 2.4%, and the detection limit was also 5 ng/mL. Compared with both plate and liquid chromatography mass spectrometry methods, our method here is more predominant.

ionic liquid; penicillin; penicillin-thiazole acid hydrolysates; HPLC; milk and dairy products

甘肅省科技計(jì)劃資助(編號(hào)：1504WKCA094，1309RTSA025，1009FTGA018，1505JTCA017)

周鑫魁，男，甘肅省商業(yè)科技研究所工程師，碩士。

洪霞(1966-)，女，甘肅省商業(yè)科技研究所高級(jí)工程師，碩士。E-mail：lzhongxia@126.com

2015—12—14

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.015