硒砂瓜連作地微生物群落變化及一株優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌的分離鑒定

岳思君，李海榮，武珍珍，鄭 蕊，周 娟，蘇建宇

（1.西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 銀川 750021；2.寧夏民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院 寧夏吳忠 751100）

砂田是在土地表面覆蓋厚度為7～20cm不同粒徑的礫石、砂或卵石后形成的特殊類(lèi)型的土地，壓砂種植是中國(guó)西北干旱、半干旱地區(qū)的農(nóng)民經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期耕作實(shí)踐形成的一種抗旱、抗風(fēng)蝕的耕作方式，有增溫、蓄水、保墑等作用[1-2]。中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)位于寧夏中部干旱帶，其環(huán)香山地區(qū)占全市面積的1/3。該地區(qū)干旱少雨，年降水量?jī)H為189.5 mm，蒸發(fā)量卻為2 400 mm，沙礫遍地，晝夜溫差大，自然條件惡劣[3]。2004年以來(lái)，當(dāng)?shù)卣鶕?jù)本地的氣候及種植條件，采用壓砂種瓜這一節(jié)水保墑的旱作農(nóng)業(yè)種植模式。壓砂瓜種植規(guī)模迅速擴(kuò)大集中在中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)、中寧縣和海原縣。到2012年壓砂瓜種植面積連續(xù)5年穩(wěn)定在6.67萬(wàn)hm2以上，已形成了壓砂瓜產(chǎn)業(yè)區(qū)域化、規(guī)模化發(fā)展格局[4-5]。壓砂西瓜中含有0.005 6 mg·kg-1硒元素，有延年益壽、抗衰老、抗癌的作用，獨(dú)具保健價(jià)值，因而得名為硒砂瓜[6]。用傳統(tǒng)壓砂抗旱法種植的硒砂瓜，以其品質(zhì)好、無(wú)污染而備受客商和消費(fèi)者青睞。

硒砂瓜主要種植模式為連作地種植，由于盲目施用農(nóng)藥和化肥，造成土壤生態(tài)環(huán)境惡化，硒砂瓜產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣，連作障礙嚴(yán)重，不僅嚴(yán)重影響了硒砂瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和食品安全，而且威脅著消費(fèi)者的健康。因此創(chuàng)造一個(gè)有利于生產(chǎn)的環(huán)境已成為一個(gè)急需解決的問(wèn)題。連作障礙發(fā)生與土壤傳染性病害、土壤理化性狀劣變以及由根系分泌物和殘茬分解物等引起的自毒作用等有關(guān)，而這些因子均不同程度與土壤中的微生物有關(guān)[7-9]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為連作引起土壤微生物區(qū)系發(fā)生了較大的變化，土壤微生物是連作障礙的主要因子之一，其群落結(jié)構(gòu)組成及其變化在一定程度上反映了土壤的質(zhì)量及其健全性[10-12]。為尋求安全有效的防治措施，生物防治越來(lái)越引起人們的關(guān)注。本文以不同連作年限的硒砂瓜種植區(qū)土壤微生物作為研究對(duì)象，了解硒砂瓜連作地微生物種類(lèi)和數(shù)量變化規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，對(duì)1株芽孢桿菌做了分類(lèi)鑒定，以期用于連作障礙的生物防治。通過(guò)調(diào)節(jié)土壤的環(huán)境條件和改善它的微生物區(qū)系，從而發(fā)揮有益微生物的作用，降低有害微生物對(duì)土壤的影響，促進(jìn)土壤培肥，為解決硒砂瓜產(chǎn)業(yè)種植過(guò)程中出現(xiàn)的連作障礙問(wèn)題以及構(gòu)建硒砂瓜可持續(xù)發(fā)展的技術(shù)體系提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

土樣取自寧夏中衛(wèi)市興仁鄉(xiāng)硒砂瓜種植區(qū)，依據(jù)瓜田連作年限不同，將連作瓜田劃分為連作1a、3a、5a、7 a和10 a共5個(gè)等級(jí)分別取樣。采用5點(diǎn)取樣法來(lái)，采集15cm左右土層的土壤，每個(gè)樣點(diǎn)取0.5 kg左右土樣，裝入密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 微生物分離方法

分別取不同年限的待測(cè)硒砂瓜土壤樣品1g，放入盛有9 mL蒸餾水的滅菌試管內(nèi)，將試管放入搖床內(nèi)經(jīng)過(guò)充分振搖，制成1∶10的均勻稀釋液。按照10倍稀釋法依次制成不同濃度梯度的稀釋液。以涂布平板法計(jì)數(shù)，取稀釋度為 1×103～1×105土壤懸浮液各100μL，分別接種于滅菌后的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基和高氏一號(hào)培養(yǎng)基。每個(gè)濃度3次重復(fù)，細(xì)菌培養(yǎng)恒溫28℃培養(yǎng)3d，真菌培養(yǎng)恒溫25℃培養(yǎng)5d，放線(xiàn)菌28℃下培養(yǎng)7d后計(jì)數(shù)，結(jié)果以每g干土所含數(shù)量表示。選取每皿菌落數(shù)為15～150的稀釋度統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，按下列公式計(jì)算菌落數(shù)量：菌落數(shù)量/（cfu·g-1）=（菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)）/干土質(zhì)量。

1.3 細(xì)菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征

將優(yōu)勢(shì)細(xì)菌接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng),觀(guān)察18～24 h的菌落形態(tài)。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色,并觀(guān)察菌體形態(tài)。

1.4 細(xì)菌的生理生化特性測(cè)定

采用生物梅里埃（biomerieux）Vitek32-BCL鑒定卡片進(jìn)行數(shù)值法鑒定。

1.5 16SrDNA的PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定

提取細(xì)菌DNA，然后采用通用引物27f/1492r通過(guò)PCR擴(kuò)增16SrDNA序列[11]。引物序列為27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492r：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR 反應(yīng)體系（25μL）：2×TaqPCR Master Mix 12.5μL，27f（10 mol·L-1）0.5μL，1492r（10 mol·L-1）0.5μL，DNA 1μL，ddH2O 補(bǔ)至 25μL。PCR 反應(yīng)程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，選取陽(yáng)性克隆測(cè)序，測(cè)序由上海生工基因公司完成。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上用BLAST軟件與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒砂瓜不同年限連作土壤微生物群落變化規(guī)律

因?yàn)椴煌B作年限硒砂瓜土壤的根系分泌物、殘留在土壤中的植株，以及栽培管理方法都是相同的，這樣就形成了特定的連作硒砂瓜土壤微生物區(qū)系。隨著連作年限的增加，真菌的數(shù)量逐漸增加，而細(xì)菌和放線(xiàn)菌大量減少（表1）。可以看出，在連作3 a后，土壤中的真菌數(shù)量比1年土壤增加了39.13%；連作5 a，土壤中真菌數(shù)量比1年土壤增加了65.21%；連作10 a土壤中真菌數(shù)量較1 a土壤增加了130.43%。對(duì)于放線(xiàn)菌，連作3 a，土壤中的放線(xiàn)菌數(shù)量較1 a土壤減少了35.56%，連作7 a就會(huì)減少50%以上。對(duì)于細(xì)菌，連作3 a，較1 a土壤減少了16.67%；連作7 a，就會(huì)較1 a土壤來(lái)說(shuō)減少48.15%；連作10 a較1 a土壤來(lái)說(shuō)減少了66.67%。上述結(jié)果表明，土壤微生物內(nèi)，各個(gè)類(lèi)群之間的平衡發(fā)生了非常大的改變。1 a土壤中的細(xì)菌與真菌的比值為235，而連作3 a，其比值就減小到了141。由此可見(jiàn)，連作會(huì)使土壤由細(xì)菌型轉(zhuǎn)向真菌型，最終導(dǎo)致地力衰竭，硒砂瓜生長(zhǎng)不良，植株矮小，產(chǎn)量也會(huì)受到極大的影響。

表1 硒砂瓜不同年限土壤微生物區(qū)系

圖1 NB1菌落形態(tài)

2.2 NB1菌落形態(tài)及顯微鏡觀(guān)察

NB1細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)以后，其菌落形態(tài)如圖1所示，菌株呈不規(guī)則的圓形，不透明，表面干燥，菌落表面有褶皺，邊緣不整齊。NB1菌株的革蘭氏染色結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示，該細(xì)菌染色后顏色為紫色，形態(tài)呈桿狀，故初步判定菌株NB1為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），為典型的芽孢桿菌。

2.3 NB1菌株的生理生化鑒定

對(duì)NB1菌進(jìn)行生理生化鑒定（表2），檢測(cè)結(jié)果表明該細(xì)菌與枯草芽孢桿菌的相似性為87%，判斷其為枯草芽孢桿菌。

圖2 NB1革蘭氏染色（10×100倍）

表2 法國(guó)梅里埃VITEK-2型全自動(dòng)微生物鑒定分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果

2.4 NB1菌株的分子鑒定

2.4.1 NB1菌株的16SrDNA基因序列測(cè)定 利用細(xì)菌基因組提取試劑盒，提取NB1菌株的基因組DNA。經(jīng)過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)DNA的純度和片段大小，細(xì)菌的總長(zhǎng)度為15 kb左右，結(jié)果如圖3所示。

圖3 NB1菌基因組DNA電泳結(jié)果

2.4.2 NB1菌株16SrDNA全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增 利用細(xì)菌通用引物，擴(kuò)增NB1菌株16SrDNA全長(zhǎng)，擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增長(zhǎng)度大概在1 500 bp左右（圖4）。

圖4 NB1菌株P(guān)CR擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.4.3 NB1菌株16SrDNA序列相似性比較 通過(guò)DNAMAN軟件分別將NB1菌株序列和其相似的各個(gè)序列進(jìn)行多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)NB1菌株序列與Bacillus subtilis strian MX-1、Bacillus subtilis strainsubsp.stain DDKRC2和Bacillus licheniformis strain Dou6的16SrDNA序列的相似性均達(dá)到99%。因此依據(jù)16SrDNA序列同源性，并結(jié)合菌株的形態(tài)、生理生化特征等綜合分析，最終將該菌株確定為枯草芽孢桿菌。

3 討 論

關(guān)于連作障礙形成及加劇的原因是比較復(fù)雜的，導(dǎo)致其發(fā)生的因素較多且又相互影響，是植物-土壤系統(tǒng)內(nèi)多種因子綜合作用的結(jié)果。研究認(rèn)為作物連作后，微生物種群受到嚴(yán)重破壞，主要微生物數(shù)量和土壤酶活性不同程度的下降[13-14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同連作年限下，土壤中三大微生物類(lèi)群的組成比例大體一致，即細(xì)菌最多，放線(xiàn)菌次之，真菌最少。硒砂瓜連作土壤由于同一類(lèi)根系分泌物持續(xù)釋放，形成了特定土壤環(huán)境和根際條件，導(dǎo)致土壤微生物種類(lèi)與數(shù)量變化,即細(xì)菌、放線(xiàn)菌數(shù)量下降，真菌數(shù)量升高，微生物區(qū)系從細(xì)菌型土壤向真菌型土壤轉(zhuǎn)化。一般認(rèn)為真菌型土壤是地力衰竭的標(biāo)志，真菌數(shù)量增加，意味著病害加重[2]。

利用微生物進(jìn)行土壤生態(tài)修復(fù)、改變土壤微生物種群結(jié)構(gòu)、重建土壤微生物系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡，已成為克服土壤連作障礙的重要手段，越來(lái)越引起重視。芽孢桿菌屬是革蘭氏陽(yáng)性菌，能產(chǎn)生耐熱、耐旱、耐有機(jī)溶劑和抗紫外線(xiàn)的內(nèi)生芽孢。除了具有與其他生防菌相似的優(yōu)勢(shì)外，因能產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)的芽孢因而極易在逆境條件下生存。芽孢桿菌類(lèi)的生防菌劑也廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的植物病蟲(chóng)害防治?？莶菅挎邨U菌是一種研究較多的生防菌，其能夠產(chǎn)生伊枯草菌素等抗生素類(lèi)物質(zhì)抑制植物致病真菌的生長(zhǎng)[15-16]，而且枯草芽孢桿菌在施入植物根圍后，能在植物的根際表面形成一層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的致密菌膜以防止致病菌的入侵[17]。關(guān)于枯草芽孢桿菌對(duì)植物致病菌防治方面的研究很多，芽孢桿菌類(lèi)生防菌對(duì)絲核菌以及尖孢鐮刀菌有極強(qiáng)的抑制作用并且對(duì)由這些致病菌引起的番茄、馬鈴薯、黃瓜等作物的枯萎病有一定的防治效果。一些研究者還發(fā)現(xiàn)，由于其具有產(chǎn)生抗生素的特性，也可以用于采摘后水果的保鮮[18]。筆者通過(guò)對(duì)硒砂瓜連作地中分離出的一株優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌NB1菌株的鑒定，為進(jìn)一步探究其對(duì)硒砂瓜連作地的影響、改善土壤菌群結(jié)構(gòu)、提高硒砂瓜產(chǎn)量提供優(yōu)良菌種。

4 結(jié)論

從不同連作年限的寧夏硒砂瓜種植區(qū)采集土樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果表明，土壤微生物區(qū)系發(fā)生了較大的變化，隨著連作年限的增加，真菌的數(shù)量逐漸增加，而細(xì)菌和放線(xiàn)菌大量減少，連作會(huì)使土壤微生物由細(xì)菌型轉(zhuǎn)向真菌型。

硒砂瓜連作地中分離得到1株優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌NB1，通過(guò)形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)結(jié)合16SrDNA基因序列分析，初步鑒定NB1菌株為枯草芽孢桿菌。為進(jìn)一步研究其拮抗性能和對(duì)連作地土壤效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。